专利名称：一种控制拟南芥表皮毛发育的基因及其编码蛋白与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物基因工程领域，具体为一种控制拟南芥表皮毛发育的基因及其编码蛋白与应用。
背景技术：
表皮毛的发育是研究植物细胞分化调控的一种非常有用的模式，它的形态发生与其周围的表皮细胞明显不同，起源和发育也由于具有特殊性而易于观察。它的主要功能是增加表皮层厚度，以减少热量和水分的散失以及防紫外线照射，并且保护植物免受昆虫和病原体的侵害及一些机械损伤(Szymanski et al.，2000)。近年来关于拟南芥表皮毛发育的分子遗传控制机理的研究已经取得了长足的进展。目前已知主要有几个基因参与调节，包括GLl (GLABR0US1) (Larkin et al.，1993 ； Oppenheimer etal.，1991)，TTGl (TRANSPARENT TESTA GLABRRA1)(Walker et al.，1999) 和 GL3 (GLABROUS； ) (Payne et al.，2000)、GL2 (GLABR0US2) (Di Cristina et al, 1996), TTG2(TRANSPARENT TESTAGLABRA2)(Johnson et al. ，2002)、TRY(TRIPTYCHON)(Schellmann et al.，2002)、CPC(CAPRICE)(ffada et al.，1997)、ETC1\ETC2(Kirik et al, 2004a ；Kirik et al, 2004b)以及TOR (WEREWOLF) (Lee et al.，1999)。其中3个转录因子对于表皮毛和根毛的发育启动是必需的(Szymanski et al.，2000)，它们分别是GLI/WER、TTGl和GL3。TRY (TRIPTYCHON)、CPC (CAPRICE)、ETCl (ENHANCER OF TRY AND CAPRICE 1)、 ETC2 (RNHANCER OF TRY AND CPC2)是表皮毛形成中的负调控因子。这四个基因都编码一个MYB蛋白，且仅有一个DNA结合域，没有转录激活域(Wada et al. ,1997 ；Schellmann etal. ,2002 ；Kirik et al. ,2004a ；Kirik et al.，2004b)，在调控表皮毛发育的过程中， ETCU ETC2、TRY和CPC功能冗余。但是表皮毛的发育过程包含许多基因的共同作用，还有很多基因的调控模式尚不清楚，因此通过表型变异和基因功能联系起来研究与表皮毛相关的基因作用机理，对于揭示控制表皮毛发育的基因的相互作用具有重要的意义，同时利用基因工程对这些基因进行改造，对农业生产和作物改良具有重要的现实意义。
发明内容
本发明提供了一种控制拟南芥表皮毛发育的基因及其编码蛋白与应用。本发明是采用如下技术方案实现的一种控制拟南芥表皮毛发育的基因，该基因的核苷酸序列具有如SEQ ID NO 1所示的序列。由控制拟南芥表皮毛发育的基因的核苷酸序列编码的氨基酸序列，该氨基酸序列具有如SEQ IDNO :2所示的序列。一种控制拟南芥表皮毛发育的基因在调控叶片和茎表皮毛发育中的应用。本发明采用激活标签载体PDSK15-11对拟南芥bzrl-lD进行大量转化，通过kista 筛选，获得了一个含有50000株抗性植株的激活标签突变体库，从中筛选到一个叶片和茎表皮毛缺失的突变体，命名为Bll，通过TAIL-PCR的方法对其T-DNA侧翼序列扩增并测定其序列，将测定序列和拟南芥的全基因组序列进行比对，找出突变位点，发现T-DNA插入位点被定位在拟南芥4号染色体At4g01050和At4g01060之间。种植T2代突变体，通过PCR鉴定和观察分析其表型，确定表皮毛缺失的突变体是由于这一 T-DNA插入引起的，并进一步验证这一突变体的表型是由于At4g01060 (SSSETLl)的超表达造成的。At4g01060是一个只有432bp的MYB家族成员，该蛋白含有77个氨基酸残基，含有三个外显子和两个内含子，氨基酸序列在其中间部位仅含有一个MYB domain。经试验验证，该基因特异地在叶片和茎表皮毛发育中起作用，对根毛的发育几乎没有任何作用。ETLl在表皮毛发育中是一个负调控因子，ETLl的过表达会造成表皮毛的缺失。该基因生物学功能的研究进一步完善了表皮毛发育的调控模式，为培育转基因作物新品种奠定了理论和生产实践基础，对农业生产和作物改良具有重要的现实意义。
图1为突变体植株Bll和bzrl-lD植株的莲座叶片表面照片图2为bzrl-lD植株的茎生叶表面照片图3为突变体植株Bll的茎生叶表面照片图4为突变体植株Bll和bzrl-lD植株的茎表面照片图5为Bll突变体T2代分离的PCR鉴定结果图6为RT-PCR分析T-DNA插入位点侧翼基因表达水平的鉴定结果图7为转化植株ftx)35S :ETLl/bzrl-lD和bzrl-lD植株的莲座叶片表面照片图8为转化植株ftx)35S :ETLl/bzrl-lD和bzrl-lD植株的茎生叶表面照片图9为ETLl蛋白的聚类分析结果示意10为ETLl蛋白同源性比较示意11为Bll纯合、杂合突变体与bzrl-lD的表型差异对照图；图12为在光下生长3天的Bll突变体与bzrl_lD的根毛分布13为ETLl ⑶S在叶脉中的表达14为ETLl ⑶S在下胚轴中的表达15为ETLl::⑶S在根系中的表达16为ETLl::⑶S在花瓣中的表达17为ETLl::⑶S在花丝中的表达18为ETLl ::GUS在老叶中的表达图
具体实施例方式实施例1 拟南芥激活标签突变体库的构建和筛选1)将拟南芥种子4°C冷处理3天以使发芽整齐。播于含有1/3蛭石的腐殖质土里培养。培养室保持温度在22-24°C，相对湿度为80%，光源为荧光灯，光照强度为85 μ mol. s—1. m_2，光照时间为16h;2)大约4-5周，拟南芥开始开花，既可用于转化；3)挑含有pDSK15-ll质粒的农杆菌单菌落于YEP液体培养基中(组成为酵母提取物 10g/L，蛋白胨 10g/L，氯化钠 5g/L，pH7. OGen 100mg/L, Carb 50mg/L, Rif 50mg/L)， ^°C，200rpm下振荡培养过夜；按1 50的比例转接到新鲜的含抗生素的YEP液体培养基中扩大培养至对数生长期(菌液0D600约为1. ；5000Xg离心lOmin，弃上清。将沉淀重新悬浮于渗透培养基，组成为含5%蔗糖和0. 02% SilwetL-77(表面活性剂)的1/2MS液体培养基，调0D600 = 0. 8 ；4)拟南芥转化方法采用的是floral dip方法(Clough and Bent, 1998)。将拟南芥培养钵倒置于装有渗透缓冲液的合适大小的容器上，浸透l-2min，取出培养钵置于托盘中，用保鲜膜覆盖1天，保持相对湿度大于95%，以利农杆菌侵染转化。5天后按上述方法重复转化1次；5)拟南芥转化之后，按照正常的生长条件培养，待其拟南芥所有的角果完全枯黄、 开裂时，即可收获种子；6)筛选拟南芥的种植方法同上，但播种密度要大一些。真叶长到2-4片时，喷施除草剂Basta (商品名为Finale ，有效成份为5. 78% glufosinate-ammonium)，筛选对除草剂有抗性的转化植株。每3-5天喷施1次，连续喷3次。将表型有明显变化的转化植株拍照， 并单株采收，其余的转化植株单株采收，或30株混合采收。本发明采用激活标签载体PDSK15-11对拟南芥bzrl-lD进行大量转化，通过kista 筛选，获得了一个含有50000株抗性植株的激活标签突变体库，从中筛选到一个叶片和茎表皮毛缺失的突变体，命名为B11，解剖镜下观察该突变体Bll以及bzrl-lD植株，进行对比，如图1所示，突变体Bll莲座叶片表面没有表皮毛的突起，而bzrl-lD莲座叶布满表皮毛；bzrl-lD和Bll的茎生叶，如图2所示，bzrl_lD茎生叶长满表皮毛，如图3所示，Bll没有表皮毛；如图4所示，bzrl-lD茎长有表皮毛，Bll突变体茎表皮毛少。图1、图4中红色箭头所指为Bll。实施例2 =TAIL-PCR扩增T-DNA侧翼序列以及T-DNA插入位点鉴定本发明中T-DNA侧翼序列的扩增采用TAIL_PCR(热不对称交错多聚酶链式反应) 的方法，将PCR产物直接测序，与拟南芥的全基因组序列比对后发现该T-DNA插入拟南芥4 号染色体At4g01050和At4g01060之间，距离At4g01060起始密码子约2000bp的启动子区，其右边界指向At4g01060。为了进一步确定该突变表型是否是由于这一个T-DNA插入造成的，本发明对Bll的T2代进行了后代遗传分析，T2代的31株植株中，其中M株的表型为无表皮毛，7株为正常的，有表型和无表型的分离比例大约为3. 4 1，由此也可以初步确定T-DNA在基因组中的插入是单拷贝，之后本发明设计了三条引物，对其中的12株植株进行了 PCR鉴定，如图5所示Bll突变体T2代分离的PCR鉴定结果，其中红色箭头所指的是纯合突变体，黄色箭头是bzrl-lD，纯合突变体和杂合突变体都表现为没有表皮毛，没有 T-DNA插入的都表现为正常的表皮毛，由此确定该突变体表型是由于这个T-DNA插入造成的。1、TAIL-PCR扩增的具体步骤如下1. 1引物设计T-DNA左边界引物序列DSKLBl CGACAGTGGTCCCAAAGATGGDSKLB2 GGACGTGAATGTAGACACGTCGAAA
DSKLB3 :AACGCTGCGGACATCTACAT-DNA右边界引物序列DSKRBl CATCGAAAGGACAGTAGAADSKRB2 TCTAAGCCCCCATTTGGACGTGAADSKRB3 CCAACCACGTCTTCAAAGCA简并引物AD 1 =NTC GA (G/C) T (A/T) T (G/C) G (A/T) GTTAD2 :NGT CGA (G/C) (A/T) G ANA (A/T) GTAD3 (A/T) GT GNA G (A/T) A NCA NAG AAD4 :AG (A/T) GNA G (A/T) A NCA (A/T) AG GAD5 :TC (G/C) TNA G(T/A)A CNT (A/T) GG AAD6 :NAC GT (G/C) A (A/T) T (G/C) CN AGAAD7 :NTC GA (G/C) T (A/T) T NG (A/T) GAAAD8 :NTC GT (G/C) (A/T) GA NA (A/T) GTTAD9 :NCA GCT (G/C) (A/T) C TNT (A/T) GAADlO :NCT CGT(G/C)(A/T)G ANT(A/T)GAADll:NGT CGA(G/C)(A/T)C ANT (A/T)CT AAD12 :NGT CGA CGA (G/C) (A/T) C TNA (A/T) CA AAD13 :AG (A/T) CAN G (A/T) T NCA (A/T) GA A1. 2 方法第一轮PCR 反应程序92 "C 3min ；95 "C 30sec ； (94 "C IOsec ；62 "C Imin ； 72 "C 2min)4 个循环；94 "C IOsec ；25 "C 2min ；72 "C 2min ； (94 "C IOsec ；65 "C Imin ； 72 0C 2min ；94 °C IOsec ；65 °C Imin ；72 °C 2min ；94°C IOsec ；44°C Imin ；72 °C 2min) 14 个循环；72°C 5min。将第一轮的产物稀释50倍后取1 μ 1为模板进行第二轮扩增，扩增条件为(94°C IOsec ；65 °C Imin ；72 °C 2min ；94 °C IOsec ；65 °C Imin ；72 °C 2min ；94 °C IOsec ； 450C Imin ；72°C 2min) 12个循环；72°C 5min。以第二轮的产物稀释10倍后取1 μ 1为模板， 扩增条件为(94°C IOsec ；45°C Imin ；72°C 2min) 19 个循环；72°C 7min。前两轮 PCR 的反应体系均为20 μ 1，第三轮的反应体系为50 μ 1。2、为了进一步确定突变表型是由于该T-DNA插入造成，需对突变体Τ2代分离情况进行鉴定。在PDSK15-11的左边界设计一个引物DSKLB2，在插入位点的两端分别设计一条引物，其序列如下DSKLB2 :5’ -GGACGTGAATGTAGACACGTCGAAA-3’BllF :5’ -ACCCTGACTTGAAGCCTCCA-3’BllR :5’ -TGCCGATTAACGCATAGCAC-3，以基因组DNA为模板，用3条引物同时进行PCR，反应程序如下95°C变性^iin ； 940C Imin, 570C 30sec，72°C 40sec，30 个循环；72°C延伸 IOmin0 PCR 产物中比较大的那条带是T-DNA扩增条带，比较小的那条PCR产物是基因组扩增条带。将所得的PCR结果和表型相对应比较后发现，纯合突变体和杂合突变体都表现为没有表皮毛，没有T-DNA插入的都表现为正常的表皮毛，由此证明突变体表型是由于这个T-DNA插入造成的。
实施例3 :T-DNA插入位点侧翼基因的RT-PCR检测以及控制拟南芥表皮毛发育基因的鉴定本发明中由于Bll的Tl代就表现出了表皮毛缺失的表型，这就说明突变表型是一个显性突变，是由于激活标签对侧翼基因的激活引起的。本发明在T-DNA插入位点两侧上下游各101Λ的范围内选择了 4个基因，包括上游的At4g01040和At4g01050以及下游的 At4g01060、At4g01070，对这4个基因的表达水平用RT-PCR进行了半定量检测，如图6所示，RT-PCR结果显示，4个基因中，只有At4g01060在Bll突变体中表达量增强，其它三个基因在bzrl-lD与突变体Bll中表达量没有差异。这一结果表明突变体的表型是由At4g01060 的超表达引起的，因为At4g01060和一个参与调控表皮毛的基因ETCl的同源性很高，因此把At4g01060定名为ETLl。ETLl对应拟南芥数据库中的At4g01060，At4g01060mRNA是一个只有4(^bp的MYB家族成员，推测该蛋白含有74个氨基酸残基，ETLl含有三个外显子和两个内含子，和其他的已知的含有2个或3个MYB domain的MYB蛋白不同，ETLl的氨基酸序列在其中间部位仅含有一个MYB domain，如序列表所示。BLAST检索后发现ETLl蛋白和 CPC, TRY, ETCl和ETC2蛋白的序列高度同源，如图10所示；聚类分析表明，ETLl和ETCl的同源性最高，如图9所示。和其它的MB蛋白一样，其DNA结合区有两个保守的色氨酸残基， 但没有富含脯氨酸区和转录激活区。为了进一步理解ETLl基因的功能，本发明对Bll和bzrl_lD突变体表型进行了细致的观察，突变体Bll莲座叶和茎生叶的表皮毛彻底消失，而茎上的表皮毛也大大减少，而且是纯合体的Bll茎上几乎没有任何的表皮毛，而杂合的Bll茎上表皮毛比较多，但是仍然没有bzrl-lD的多，如图11所示；通过RT-PCR分析ETLl在纯合和杂合突变体茎中的表达强度，得到这种表皮毛分布的不同是因为ETLl表达水平不同造成的。一般来说，根毛的启动和叶表皮毛的启动具有相似的调控模式，因此本发明对Bll和bzrl-lD光下生长3天的根毛进行了比较分析，图12的结果表明，Bll的根毛在根的大部分区域都和bzrl-lD的根毛长度及密度相似，但是在根和下胚轴相连的部位，Bll的根毛数量稍有增多，由此可知，ETLl 特异地在叶片和茎表皮毛发育中起作用，对根毛的发育几乎没有任何作用。ETLl在表皮毛发育中是一个负调控因子，ETLl的过表达会造成表皮毛的缺失。T-DNA插入位点侧翼基因的RT-PCR检测方法如下引物序列如下At4g01040 :B11_40F 5’ -TTTGAAACGGCGGAACGA-3’B11-40R 5’ -TGCATTGCCTCTTGACCGA-3’ ；At4g01050 :B11_50F 5' -GGGGTACCTCTTCCACTTCTTCTTCA-3，B11-50R 5’ -CGGAGCTCCTGGTTTTGTCCTCCTGC-3’ ；At4g01060 :B11_60F5， -GGGGTACCCTCTCTCAGAGTACTCTC-3，B11-60R 5’ -CGGAGCTCATAACAGAGTTGGTAAAT-3，；At4g01070 :B11_70F 5’ -CGGGATCCTTTGCATCAATGGAGGAATC-3’B11-70R 5’ -TCCCCCGGGGCAAATGTGTTTCTGTAT-3’以上基因的PCR反应体系相同，反应程序如下95°C ;3min变性；94°C 30sec, 57°C 30sec，72°C lmin，30 个循环；72°C延伸 lOmin。实施例4 =ETLl超表达载体ftx)35S =ETLl的构建及转基因植株的获得
为进一步证明Bll突变体的表型是由ETLl的超表达引起的，本发明构建了 ETLl 的超表达载体ftx^SS :ETL1 ,RKbzrl-ID后得到转化植株ft~o35S :ETLl/bzrl_lD，所用载体为pSm301，用KpnI与Mel酶切回收，待用。ETLl ORF用PCR的方法直接从基因组DNA 中扩增，ETLl所用正向引物5’-GGGGTAC CCTCTCTCAGAGTACTCTC-3’，有KpnI位点，反向引物 5，-CGGAGCTCATAA CAGAGTTGGTAAAT-3，，有 SacI 酶切位点。双酶切后，回收片段与 pSN1301 酶切片段连接，转化DH5ci，再转化GV3101，最后转化拟南芥，转化和筛选方法同实施例1。如图7所示，转化植株最显著的表型就是莲座叶表皮毛明显的减少，而bzrl-lD莲座叶布满表皮毛；如图8所示，bzrl-lD茎生叶长满表皮毛，转化植株无表皮毛，由此可知， ETLl的超表达重现了 Bll突变体的表型，这就进一步说明Bll突变体的表型是由于ETLl的超表达引起的。实施例5 =ETLl-GUS载体构建与转基因植株的获得及鉴定为了研究ETLl的表达模式，本发明构建了 ETLl启动子启动的GUS报告基因，实验所用的载体为PBI101，从拟南芥基因组中直接扩增出ETLl启动子区约2000bp的片段，所用引物为B11-60PF :5，-GCGTCGACTGGATTCCCTATACATAAC-3，，含有一个 BamHI 酶切位点， B11-60PR :5，-TCCCCCGGGGTCAAACGGCACCGTATT-3，，含有一个 SalI 酶切位点，PCR 产物和载体均酶切后连接，转化DH5 α，测序鉴定后再转化GV3101，最后转化拟南芥，转化和筛选方法同实施例1。⑶S染色方法取新鲜的材料(该材料是为上述转入GUS报告基因的转基因植株的叶脉、下胚轴、根系、花瓣、花丝、老叶)置于1.5ml的离心管中，加入⑶S染液，染色液组成为 0. IM 磷酸钠缓冲液(pH 7. 0)20ml,0. 5M EDTA 溶液 lml，Triton X-1000. 5ml，亚铁氰化钾(pataxiumferrocyamide) 42. 5mg,铁氰化钾(pataxium ferricyamide) 33mg,氯霉素 (chloramphenicol) 5mg, X-Gluc 50mg,甲醇(methanol)溶液 10ml，力口水至 50ml。，37°C温浴12-3 !，用70%乙醇脱色液脱色2-3次，解剖镜下观察照相。在只有两片真叶的幼苗中， ETLl :GUS在叶片的叶脉(图13所示)、下胚轴(图14所示)和根系(图15所示)的微管组织以及根毛中都有表达，特别是在刚萌发的小叶中表达最强。此外在老叶(图18所示) 表皮毛启动的地方表达也比较强，在花瓣(图16所示)、花柱以及花丝(图17所示)中也有表达，但在花托、花药以及柱头上没有表达。序列表<110>山西省农业科学院园艺研究所<120> 一种控制拟南芥表皮毛发育的基因及其编码蛋白与应用<160>2<210>1<211>432<212>DNA<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)<220><221>prim_transcript<222>(1)— (432)
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<400>1ATGGATAACC ATOGCAGGAC TAAGCAACCC AAGACCAACT CCATOGTTAC TTCTTCTTCT 60GAAGGTAAGC TGAAAACTTA AACACCTTOG TTTTCTCATT TTTCCATGTT TTTTTATACT 120TATCTATATA TAATGAGAAA TCTGAATTTT GGTGATGACA AGGAACAGAA GTGAGTAGTC 180TTAGTGGGAA GTTGTGAACA TGAGTCAAGA AGAAGAAGAT TTGGTCTCTC GAATGCATAA 240GCTTGTOGGT GACAGGTTTG ATCTTTTAAC TAATAATGAA TACTATTTOG TAGGAAAATA 300ATTTAATTGT AACACCATAG TAAAAGCTGA ATTTTGTGTG TTATTATTTG ATGAAAGGTG 360GGAACTGATA GCTGGGAGGA TCCCAGGAAG AACOGTGGAG AAATTGAGAG GTTTTGGGTC 420ATGAAAAATT GA432<210>2<211>77<212>PRT<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)<400>2Met Asp Asn His Arg Arg Thr Lys Gln Pro Lys Tnr Asn Ser lie151015Val Thr Ser Ser Ser Glu Gly Thr Glu Val Ser Ser Leu Glu Trp202530Glu Val Val Asn Met Ser Gln Glu Glu Glu Asp Leu Val Ser Arg354045Met His Lys Leu Val Gly Asp Arg Trp Glu Leu lie Ala Gly Arg505560lie Pro Gly Arg Thr Ala Gly Glu lie Glu Arg Phe Trp Val Met657075Lys Asn
权利要求
1.一种控制拟南芥表皮毛发育的基因，其特征是该基因的核苷酸序列具有如SEQ ID NO :1所示的序列。
2.由权利要求1所述一种控制拟南芥表皮毛发育的基因的核苷酸序列编码的氨基酸序列，其特征是该氨基酸序列具有如SEQ ID NO :2所示的序列。
3.—种控制拟南芥表皮毛发育的基因在调控叶片和茎表皮毛发育中的应用。
全文摘要
本发明涉及植物基因工程领域，具体为一种控制拟南芥表皮毛发育的基因及其编码蛋白与应用，该基因的核苷酸序列具有如SEQ ID NO1所示的序列，氨基酸序列具有如SEQ IDNO2所示的序列，该基因在调控叶片和茎表皮毛发育中有重要作用，在表皮毛发育中是一个负调控因子。采用激活标签的方法筛选到一个叶片和茎表皮毛缺失的突变体B11，通过TAIL-PCR的方法对该T-DNA侧翼序列进行了扩增，测序、数据库比对后发现该T-DNA插入拟南芥4号染色体At4g01050和At4g01060之间，突变体的表型是由于At4g01060的超表达引起的，其过表达会引起叶和茎表皮毛的减少，该研究进一步完善了表皮毛发育的调控模式，为培育转基因作物新品种奠定了理论和生产实践基础，对农业生产和作物改良具有重要的现实意义。
文档编号C12N15/84GK102409057SQ201010101819
公开日2012年4月11日 申请日期2010年1月26日 优先权日2010年1月26日
发明者康黎芳, 张超, 曹冬梅, 段九菊, 王云山, 范喜英 申请人:山西省农业科学院园艺研究所