专利名称：石榴状磁性纳米粒子聚集体的制备及其在dna分离纯化中的应用的制作方法
技术领域：
—种超顺磁性石榴状磁性纳米粒子聚集体的制备方法及其在DNA分离纯化中的 应用，属于纳米材料和分子生物学技术领域。
背景技术：
四氧化三铁磁性纳米粒子毒性低，具有磁响应性和超顺磁性，即在外加磁场中有 较强的磁性，撤离磁场时，磁性很快消失，剩磁为零，不会被永久磁化。由很多小的磁性纳米 颗粒聚集在一起形成较大的球状团簇磁性纳米粒子，其形状与成熟石榴的籽粒聚集情况类 似，我们称之为石榴状磁性纳米粒子聚集体，它具有更强的磁响应性。 用柠檬酸钠包覆四氧化三铁磁性纳米粒子，可以使其既具有较好的超顺磁性和水 溶性，又具有表面活性基团，能进一步和细胞、酶、蛋白质、抗体及核酸等多种生物分子偶 联。在外加磁场的作用下，磁性纳米粒子能够很方便地和底液分离，具有操作简便和分离效 率高的优点。此外，被包覆后的磁性纳米粒子具有大的比表面积，为修饰多种高密度分子探 针提供了基础，在细胞分离、蛋白质纯化及DNA分离检测等领域显示出广阔的应用前景。
总的来说，磁性纳米粒子的制备方法可以分为物理法、生物法和化学法。其中物理 法以机械球磨法为主要代表，球磨法是将微米或亚微米的粒子进行长时间研磨，然后分散 到油基介质中而得，这种制备方法得到的粒子的粒径分布比较宽，同时这种制备方法所消 耗的时间也比较长。磁性纳米粒子的生物制备法主要是指磁性纳米粒子广泛地存在于各种 生物体如细菌，鸽子等体内，利用生物法制备的粒子粒径比较均一且形貌规则，缺点在于细 菌培养较为困难，粒子提取的过程也较为繁琐。所以目前来说，对于研究磁性纳米粒子的合 成主要限于化学法制备的磁性纳米粒子，磁性纳米材料的化学合成法又可分为均相制备法 和非均相制备法，其中均相制备法包括共沉淀法和高温分解法，非均相制备法有微乳液法、 溶胶_凝胶法、超声化学法、激光分解法和电化学沉积法等。 上世纪八十年代以来，人们不断尝试各种方法制备粒径均一、磁响应性更强的生
物相容性四氧化三铁磁性纳米粒子，然而迄今没有形成成熟统一的制备方法。 本发明采用简单易行的有机溶剂高温反应法研制粒径均一、磁响应性强的生物相
容性石榴状磁性纳米粒子聚集体，这种柠檬酸钠包裹的磁性纳米粒子聚集体表面富含功能
基团-COOH。在一定的盐浓度下，DNA可结合于表面有-COOH末端的磁粒上，一旦结合，可用
70%的乙醇对DNA-磁粒复合物进行清洗，然后用Tris-EDTA缓冲液将DNA洗脱。所制备的
石榴状磁性纳米粒子聚集体可应用于动植物DNA的分离纯化，操作简便，省时省力。
发明内容
本发明的目的在于提供一种石榴状磁性纳米粒子聚集体的制备方法，制备的粒子 粒径均一、磁响应性强，具有良好的生物相容性，可用于动植物DNA检测过程中DNA的分离 纯化，操作方法简便易行。
本发明的技术方案一种石榴状磁性纳米粒子聚集体的制备方法以及在动植物 DNA检测中的应用，包括石榴状磁性纳米粒子聚集体的制备、动植物DNA的分离纯化。
( — )石榴状磁性纳米粒子聚集体的制备，采用有机溶剂高温反应法在反应器中 合成，具体步骤如下 (1)称取O. 65g无水三氯化铁和0. 4g柠檬酸三钠放入反应器中，加入20mL乙二醇
作为溶剂，在溶剂相中通入氮气lOmin以驱除氧气，磁力搅拌使固体全部溶解于溶液中； (2)称取1. 2g无水乙酸钠加入到反应体系中，继续搅拌，将反应器置于油浴加热
至220°C ，同时磁力搅拌，反应10h停止加热，继续磁力搅拌冷却至室温； (3)反应后的溶液加入20mL无水乙醇，超声震荡10min，6000rpm离心lOmin，弃上
清； (4)沉淀部分继续加入20mL无水乙醇，超声震荡10min，6000rpm离心lOmin，弃上 清； (5)沉淀部分加入20mL去离子水，超声震荡10min， 6000rpm离心10min，弃上清；
(6)沉淀分散于lOmL去离子水中，即为石榴状磁性纳米粒子聚集体分散液，室温 保存备用。 上述方法制备的石榴状磁性纳米粒子聚集体为球形，二次粒径(多个粒子团簇之
后形成的大粒子的直径)在100 500nm之间，制备条件可控，磁响应性强，在水和生理盐
水中分散性好。可用于动植物基因组DNA的分离纯化。 ( 二 )用于K562细胞(白血病细胞)DNA的分离纯化，步骤如下 (1)取lmL培养的K562细胞于1.5mL离心管中，1000rpm离心5min，弃上清； (2)沉淀细胞用lmL生理盐水lOOOrpm离心洗涤，离心洗涤2次； (3)离心洗涤后的细胞加入lmL细胞裂解液(3M Nal、5M尿素、40g/L曲拉通
X-100、10mM乙二胺四乙酸二钠、25mM Tris-HCl)，混匀后加入25 y g/y L的蛋白酶K
15 ii L、40 y g/ y L的RNA酶5 ii L，充分混匀后37。C水浴孵育30min ; (4)加入( 一 )方法制得的石榴状磁性纳米粒子聚集体分散液10 ii L，充分混匀， 静置5min，加入40 ii L异丙醇，静置5min ; (5)磁分离，弃上清，加入质量浓度70%乙醇lmL洗涤，磁分离，弃上清；
(6)加入50ii L TE缓冲液(10mM Tris-HCl、lmM乙二胺四乙酸二钠，pH8. 0) ，37°C 水浴孵育5min，混匀后磁分离，取上清，即为K562细胞DNA洗脱液。
(三)用于转基因大豆DNA的分离纯化，步骤如下 (1) 3粒转基因大豆种子洗净，纯水中浸泡吸胀24h，手工去皮，加0. 2g石英砂，冰 浴下研磨成糊，转入10mL离心管中； (2)快速加入65。C预热的提取液(pH8. 0、0. 1M Tris-HCl， pH8. 0、0. 02M乙二胺四 乙酸二钠，1. 5M NaCl，质量浓度2%聚乙烯吡咯烷酮40，质量浓度2%十六烷基三甲基溴化 铵及质量浓度3% |3 -巯基乙醇)至9mL处，上下摇动，65"水浴30min，其间每5min颠倒 三次，10000rpm离心10min，取上清; (3)上清液加入等体积氯仿-异戊醇混和溶液(24 : 1，V/V)，缓慢上下颠倒30次， 10000rpm离心10min，取上清lmL加到1. 5mL离心管中; (4)加入( 一 )方法制得的石榴状磁性纳米粒子聚集体分散液10 i！ L，充分混匀，静置5min，磁性分离，沉淀用无水乙醇洗3次，自然挥发30min ; (5)加入100iiL TE缓冲液(10mM Tris-HCl、 lmM乙二胺四乙酸二钠，pH8. 0) ， 37°C
水浴孵育5min，混匀后磁分离，取上清，即为转基因大豆DNA洗脱液。 所制备的石榴状磁性纳米粒子聚集体可应用于动植物DNA的分离纯化。 本发明的有益效果本发明提供了一种简便易行的有机溶剂高温反应法制备石榴
状磁性纳米粒子聚集体的方法，获得较大粒径的球状粒子，磁响应性强，水溶性好，简化了
反应的步骤。制备的石榴状磁性纳米粒子聚集体可用于动植物DNA的高效分离纯化，用于
K562细胞DNA的分离纯化以及转基因大豆DNA的分离纯化，大大提高检测的灵敏度，且操作
更加简便。
图1石榴状磁性纳米粒子的TEM (透射电镜)图。 图2提取出的K562细胞DNA的琼脂糖凝胶(0. 8% )电泳图。 图3石榴状磁性纳米粒子的SEM (扫描电镜)图。
具体实施例方式
实施例1.石榴状磁性纳米粒子聚集体的制备 (1)称取O. 65g无水三氯化铁和0. 4g柠檬酸三钠放入反应器中，加入20mL乙二醇
作为溶剂，在溶剂相中通入氮气10min以驱除氧气，磁力搅拌使固体全部溶解于溶液中； (2)称取1. 2g无水乙酸钠加入到反应体系中，继续搅拌，将反应器置于油浴加热
至220°C ，同时磁力搅拌，反应10h停止加热，继续磁力搅拌冷却至室温； (3)反应后的溶液加入20mL无水乙醇，超声震荡10min，6000rpm离心10min，弃上
清； (4)沉淀部分继续加入20mL无水乙醇，超声震荡10min，6000rpm离心10min，弃上 清； (5)沉淀部分加入20mL去离子水，超声震荡10min， 6000rpm离心10min，弃上清；
(6)沉淀分散于lOmL去离子水中，即为石榴状磁性纳米粒子聚集体分散液，室温 保存备用。 实施例2. K562细胞(白血病细胞)DNA的分离纯化，步骤如下 (1)取lmL培养的K562细胞于1. 5mL离心管中，1000rpm离心5min，弃上清； (2)沉淀细胞用lmL生理盐水1000rpm离心洗涤，离心洗涤2次； (3)加入lmL细胞裂解液(3M Nal、5M Urea、40g/L Triton-X-100、 10mMEDTA、25mM
Tris-HCl)，混匀后加入15iiL蛋白酶K(25iig/iiL)、5iiL RNA酶(40 y g/y L)充分混匀后
37。C水浴孵育30min ; (4)加入实施例1制得的石榴状磁性纳米粒子聚集体分散液10i! L，充分混匀，静 置5min，加入40 ii L异丙醇，静置5min ; (5)磁分离，弃上清，加入质量浓度70%乙醇lmL洗涤，磁分离，弃上清； (6)力B入50iiL TE缓冲液(10mM Tris-HCl、lmM EDTA， pH8. 0) ， 37 。C水浴孵育
5min，混匀后磁分离，取上清，即为K562细胞DNA洗脱液。
3.转基因大豆DNA的提取纯化，步骤如下 (1) 3粒转基因大豆种子洗净，纯水中浸泡吸胀24h，手工去皮，加0. 2g石英砂，冰 浴下研磨成糊，转入lOmL离心管中； (2)快速加入65。C预热的提取液(0. 1M Tris-HCl， pH8. 0、0. 02M EDTA， pH8. 0、 1. 5MNaCl、2% PVP40、2% CTAB、3% P -巯基乙醇)至9mL处，上下摇动，65。C水浴30min，其 间每5min颠倒三次，10000rpm离心10min，取上清； (3)上清液加入等体积氯仿-异戊醇混合溶液(24 : 1，V/V)，缓慢上下颠倒30次， 10000rpm离心10min，取上清lmL加到1. 5mL离心管中; (4)加入实施例1制得的石榴状磁性纳米粒子聚集体分散液10 ii L，磁性分离，沉 淀用无水乙醇洗3次，自然挥发30min ; (5)力B入100iiL TE缓冲液(10mM Tris-HCl、lmM EDTA， pH8. 0) ， 37 。C水浴孵育 5min，混匀后磁分离，取上清，即为转基因大豆DNA洗脱液。
权利要求
一种石榴状磁性纳米粒子聚集体的制备方法，其特征在于采用有机溶剂高温反应法在反应器中合成，其步骤如下(1)称取0.65g无水三氯化铁和0.4g柠檬酸三钠放入反应器中，加入20mL乙二醇作为溶剂，在溶剂相中通入氮气10min以驱除氧气，磁力搅拌使固体全部溶解于溶液中；(2)称取1.2g无水乙酸钠加入到反应体系中，继续搅拌，将反应器置于油浴加热至220℃，同时磁力搅拌，反应10h停止加热，继续磁力搅拌冷却至室温；(3)反应后的溶液加入20mL无水乙醇，超声震荡10min，6000rpm离心10min，弃上清；(4)沉淀部分继续加入20mL无水乙醇，超声震荡10min，6000rpm离心10min，弃上清；(5)沉淀部分加入20mL去离子水，超声震荡10min，6000rpm离心10min，弃上清；(6)沉淀分散于10mL去离子水中，即为石榴状磁性纳米粒子聚集体分散液，室温保存备用。
2. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征是所制得的石榴状磁性纳米粒子聚集体， 其粒径为100 500nm。
3. 权利要求1所述的制备方法所制得的石榴状磁性纳米粒子聚集体的应用，其特征是 用于K562细胞DNA的分离纯化，步骤如下(1) 取lmL培养的K562细胞于1. 5mL离心管中，1000rpm离心5min，弃上清；(2) 沉淀细胞用lmL生理盐水1000rpm离心洗涤，离心洗涤2次；(3) 离心洗涤后的细胞加入lmL细胞裂解液，混匀后加入25 ii g/ ii L的蛋白酶K 15 ii L、40 y g/ y L的RNA酶5 ii L，充分混匀后37。C水浴孵育30min ;所述细胞裂解液组成为3M Nal、5M尿素、40g/L曲拉通-X-IOO、lOmM乙二胺四乙酸二 钠及25mM Tris-HCl ;(4) 加入权利要求1方法制得的石榴状磁性纳米粒子聚集体分散液10i! L，充分混匀， 静置5min，加入40 ii L异丙醇，静置5min ;(5) 磁分离，弃上清，加入质量浓度70%乙醇lmL洗涤，磁分离，弃上清；(6) 加入50iiL TE缓冲液，37t:水浴孵育5min，混匀后磁分离，取上清，即为K562细胞 DNA洗脱液；所述TE缓冲液组成为10mM Tris-HCl、lmM乙二胺四乙酸二钠，pH8. 0。
4. 权利要求1所述的制备方法所制得的石榴状磁性纳米粒子聚集体的应用，其特征是 用于转基因大豆DNA的分离纯化，步骤如下(1) 3粒转基因大豆种子洗净，纯水中浸泡吸胀24h，手工去皮，加0. 2g石英砂，冰浴下 研磨成糊，转入10mL离心管中；(2) 快速加入65。C预热的提取液至9mL处，上下摇动，65。C水浴30min，其间每5min颠 倒三次，10000rpm离心10min，取上清；所述提取液组成为pH8. 0、0. 1M Tris-HCl， pH8. 0、0. 02M乙二胺四乙酸二钠，1. 5M NaCl ，质量浓度2 %聚乙烯吡咯烷酮40，质量浓度2 %十六烷基三甲基溴化铵及质量浓度 3% P-巯基乙醇；(3) 上清液加入等体积氯仿-异戊醇混合溶液，混合溶液中的氯仿异戊醇体积比为24 : 1，缓慢上下颠倒30次，10000rpm离心10min，取上清lmL加到1. 5mL离心管中;(4) 加入权利要求1方法制得的石榴状磁性纳米粒子聚集体分散液10i! L，充分混匀，静置5min，磁性分离，沉淀用无水乙醇洗3次，自然挥发30min ;(5)加入100uLTE缓冲液，37"水浴孵育5min，混匀后磁分离，取上清，即为转基因大 豆DNA洗脱液；所述TE缓冲液组成为10mM Tris-HCl、lmM乙二胺四乙酸二钠，pH8. 0。
5.权利要求1所述的制备方法所制得的石榴状磁性纳米粒子聚集体的应用，其特征在 于用于动植物DNA的分离纯化。
全文摘要
石榴状磁性纳米粒子聚集体的制备及其在DNA分离纯化中的应用，属于纳米材料和分子生物学技术领域。本发明包括超顺磁性石榴状磁性纳米粒子聚集体的制备方法、石榴状磁性纳米粒子聚集体用于K562细胞DNA的分离纯化以及转基因大豆DNA的分离纯化。本发明提供了一种简便易行的有机溶剂高温反应法制备石榴状磁性纳米粒子聚集体的方法，获得较大粒径的球状粒子，磁响应性强，水溶性好，简化了反应的步骤。制备的磁性纳米粒子聚集体可用于动植物DNA的高效分离纯化，用于K562细胞DNA的分离纯化以及转基因大豆DNA的分离纯化，大大提高检测的灵敏度，且操作更加简便。
文档编号C12N15/10GK101728040SQ20101010176
公开日2010年6月9日 申请日期2010年1月20日 优先权日2010年1月20日
发明者刘微波, 胥传来, 陈伟 申请人:江南大学