专利名称：拟穴青蟹胰蛋白酶基因cDNA序列及其克隆方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属拟穴青蟹的基因编码及其克隆和应用领域，特别是涉及一种拟穴青蟹胰 蛋白酶基因CDNA序列及其克隆方法和应用。
背景技术：
甲壳动物生长发育总是与蜕壳联系在一起的。蜕壳的整个过程包括蜕去旧甲壳， 个体由于吸水迅速增大，然后新甲壳形成并硬化。因此甲壳动物的个体增长在外形上并不 连续，呈阶梯形，每蜕一次壳，上一个台阶。蜕壳周期可分为蜕壳、蜕壳后、蜕壳间和蜕壳前。 对于甲壳动物，根据Drach和Tchemigovtzef的标准可把蜕壳周期进一步划分为Ε、A、B、 C(C1-C4)、D (Dtl-D4) 5个时相。青蟹的生长也是不连续的，蜕壳是其生长的标志。在青蟹的生命活动中，包括形态的改变、个体的增大、发育与成熟、断肢的再生、体 表附着物和某些病变的剔除等，都是经过不断的蜕皮和蜕壳而完成的。蜕皮与蜕壳，既是外 部形态的变化，又是内部错综复杂的生理活动。这种生理作用，对生长发育非常重要。影响蜕壳的环境因子较多，如温度、盐度、pH值、光照期、生存空间等等，饵料、维生 素C等均可影响蜕壳过程。其中摄食量的大小对于蜕壳的物质准备至关重要。在青蟹人工种苗的繁育过程中，饵料投喂量的控制是一个关键的因素。饵料量不 够会导致种苗生长期延长，不仅影响正常的蜕壳活动，而且容易增加种苗相互间的残杀率。 饵料量过多则不仅浪费饵料，更不利的是容易败坏水质，从而制约种苗的成活率。因此，准 确预测投饵量对于青蟹种苗的繁育非常重要，目前采用的方法主要还是人工目测饵料的剩 余量以及经验推断。胰蛋白酶是动物消化道中一种主要的碱性蛋白水解酶，属于丝氨酸蛋白酶家族， 专一性水解赖氨酸与精氨酸羧基形成的肽键，其主要功能一是消化蛋白质食物，二是激活 所有胰腺分泌的酶原，可以迅速有力地激活其他蛋白酶原(糜蛋白酶原、羧肽酶原、弹性蛋 白酶原)而行使消化功能。因此胰蛋白酶基因的表达水平与动物的消化水平和摄食能力密 切相关。到目前为止，还未见根据青蟹胰蛋白酶基因的表达水平来预估投饵数量，并预测 青蟹蜕壳周期的相关报道
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种拟穴青蟹胰蛋白酶基因cDNA序列及其克 隆方法和应用，该拟穴青蟹胰蛋白酶基因cDNA序列能够预测青蟹种苗繁育过程中的投饵 量以及蜕壳周期，以满足人们对青蟹生活周期的掌握以及遗传育种中的选用，减少饵料消 耗量，提高种苗成活率，从而优化育苗过程。本发明的一种拟穴青蟹胰蛋白酶基因cDNA序列，如SEQ ID NO=I所示；a.序列特征长度881bp;
类型核酸；链型双链；拓扑结构线性；b.分子类型cDNAc.假设否；d.反义否;e.最初来源拟穴青蟹(Scylla paramamosain)。所述的拟穴青蟹胰蛋白酶基因cDNA序列长度为881bp，其中开放阅读框位于25-804位核苷酸(780个核苷酸)；根据重复试验所获得的序列与所述的SEQ ID NO. 1中从核苷酸第25-804位的核 苷酸序列具有70%以上的同源性，或者与SEQ ID NO. 1中从核苷酸第25-804位的核苷酸序 列杂交(由于考虑到重复实验新克隆出的序列与SEQ ID NO. 1的序列会有些许不同)；所述的序列具有如SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列的多肽、其保守性变异多肽、其 活性片段或其活性衍生物(包括金属取代物，脂肪酸酞化物，高级醇醋化物或烷基胺化物 等)；所述的SEQ ID NO :2氨基酸序列，根据全程cDNA推导出拟穴青蟹胰蛋白酶共259 个氨基酸残基，分子量为28. 15KDa，等电点pi为4. 49 ；所述的cDNA分子中包含8-100个连续核苷酸；所述的cDNA分子转化的宿主细胞，它是真核细胞。本发明的一种拟穴青蟹胰蛋白酶基因cDNA序列的克隆，包括(1)从拟穴青蟹的肝胰腺提取总RNA ；(2)根据提取得到的RNA，构建cDNA质粒文库；(3) cDNA文库的鉴定和测序；(4)根据BLAST对比，获得如SEQ ID NO 1所示的序列。本发明的一种拟穴青蟹胰蛋白酶基因cDNA序列在预测青蟹种苗饵料投喂量及蜕 壳周期中的应用。有益效果本发明提供的拟穴青蟹胰蛋白酶基因cDNA序列，能够预测青蟹种苗繁育过程中 的投饵量以及蜕壳周期，以满足人们对青蟹生活周期的掌握以及遗传育种中的选用，减少 饵料消耗量，提高种苗成活率，从而优化育苗过程。
图1为青蟹胰蛋白酶基因全长扩增图谱。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人 员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。
实施例1拟穴青蟹胰蛋白酶基因的克隆(I)RNA 的分离(RNA isolation)取拟穴青蟹的肝胰腺，加液氮，用研钵研碎，加入盛有Trizol裂解液的1. 5mL EP 管，充分振荡，抽提总RNA(TRIzol Reagents，TaKaRa)，用甲醛变形胶电泳鉴定总RNA质量， 然后再分光光度计上测定RNA含量；步骤如下1.勻浆处理(Homogenization) 将10_30mg组织加入Iml TRIzol，用电动勻浆器或者一次性研磨杵充分勻浆；2. j^B (Phase Separation)a.勻浆后，室温放置5min，使样品充分裂解，再于4°C，12，OOOrpm离心10分钟，取
上清；b.然后加入200 μ 1氯仿，剧烈振荡混勻后室温放置3-5min，使其自然分相；3. RNA 沉淀(RNA Precipitation)a.于4°C 12，OOOrpm离心10-15min，样品会分成三层黄色的有机相，中间层和无 色的水相，RNA主要在水相中，把水相(通常可吸取550 μ 1)转移到新管中；b.取上清，加入等体积冰冷的异丙醇，室温放置10-20min，4°C 12，OOOrpm离心 IOmin,弃上清，RNA沉淀于管底；4. RNA 漂洗(RNA Wash)a. RNA沉淀中加入Iml 75%乙醇(用RNase-free水配制)，温和振荡离心管，悬浮 沉淀；b. 40C 5，000-8, OOOrpm离心l-2min，弃上清；短暂快速离心，用移液器小心吸弃上清， 注意不要吸弃沉淀，室温放置1-2分钟晾干沉淀；5.溶角军 RNA(Redissolving the RNA)沉淀中加入50-100 μ 1 RNase-free水，轻弹管壁，以充分溶解RNA，_70°C保存。(2) cDNA 文库构建1.用 oligotex 试剂盒分离 mRNA。2.双链 cDNA 的合成(Smart cDNA Library Construction kit，Clontech 公司)取0· 5 μ g mRNA,分别加入 1 μ 1 SMARTIV 引物(10 μ M，5 ‘ -AAGCAGTGGTATCAACGCA GAGTGGCCATTACGGCCGGG-3 ‘)和 CDS III 引物(10 μ M，5-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d (HN-3'，N = A、G、C、T ；N^1 = A、G、C)，加水至总体积 5μ 1，72°C变性 2min，冰浴 2min ； 在Superscrip til逆转录酶作用下，42°C 2h，合成cDNA第一链。取cDNA第一链2 μ 1，加 入80 μ 1 去离子水，10 μ 1 IOXAdvantage 2PCR Buffer, 2 μ 1 50XdNTP Mix, 4 μ 1 5' PCR Primer, 2 μ 1 50 X Advantage 2Polymerase Mix，用长距离 PCR 的方法合成 cDNA 第二条链。3. cDNA 均一化取4μ 1纯化后的cDNA加入4μ 1杂交缓冲液，加水至16μ 1，98°C变性2m in，68°C 杂交5h，加入适量DSN酶及缓冲液处理20m in,加入10 μ 1终止缓冲液完成cDNA均一化。4.均一化文库构建分别以PCR primerMl和PCR primerM2为引物，对均一化后的cDNA进行两轮PCR 扩增；取1 μ g纯化过的cDNA用SfiI核酸内切酶酶切2h后割胶纯化大于500bp的cDNA片段；回收的片段与经过SfiI核酸内切酶处理过的PDNR2L IB文库载体连接过夜；连接产物直接转化大肠杆菌感受态细胞，制成原始文库。(3) cDNA文库的鉴定及测序分析1.文库库容测定及质量鉴定取适量原始文库用LB液体培养基进行10_3，10_6梯度稀释，每个梯度设3个平行， 取0. Iml稀释液于90mm培养皿中涂布，37°C培养过夜，计数培养皿中克隆数目以计算出文 库库容；随机挑选96个单克隆，以M13通用引物PCR扩增，电泳检测插入片段大小。2.测序分析对构建的cDNA文库进行测序，于BLAST程序中，根据与已知的胰蛋白酶基因(远海梭子蟹 Portunus pelagicus,凡纳滨对虫下 Penaeus vannamei,中国对虫下 Fenneropenaeus chinensis等)相比，挑选具有高度同源性的基因，初步认定它是拟穴青蟹胰蛋白酶基因；再将拟穴青蟹胰蛋白酶基因的全长cDNA序列及编码蛋白用BLAST程序在 Non-redundant GenBank nucleotides禾口Non-redundant GenBank proteins 数据库进行核 苷酸和蛋白质同源性检索，结果发现它与远海梭子蟹(Portimus pelagicus)的胰蛋白酶基 因在核苷酸水平上具有86%的一致性；与远海梭子蟹(Portimus pelagicus)的胰蛋白酶 在氨基酸水平上具有88%的一致性，故可以认为SEQ ID NO. 1的序列是拟穴青蟹的胰蛋白 酶基因序列。本发明新的胰蛋白酶基因全长cDNA的长度为881bp，详细序列见SEQ ID N0. 1，其 中开放阅读框位于25-804位核苷酸(780个核苷酸)；根据全程cDNA推导出拟穴青蟹胰蛋白酶共259个氨基酸残基，分子量为 28. 15KDa，等电点(pi)为 4. 49，详细序列见 SEQ ID N0. 2。实施例2拟穴青蟹胰蛋白酶基因的荧光定量PCR检测在预测青蟹种苗饵料投喂量及蜕壳周期中的应用(1)总 RNA 提取取各个潘状幼体时期的青蟹个体，加液氮，用研钵研碎，加入盛有裂解液的1.5mL EP管，充分振荡，抽提总RNA (TRIzol Reagents, TaKaRa)，用甲醛变形胶电泳鉴定总RNA质 量，然后再分光光度计上测定RNA含量；(2)荧光定量PCR实验按照TaKaRa 公司的 SYBR ExScript TM RT-PCR Kit (Perfect Real Time)的说 明进行，反转录的条件为42°C反应15分钟，95°C反应2分钟；取提取的拟穴青蟹各个潘状幼体时期的样品反转录的cDNA，取2μ 1用EASY Dilution(TaKaRa Code :D9160，Shiga, Japan)分别稀释 IOiUO2UO3UO4,IO5UO6 倍作 为模板制作标准曲线，以 SpTryp-RT-F :5，-GGAATTGTGCAGGCTGTGG-3，和 SpTryp-RT-R 5，-ACGAAGAATCAAAGTAGGGATGGA-3，为引物，取稀释100倍的模板为对象进行样品测定；在ABI公司St印OnePlus V2. 0仪器上进行PCR反应，反应条件为95 "C10 秒 融解曲解条件95"C 15 秒60 "C 1 分钟60"C 每隔 10 秒升 0.3°C反应结束后，将胰蛋白酶基因的Ct值代入标准曲线，换算出各自的起始模板量。 实验中以ISSrRNA基因作为参比基因。将胰蛋白酶基因的计算所得的模板量除以同一个样 品中的ISSrRNA基因模板量，即是胰蛋白酶基因的相对表达水平。用胰蛋白酶基因的相对表达水平的结果来代表青蟹该时期的消化能力，可以比较 各个时期投饵量的相对数量，从而预测该时期的投饵量的需求。在青蟹各个潘状幼体期间，发现胰蛋白酶的表达水平有各自的变动规律，从而可 以通过检测即时的胰蛋白酶的表达来预测该时期处于蜕壳周期的哪一个阶段。SEQUENCE LISTING<110>中国水产科学研究院东海水产研究所<120>拟穴青蟹胰蛋白酶基因cDNA序列及其克隆方法和应用<160>4<170>PatentIn version 3. 3<210>1<211>881<212>cDNA<213> 拟穴青蟹(Scylla paramamosain)<400>1gactcgtatc catcctgggc agtcatgaag accctcgtgc tgtgcctgct tgttgccggg 60gccttagccg ccccatcccg caagcccacc ttccgtcggg gactgaacag gattgttggc 120ggtgaggaca cagttcacgg cgaatttcag taccaactta gccttcaaga tacgtcgtac 180agcaatccat ggcacttctg cggtggtacc ctgtacaatg agcactgggg catcactgct 240tgtcactgtc tgcagtatga tgtggataat ccaggaattg tgcaggctgt ggctggtgaa 300tacactcttg aggcaaatga cggttccgag caggcagcaa gactggatga gatcatcctc 360catccctact ttgattcttc gttactcgtt aacgacgtcg ccctcattca ctttccgcaa 420acaatggttt atgacgatta cgttaatccc atcggtcttc aagaagaaaa agagcttgta 480ggcgtcgagt gcaccgtcac gggatgggga gctttgtcag agggagggag tgccgccaca 540gtcttgcaga aggttcatgt ccctactgtg tccgatgagg aatgtagaat atcttactac 600ggtattgaag attccatgat ctgtgctgga tatcccgagg gaggaaagga cgcctgccag 660ggtgactctg gtggacctat ggtgtgcaag ggatacctta ccggcatcgt gtcctggggc 720tacggctgtg ctcgccccaa ctacccgggg gtctacacgg aggtggccta ctttgtggat 780tggattattg ccaatgctgt ataaattgta ccattgatat gatcaaaaca tggcacatca 840aattaaatac aatatggtgg tcgaaaaaaa aaaaaaaaaa a881<210>2
<211>259<212>PRT<213> 拟穴青蟹(Scylla paramamosain)<400>2 Met Lys Thr Leu Val Leu Cys Leu Leu Val Ala Gly Ala Leu Ala151015Ala Pro Ser Arg LysPro Thr Phe Arg Arg GlyLeu Asn Arg lie202530Val Gly Gly Glu AspThr Val His Gly Glu PheGln Tyr Gln Leu354045Ser Leu Gln Asp ThrSer Tyr Ser Asn Pro TrpHis Phe Cys Gly505560Gly Thr Leu Tyr AsnGlu His Trp Gly lie ThrAla Cys His Cys657075Leu Gln Tyr Asp ValAsp Asn Pro Gly lie ValGln Ala Val Ala808590Gly Glu Tyr Thr LeuGlu Ala Asn Asp Gly SerGlu Gln Ala Ala95100105Arg Leu Asp Glu lielie Leu His Pro Tyr PheAsp Ser Ser Leu110115120Leu Val Asn Asp ValAla Leu lie His Phe ProGln Thr Met Val125130135Tyr Asp Asp Tyr ValAsn Pro lie Gly Leu GlnGlu Glu Lys Glu140145150Leu Val Gly Val GluCys Thr Val Thr Gly TrpGly Ala Leu Ser155160165Glu Gly Gly Ser AlaAla Thr Val Leu Gln LysVal His Val Pro170175180Thr Val Ser Asp GluGlu Cys Arg lie Ser TyrTyr Gly lie Glu185190195Asp Ser Met lie CysAla Gly Tyr Pro Glu GlyGly Lys Asp Ala200205210Cys Gln Gly Asp SerGly Gly Pro Met Val CysLys Gly Tyr Leu215220225Thr Gly lie Val SerTrp Gly Tyr Gly Cys AlaArg Pro Asn Tyr230235240Pro Gly Val Tyr ThrGlu Val Ala Tyr Phe ValAsp Trp lie lie245250255Ala Asn Ala Val
<210>3<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><221>prim_bind<222>(1). . (19)<223>根据cDNA设计的SpTryp-RT上游引物<400>3ggaattgtgc aggctgtgg19<210>4<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><221>prim_bind<222>(1). . (24)<223>根据cDNA设计的SpTryp-RT下游引物<400>4
acgaagaatc aaagtaggga tgga 2权利要求
一种拟穴青蟹胰蛋白酶基因cDNA序列，如SEQ ID NO1所示a.序列特征长度881bp；类型核酸；链型双链；拓扑结构线性；b.分子类型cDNAc.假设否；d.反义否；e.最初来源拟穴青蟹(Scylla paramamosain)。
2.根据权利要求1所述的一种拟穴青蟹胰蛋白酶基因cDNA序列，其特征在于所述的 拟穴青蟹胰蛋白酶基因cDNA序列长度为881bp，其中开放阅读框位于25-804位核苷酸。
3.根据权利要求1所述的一种拟穴青蟹胰蛋白酶基因cDNA序列，其特征在于根据 重复试验所获得的序列与所述的SEQ ID NO. 1中从核苷酸第25-804位的核苷酸序列具有 70%以上的同源性，或者与SEQ ID NO. 1中从核苷酸第25-804位的核苷酸序列杂交。
4.根据权利要求1所述的一种拟穴青蟹胰蛋白酶基因cDNA序列，其特征在于所述的 序列具有如SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列的多肽、其保守性变异多肽、其活性片段、其金 属取代物，其脂肪酸酞化物，其高级醇醋化物或其烷基胺化物。
5.根据权利要求4所述的一种拟穴青蟹胰蛋白酶基因cDNA序列，其特征在于所述的 SEQID NO 2氨基酸序列，根据全程cDNA推导出拟穴青蟹胰蛋白酶共259个氨基酸残基，分 子量为28. 15KDa，等电点pi为4. 49。
6.根据权利要求1所述的一种拟穴青蟹胰蛋白酶基因cDNA序列，其特征在于所述的 cDNA分子中包含8-100个连续核苷酸。
7.根据权利要求1所述的一种拟穴青蟹胰蛋白酶基因cDNA序列，其特征在于所述的 cDNA分子转化的宿主细胞为真核细胞。
8.一种拟穴青蟹胰蛋白酶基因cDNA序列的克隆，包括(1)从拟穴青蟹的肝胰腺提取总RNA；(2)根据提取得到的RNA，构建cDNA质粒文库；(3)cDNA文库的鉴定和测序；(4)根据BLAST对比，获得如SEQID NO 1所示的序列。
9.一种拟穴青蟹胰蛋白酶基因cDNA序列在预测青蟹种苗饵料投喂量的应用。
10.一种拟穴青蟹胰蛋白酶基因cDNA序列在预测青蟹蜕壳周期中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种拟穴青蟹胰蛋白酶基因cDNA序列及其克隆方法和应用，拟穴青蟹胰蛋白酶基因cDNA序列具有如SEQ ID NO1所示的序列，其克隆包括从拟穴青蟹的肝胰腺提取总RNA；构建cDNA质粒文库；cDNA质粒文库鉴定和测序分析；根据BLAST对比，获得SEQ ID NO1所示的序列。本发明提供的拟穴青蟹胰蛋白酶基因cDNA序列能够预测青蟹种苗繁育过程中的投饵量以及蜕壳周期，以满足人们对青蟹生活周期的掌握以及遗传育种中的选用，减少饵料消耗量，提高种苗成活率，从而优化育苗过程。
文档编号C12N15/57GK101838659SQ20101010213
公开日2010年9月22日 申请日期2010年1月28日 优先权日2010年1月28日
发明者乔振国, 张丹, 张凤英, 皮妍, 石彦红, 蒋科技, 郑俊斌, 陶启长, 马凌波, 马春艳 申请人:中国水产科学研究院东海水产研究所