专利名称：抑制PAR-1基因表达的siRNA及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及抑制PAR-I (蛋白酶激活受体-1)基因表达的SiRNA(小分子干扰RNA) 及其应用。
背景技术：
几乎所有肝病均具有炎症坏死，而只要有炎症坏死，肝纤维化即发生。肝纤维化的 不断发展，引起肝小叶结构改建和假小叶形成，导致肝硬化；纤维组织压迫血管，引起门脉 高压和肝缺血，进而加剧肝细胞坏死和炎症，如此形成恶性循环。因此，阻断肝纤维化的发 生和发展，对防治肝硬化具有重要意义。而且我国肝病发病率是比较高的国家之一，所以寻 找有效途径抑制肝纤维化，有相当重要的意义。肝纤维化和它导致的最后阶段的肝硬化，通常是由病毒感染，过度使用损害肝脏 的药物，代谢系统疾病，和遗传因素引起的。肝纤维化的病理进程，实际上是正常的肝组织 被疤痕类似的胶原蛋白代替，导致肝功能的丧失，过去认为这个过程是一个不可逆的过程， 直到最近才认为这个过程在早期是可以挽救的。根据目前的研究，表明星状细胞在这个过 程中起了关键作用。正常的肝脏中，星状细胞大约占肝体积的1.4%，相当于每100个肝细 胞中大约有3. 6-6个星状细胞。纤维化的过程实际上是来自于门静脉和窦周的α平滑肌 细胞骨架阳性的肌纤维母细胞产生和增殖的过程。虽然这种细胞有不止一种的潜在来源， 但被研究的最为清楚的就是肝星状细胞，在它们没有被活化成α平滑肌细胞骨架阳性表 型的细胞之前，它们的主要功能是贮存维生素Α，调节维甲酸的水平。可一旦被活化后，它们 就成为肝纤维化中纤维胶原的主要来源，而且它们通过收缩和释放致炎和致纤维因子，潜 在的调节窦间隙的血流量。活化的星状细胞还能产生基质金属蛋白酶组织抑制剂，导致基 质金属蛋白酶降解肝细胞外基质的功能受损，从而使细胞外基质向胶原和纤维化转变。随着RNAi作为制药技术的成熟，已有SiRNA药物进入临床实验，siRNA药物具有 如下优点(1)、特异性强，碱基的顺序决定了它的特异性；(2)、设计便利，由于人类基因库 已经完成，这为siRNA的设计带来了极大的便利，可以说几乎没有基因不能作为siRNA的靶 标；(3)、临床研究便利，siRNA药物作为核酸类药物，不管何种siRNA都具有大致相同的药 物代谢，药物分布，药物毒性，这为进入临床研究带来了极大的便利；(4)、由于RNAi —开始 就已将特定基因作为靶标，所以siRNA分子药理学明确。
发明内容
本发明的目的在于利用RNAi (RNA干扰)技术，对候选的靶标基因进行效用、量效 关系及特异性的评定，以提供能够抑制PAR-I (蛋白酶激活受体-1)基因表达的siRNA(小 分子干扰RNA)，并进一步地提供该siRNA在临床上的应用。按照本发明提供的技术方案，所述siRNA为下述PAR-1-01 PAR-1-08中的任意 一种，PAR-1-01 PAR-1-08 分别为PAR-1-01 [0008正义链序列SEQIDNO.1为5'-AGGGCAGUCUACUUAAAUA-3‘[0009反义链序列SEQIDNO.2为5，-UAUUUAAGUAGACUGCCCU-3 ’[0010PAR-1-02 [0011正义链序列SEQIDNO.3为5'-CGGCC⑶GGUGUACAUGCU-3‘[0012反义链序列SEQIDNO.4为5'-AGCAUGUACACCACGGCCG-3 ‘[0013PAR-1-03 [0014正义链序列SEQIDNO.5为5'-CCUUCAAGAUCAGCUACUA-3‘[0015反义链序列SEQIDNO.6为5'-UAGUAGCUGAUCUUGAAGG-3‘[0016PAR-1-04 [0017正义链序列SEQIDNO.7为5'-ACAUGUACGCCUCCAUCAU-3‘[0018反义链序列SEQIDNO.8为5'-AUGAUGGAGGCGUACAU⑶-3‘[0019PAR-1-05 [0020正义链序列SEQIDNO.9为5'-GCAUCUUCAUC⑶CUGCUU-3‘[0021反义链序列SEQIDNO.10 为 5'-AAGCAGACGAUGAAGAUGC-3‘[0022PAR-1-06 [0023正义链序列SEQIDNO.11 为 5'-CCACCAAC⑶CCUCCUGAU-3‘[0024反义链序列SEQIDNO.12 为 5'-AUCAGGAGGAC⑶UG⑶GG-3‘[0025PAR-1-07 [0026正义链序列SEQIDNO.13 为 5'-GCAGGGCAGUCUACUUAAA-3‘[0027反义链序列SEQIDNO.14 为 5'-UUUAAGUAGACUGCCCUGC-3‘[0028PAR-1-08 [0029正义链序列SEQIDNO.15 为 5'-GCUCUAGCCACCUGAAUAA-3‘[0030反义链序列SEQIDNO.16 为 5'-UUAUUCAGGUGGCUAGAGC-3‘[0031上述的各siRNA序列的3‘端垂悬两个dTdT，该垂悬不与mRNA序列互补，使正义链3'端更容易解链，从而增加其沉默效率。[0032上述的各siRNA序列可用于制备治疗肝纤维化的药物。[0033siRNA是RNAi途径中的中间产物，是RNAi发挥效应所必需的因子。siRNA的形
成主要由Dicer和Rde-I调控完成。由于RNA病毒入侵、转座子转录、基因组中反向重复 序列转录等原因，细胞中出现了 dsRNA，Rde-I (RNAi缺陷基因-1)编码的蛋白质识别外源 dsRNA,当dsRNA达到一定量的时候，Rde-I引导dsRNA与Rde-I编码的Dicer (Dicer是一种 RNaseIII活性核酸内切酶，具有四个结构域=Argonaute家族的PAZ结构域，III型RNA酶 活性区域，dsRNA结合区域以及DEAH/DEXHRNA解旋酶活性区)结合，形成酶-dsRNA复合体。 在Dicer酶的作用下，细胞中的单链靶mRNA(与dsRNA具有同源序列)与dsRNA的正义链 互换，原来dsRNA中的正义链被mRNA代替而从酶-dsRNA复合物中释放出来，然后，在ATP的 参与下，细胞中存在的一种RNA诱导的沉默复合体RNA-induced silencing complex (RISC, 由核酸内切酶、核酸外切酶、解旋酶等构成，作用是对靶mRNA进行识别和切割)利用结合在 其上的核酸内切酶的活性来切割dsRNA上处于原来正义链位置的靶mRNA分子中与dsRNA 反义链互补的区域，形成21-23nt的dsRNA小片段，这些小片段即为siRNA。RNAi干涉的关 键步骤是组装RISC和合成介导特异性反应的siRNA蛋白。siRNA并入RISC中，然后与靶
4标基因编码区或UTR区完全配对，降解靶标基因，因此说siRNA只降解与其序列互补配对的 mRNA。其调控的机制是通过互补配对而沉默相应靶位基因的表达，所以是一种典型的负调 控机制。siRNA识别靶序列是有高度特异性的。而且它的合成非常简便，已经成为一项很成 熟的技术。本发明针对PAR-I基因设计合成了 8对siRNA，该8对siRNA能够有效抑制PAR-I 基因的表达；同时由于siRNA技术越来越成熟，也为治疗肝纤维化提供了可行的药物。
图1为可见光源条件下的siRNA转染效率照片。图2为荧光激发条件下的siRNA转染效率照片。图3为荧光定量PCR检测转染不同siRNA的PAR-I基因表达水平图。图中M0CK是未转染任何siRNA的空白对照组；si-control是转染si-control的 siRNA 的无关对照组；PAR-1-01 PAR-1-08 是转染 PAR-1-01 PAR-1-08 的 siRNA 组图4为荧光定量PCR检测肝纤维化病理过程(天数)与PAR-I的mRNA的表达水 平关系图。图中天数用于衡量肝纤维化病理过程图5为荧光定量PCR检测肝纤维化病理过程(天数)与TGF-betal的mRNA的表 达水平关系图。图中天数用于衡量肝纤维化病理过程图6为荧光定量PCR检测肝纤维化病理过程(天数)与Collal的mRNA的表达水 平关系图。图中天数用于衡量肝纤维化病理过程图7为PAR-1-01的siRNA在不同浓度下的量效曲线。图8为原代肝星型细胞体外培养不同时间的细胞形态图。图9为荧光定量PCR检测转染PAR-1-01的siRNA的原代肝星型细胞(体外培养 48小时)的PAR-I基因表达水平图。图10为荧光定量PCR检测转染PAR-1-01的siRNA的原代肝星型细胞(体外培养 48小时)的TGF-betal、Collal基因表达水平图。图11为荧光定量PCR检测转染不同浓度的PAR-1-01的siRNA的原代肝星型细胞 (体外培养48小时)的TGF-betal、Collal基因表达水平图。图12为荧光定量PCR检测转染PAR-1-01的siRNA的原代肝星型细胞(体外培养 5天)的PAR-I基因表达水平图。图13为荧光定量PCR检测转染PAR-1-01的siRNA的原代肝星型细胞(体外培养 5天)的TGF-betal、Collal基因表达水平图。图14为荧光定量PCR检测转染不同浓度的PAR-1-01的siRNA的原代肝星型细胞 (体外培养5天)的TGF-betal、Collal基因表达水平图。
具体实施例方式下面结合具体附图和实施例对本发明作进一步说明。本发明利用PCR和Westernblot技术确定了 HSC-T6肝星型细胞能够在RNA和蛋 白水平大量表达PAR-I基因，所以本发明采用大鼠HSC-T6肝星型细胞系(来自于湘雅医学 院细胞库)作为siRNA筛选细胞，该细胞常规培养在DMEM高糖培养剂(含10%体积比的胎牛血清中)，培养条件为37°C，5%体积比的二氧化碳，每三天传代一次。1、siRNA的设计合成根据siRNA设计原理，针对PAR-I基因的mRNA序列设计了 8对siRNA (参见表1)。 PAR-1-01 PAR-1-06设计成大小鼠同源的siRNA，目的主要是为了能够利用大鼠的HSC-T6 细胞系进行siRNA的筛选，而不必从大鼠或小鼠的肝脏中分离肝星型细胞，同时在后续的 动物实验中能够利用小鼠作为病理模型，由于小鼠体重较大鼠轻很多，所以给药剂量可以 大大减少，可以大大减低siRNA合成费用。设计方法及步骤为(1)利用NCBI的核苷酸数 据库分别找到大鼠和小鼠PAR-I基因的RNA序列，它们在NCBI的Accessions分别为匪 012950. 2和NM 010169. 3 ； (2)利用CLUSTAL X (2. 0)序列比对软件将两条序列进行比对并 找到同源部分；(3)利用Whitehead Institute在其网站(网址为:http //jura. wi. mit. edu/bioc/siRNAext/home. php)上发布的siRNA设计软件，针对同源部分进行设计；(4)利 用NCBI的blastn的程序，调用数据库nt/nr进行分析，结果显示设计的这6对siRNA不会 与大鼠、小鼠除PAR-I基因之外的其它基因的序列同源。PAR-1-07 PAR-1-08是仅针对 大鼠PAR-I基因的siRNA设计，目的在于去除同源序列这个限制因素，使得siRNA的设计结 果更加可靠。上述PAR-1-01 PAR-1-08的siRNA均由上海吉玛制药技术有限公司提供合 成。为提高所述siRNA的基因沉默效率，所述PAR-1-01 PAR-1-08的siRNA的3'端垂悬 有两个由脱氧核苷组成的碱基TT。 表1 根据Whitehead Institute的siRNA设计软件设计合成的8对siRNA序列。2、HSC-T6细胞的分离培养及siRNA的转染。HSC-T6细胞在转染前16小时，将浓度为0. 6*104PM的细胞悬液接种于标准12孔 细胞培养板中，转染前更换新鲜培养剂。每孔加入lOpmole的siRNA和7ul的siRNA转染 试剂INTERFERin (由Polyplus-transfection生产)，转染方法按照转染试剂生产商的试 剂说明书进行，转染效率利用FAM标记阴性对照的siRNA检测，检测结果参见图1、图2。3、提取及反转录转染后24小时采用Trizol (invitrogen公司生产)提取细胞RNA，提取方法按照 Trizol生产商invitrogen公司提供的试剂说明书进行；提取后的RNA经DnaseI (碧云天 生物公司提供)在37°C下处理30分钟后，再经酚氯仿提取一次，取0. 5ug的RNA在MMLV反 转录酶(Promega公司)作用下，利用oligodt(15) (Invitrogen公司)作为引物，按照反转 录试剂盒说明书进行，将RNA反转录成cDNA，备用。4、荧光定量PCR检测取步骤3制备的适量的cDNA做荧光定量PCR检测，。荧光定量PCR采用 sybrgreen的方法，所用PCR试剂为SYBR Premix Ex Taq (宝生物工程大连有限公 司生产)，所用的仪器为lightcycle480(罗氏(Roche)公司生产)；同时设置空白对 照组MOCK和无关对照组s i-contro 1 (上海吉玛制药技术有限公司提供)，s i-contro 1 的序列参见表一；试剂盒采用SYBR Premix Ex Taq (宝生物工程大连有限公司生 产)，PCR程序设置按照该试剂盒提供的说明书进行，PCR检测中使用Gapdh基因作为 内参基因，进行相对定量分析PAR-I基因的表达水平。Gapdh基因所用引物中的左引 物序列 SEQ ID N0. 19 为 5 ‘ -TCACCACCATGGAGAAGGC-3 ‘，右引物序列 SEQ ID N0. 20 为 5 ‘ -GCTAAGCAGTTGGTGGTGCA-3 ‘ ；si-control 和 PAR-I 基因所用引物中的左引物 序歹Ij SEQ ID N0. 21 为 5 ‘ -GCCAGAAGCACCTTTACAGC-3 ‘，右引物序列 SEQ ID N0. 22 为 5' -TTCAGGTGGCTAGAGCAGGT-3‘；反应体系中的引物浓度为300nM。检测结果如图3所示， 由图可见，PAR-I基因的表达水平明显受到siRNA的抑制而降低。5、有效性验证研究表明，肝纤维化病理过程(天数)的发生通常伴随着一些肝纤维化标志基因 如PAR-I、TGF-betal、Collal的mRNA的表达水平的升高，通过荧光定量PCR检测(检测结 果如图4 6所示)可见，在肝星型细胞活化成为纤维化细胞的过程中，PAR-I、TGF-betal、 Collal的mRNA的表达水平随着肝纤维化的程度而逐渐增高。(1)、选取PAR-I-Ol的siRNA做量效关系实验为验证PAR-I-Ol的siRNA能否呈现良好的量效关系，本发明通过变换PAR-I-Ol 的siRNA的不同浓度，在HSC-T6细胞上观察PAR-I的抑制效率，得到了量效曲线和IC50的 数据，结果如图7所示，由图可见，PAR-I基因的表达水平随着siRNA浓度的升高而逐渐降 低。(2)、选取PAR-I-Ol的siRNA做原代肝星型细胞的活化抑制实验(a)、原代肝星型细胞的分离培养本发明从大鼠肝脏中分离了原代肝星型细胞，分离方法为成年Wistar大鼠术前 禁食12 16h，自由饮水。用戊巴比妥钠40mg-kg-1腹腔内注射麻醉大鼠。胸腹部皮肤消毒，移入超净工作台中。沿腹部正中线剪开腹腔，分离下腔静脉及门静脉，在门静脉距肝 外IOmm处用眼科剪斜形剪一小口，迅速插入自制血管插管，结扎固定。接通恒流蠕动泵，灌 注预热37°C的D. Hank' s肝脏灌流液，剪开下腔静脉，此时可见灌流液自下腔静脉流出，肝 脏逐渐饱满，由紫红色逐渐变成淡黄白色。游离肝脏，保留下门静脉血管插管及下腔静脉的 标志缝线。将游离的肝脏置于平皿中，灌注预热37°C的含酶Hank ‘ s液I (含0. 05 %的胶原 酶、0. 链霉蛋白酶溶液)，并将灌注系统进液端放入平皿中，使流出的酶液可进行循环灌 流，可见肝脏变软无弹性，肝包膜下出现小液泡。倒除灌流液，撕去肝脏外膜，撕碎或剪碎肝 组织，加入预热37°C的含酶Hank‘ s液II (含0. 05%的胶原酶、0. 02%链霉蛋白酶、0. 01 % DNA酶I溶液)，再次消化20min。经200目滤网过滤，用磨锤轻轻研磨，并用4°C的Hank' s 液冲冼。将烧杯内细胞悬液分装入2只50ml的刻度离心管，550r · min-1离心8min ；吸除 上清入2只50ml的刻度离心管，1750r .min-l离心8min。去上清，用4°C的Hank' s液冲 冼重悬，2管合1定容至10ml。加入20ml的18% Nycodenz，将细胞悬液分装入6只IOml 带盖的刻度离心管中，每管液面覆盖2 3ml的Hank' s液，3200r ·π η-1离心15min。吸 取中间细胞悬液层入50ml刻度离心管，加入无血清DMEM培养液至50ml，550r -min-l离心 8min，取沉淀。加入预热37°C的含血清的DMEM完全培养基至10ml。每5*106转移至IOcm 细胞培养皿中。刚分离的原代肝星型细胞呈扁圆形，经48小时体外培养，细胞呈星型细胞 状。培养到7天时细胞逐渐开始融合、变长、分裂、增殖，形态向纤维样细胞发展，细胞形态 如图8所示。(b)、体外培养48小时后的原代肝星型细胞的活化抑制实验体外培养原代肝星型细胞48小时后，按每孔1. 2*105细胞个数的细胞悬液接种 于标准12孔细胞培养板中，培养3小时，更换新鲜DMEM完全培养剂。每孔加入lOpmole 的 PAR-1-01 的 siRNA 和 7ul 的 siRNA 转染试剂 INTERFERin (由 Polyplus-transfection 生产)，转染方法按照转染试剂生产商的试剂说明书进行；24小时后再采用上述相同方法 转染一次；再经24小时，采用前述方法提取细胞RNA。利用前述的荧光定量PCR检测方 法测定PAR-I、TGF-betaU Collal的表达水平，同时设置空白对照组MOCK和无关对照组 si-control (上海吉玛制药技术有限公司提供)。检测结果图9、图10所示，检测结果表明 经PAR-1-01的siRNA处理的原代肝星型细胞的PAR-I、TGF-betal、Col Ial的表达水平较未 经处理的细胞表达大大降低。改变PAR-1-01的siRNA的用量，采用前述的转染方法与检测方法进行处理与检 测，结果如图11所示，由图可见，PAR-1-01的SiRNA的用量能够影响TGF-betaUCollal的 表达水平的高低。(c)、体外培养5天后的原代肝星型细胞的活化抑制实验。体外培养的原代肝星型细胞5天后，按每孔1. 2*105细胞个数的细胞悬液接种于 标准12孔细胞培养板中，培养3小时，更换新鲜DMEM完全培养剂。每孔加入lOpmole的 PAR-1-01 的 siRNA 和 7ul 的 siRNA 转染试剂 INTERFERin (由 Polyplus-transfection 生产)，转染方法按照转染试剂生产商的试剂说明书进行；24小时后再采用上述相同方法 转染一次；再经24小时，采用前述方法提取细胞RNA。利用前述的荧光定量PCR检测方 法测定PAR-I、TGF-betaU Collal的表达水平，同时设置空白对照组MOCK和无关对照组 si-control (上海吉玛制药技术有限公司提供)。检测结果图12、图13所示，检测结果表明经PAR-1-01的siRNA处理的原代肝星型细胞的PAR-I、TGF-betal、Col Ial的表达水平较未 经处理的细胞表达大大降低。 改变PAR-1-01的siRNA的用量，采用前述的转染方法与检测方法进行处理与检 测，结果如图14所示，由图可见，PAR-1-01的siRNA的用量能够影响TGF-betaUCollal的 表达水平的高低。
权利要求
抑制PAR 1基因表达的siRNA，其特征在于，所述siRNA为下述PAR 1 01～PAR 1 09中的任意一种，PAR 1 01～PAR 1 08分别为PAR 1 01正义链序列SEQ ID NO.1为5′ AGGGCAGUCUACUUAAAUA 3′反义链序列SEQ ID NO.2为5’ UAUUUAAGUAGACUGCCCU 3’PAR 1 02正义链序列SEQ ID NO.3为5′ CGGCCGUGGUGUACAUGCU 3′反义链序列SEQ ID NO.4为5′ AGCAUGUACACCACGGCCG 3′PAR 1 03正义链序列SEQ ID NO.5为5′ CCUUCAAGAUCAGCUACUA 3′反义链序列SEQ ID NO.6为5′ UAGUAGCUGAUCUUGAAGG 3′PAR 1 04正义链序列SEQ ID NO.7为5′ ACAUGUACGCCUCCAUCAU 3′反义链序列SEQ ID NO.8为5′ AUGAUGGAGGCGUACAUGU 3′PAR 1 05正义链序列SEQ ID NO.9为5′ GCAUCUUCAUCGUCUGCUU 3′反义链序列SEQ ID NO.10为5′ AAGCAGACGAUGAAGAUGC 3′PAR 1 06正义链序列SEQ ID NO.11为5′ CCACCAACGUCCUCCUGAU 3′反义链序列SEQ ID NO.12为5′ AUCAGGAGGACGUUGGUGG 3′PAR 1 07正义链序列SEQ ID NO.13为5′ GCAGGGCAGUCUACUUAAA 3′反义链序列SEQ ID NO.14为5′ UUUAAGUAGACUGCCCUGC 3′PAR 1 08正义链序列SEQ ID NO.15为5′ GCUCUAGCCACCUGAAUAA 3′反义链序列SEQ ID NO.16为5′ UUAUUCAGGUGGCUAGAGC 3′。
2.如权利要求1所述的抑制PAR-I基因表达的siRNA，其特征还在于，所述siRNA的 3'端垂悬有两个用于提高基因沉默效率的由脱氧核苷组成的悬挂碱基TT。
3.如权利要求1或2所述的抑制PAR-I基因表达的siRNA，其特征于，所述siRNA序列 用于制备治疗肝纤维化的药物。
全文摘要
本发明根据siRNA设计原理，针对PAR-1基因的mRNA序列设计了8对siRNA，该8对siRNA可以用于抑制PAR-1基因表达的siRNA，由于PAR-1基因的表达水平与肝纤维化密切相关，抑制PAR-1基因的表达就能有效延缓甚至阻断肝纤维化的病理进程，达到治疗肝硬化的目的。上述8对siRNA序列可用于制备治疗肝纤维化的药物。
文档编号C12N15/113GK101921763SQ20101010182
公开日2010年12月22日 申请日期2010年1月22日 优先权日2010年1月22日
发明者张红, 潘振华, 盛青松 申请人:无锡奥瑞生物医药科技有限公司