专利名称：与拟南芥矮化相关的特异基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及一种与拟南芥矮化性状相关的特异基因。
植物矮化育种已经非常普遍。新中国成立以来，小麦品种大体经历了5次更换。许多研究表明，品种更换的过程同时也是品种矮化的过程。尤其60年代以来，矮秆、半矮秆小麦品种的选育和利用，明显增强了品种的产量潜力。各种物理或化学(烯效唑、甲基磺酸乙酯(EMS)、多效唑等)的方法处理植株，可以使植株矮化。如适当浓度的烯效唑能促进发芽，矮化植株，增加生物量，提高可溶性糖、淀粉、叶绿素的含量，降低可溶性蛋白和游离氨基酸的含量。但是单纯依靠育种，速度比较慢。
近几年，开展了一些关于矮化相关功能基因的研究。如苹果属显性矮化主基因Dw的RAPD分子标记(张开春等，农业生物技术学报，1999年第7卷第2期Vol.7 No.2 1999)，半矮秆春小麦矮化基因Rht1和Rht2的相关研究，小麦Rht8矮化基因的遗传(向平，国外作物育种1996)等。从这些背景资料可以看出，植株矮化相关功能基因在作物生产中的重要性显而易见，具有控制这一性状的功能基因在生产上的用途是广阔的。
本发明的技术方案如下利用农杆菌介导的转化来实现T-DNA在野生拟南芥基因中随机插入诱变，获得大量突变体，经过TAIL-PCR(Thermal Asymmetric Interlaced PCR，Yaoguang Liu et al，1998，Plant Molecular Biology Reporter 16175-181，热不对称交错多聚酶链式反应)技术扩增并测定标签插入位点的两端序列，用Blast2.0软件将测定序列和拟南芥的全基因组序列比对，定位突变位点，种植突变体，观察分析表型。在我们得到的矮化植株中，突变位点定位在拟南芥基因组第2染色体第132碱基，正好插入基因AT2g22310(GenBank Number)中。其纯合体表型为植株矮小，茎短缩，育性差，这些现象表明基因AT2g22310是控制拟南芥矮化的功能基因。由此，我们获得一种控制植株矮化的方法，即，将AT2g22310基因在转基因植物中过量表达，可以使植株矮化，提高植物耐肥抗倒能力。
基因AT2g22310的cDNA序列见序列表1(SEQ ID No.1)。
基因AT2g22310编码的蛋白质序列见序列表2(SEQ ID No.2)。
一、突变体的获得1.材料拟南芥(Arabidopsis thaliana)的野生型Columbia；农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)GV3101；大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α；T-DNA载体pSKI015。
2.突变体制备和筛选用含Ti质粒的农杆菌侵染野生型拟南芥，利用T-DNA上的筛选标记筛选转化植株，扩增筛选标记基因获得分子生物学的实验依据确定转化体。实验方法(1)拟南芥种植拟南芥种子经过灭菌洗涤，均匀地点到灭菌的培养基上，在温箱中光照生长1-2天，经过春化作用，再放入温室生长。种子萌发出苗后，转移到小花盆中，继续在温室中生长。温室的温度一般控制在19～24℃，湿度控制在50～60％，以一定的光强照射15小时，并有8小时的暗期，如此周期循环。
(2)浸染用T-DNA区含bar基因的Ti质粒pSKI015转化农杆菌，筛选并培养转化子，制备对数生长期的菌液。剪去拟南芥的顶芽，促进侧芽生长，在侧芽长到10-20cm高，未开花的花蕾最多时准备侵染。将拟南芥植株倒置，于菌液中浸泡15分钟，取出植株，避光过夜，继续培养至种子成熟。
(3)筛选bar基因产物有PPT抗性，用含有PPT的培养基培育转化植株的种子，生长条件与前述拟南芥种植条件一致。当拟南芥生长到10-20cm时，剪取约1-1.5g的叶片，用CTAB法提取总DNA。以总DNA为模板，对bar基因进行特异PCR扩增。PCR产物显示有约700bp的DNA片段，为bar基因片段。这样筛选得到的为侵染成功的突变体。
二、插入位点的确定以及DNA序列分析和比对采用TAIL-PCR(热不对称交错多聚酶链式反应)技术扩增标签插入位点的两端序列。TAIL-PCR使用一套巢式特异性引物和一个随机简并引物，由温度循环控制特异性产物和非特异性产物的相对扩增效率。通过高严谨性循环和低严谨性循环的交替进行，目标序列特异性地以几何级数扩增，数量大大超过非特异性产物，从而得到最终的目标产物。Sanger双脱氧法测序，并将测定序列和拟南芥的全基因组序列比对，定位突变位点。
实验方法1.引物设计利用T-DNA左边界附近一段序列设计三个巢式特异引物，为DL15’-GACAACATGTCGAGGCTCAGCAGGA-3’，DL25’-TGGCGTGAATGTAGACACGTCGA-3’，DL35’GCTTTCGCCTATAAATACGACGG-3’；并设计序列较短的非特异引物，为AD25’-NGTCGA(G/C)(A/T)GANA(A/T)GAA-3’。
2.TAIL-PCR以拟南芥总DNA为模板，进行三轮TAIL-PCR。每一轮反应使用的特异引物比前一轮更靠近T-DNA左边界。第一轮反应先进行5个高严谨性循环使特异引物结合扩增产生模板，降低退火温度使随机引物结合，然后交替进行高严谨性循环和低严谨性循环，使目的序列得以扩增。第二轮反应高严谨性循环和低严谨性循环交替进行，一端结合特异引物而另一端结合随机引物的目的序列得到选择性的几何级数扩增。第三轮反应降低退火温度进一步扩增目的序列。每一轮反应后将产物稀释以降低非目的序列的干扰。
3.测序第三轮反应产物直接或经过回收用于测序反应，使用Sanger双脱氧法测序。
4.序列分析并与数据库比对通过NCBI网站在GenBank国际基因数据库中进行序列分析，确定插入位点，并进行同源性分析，Southern blot分析。
三、表型分析纯合突变体中突变基因的表型植株矮小，茎短粗。
种植突变体，同时种植野生型拟南芥为对照。如附
图1和附图2所示，图1为拟南芥突变体植株在开花期和结荚期的形态照片；图2为野生拟南芥在开花期和结荚期的形态照片。由图中可以看出，纯合型突变体可以萌发，在开花期和结荚期与野生型比较，表现出明显的植株矮小，茎短缩，育性差。证明该基因控制拟南芥的矮化性状。
受基因AT2g22310的功能启示，我们得到一种控制植株茎粗的方法，包括将AT2g22310基因在转基因植物中过量表达。
本发明利用T-DNA在拟南芥基因组随机插入的特性，获得基因的插入突变体，通过种植和观察发现突变体的植株矮小。在国际基因序列数据库GenBank中进行基因同源性分析发现，与DF基因同源，表明，该基因在拟南芥基因组中是以单拷贝存在。这些都对该基因的进一步研究有重要意义。
序列表1(SEQ ID No.1)1 ATGGGCGCGG CGGGGTCCAA ACTCGAGAAA GCTCTCGGCG ACCAGTTCCC GGAAGGAGAA61 CGATACTTCG GTTTCGAAAA TTTCGGCAAC ACTTGTTACT GTAACAGTGT TTTGCAGGCT121 CTTTATTTTT GTGCTCCCTT TCGTGAACAA TTGCTTGAAC ATTATGCAAA TAATAAAGCT181 GATGCTGAGG AGAATCTCTT GACCTGCTTG GCTGACTTAT TTTCGCAGAT AAGTTCCCAG241 AAGAAGAAAA CAGGAGTTAT CGCTCCGAAG CGCTTTGTGC AAAGGTTGAA GAAACAGAAT301 GAGCTTTTCC GGAGTTATAT GCATCAGGAT GCACATGAGT TCCTGAATTA TTTGCTAAAT361 GAACTTGTTG AGATCTTAGA GAAAGAGACA CAAGCCACAA AAGCAGACAA TGAAACTTCA421 TCATCTCCTG AAAAGATTGC AAATGTACTG AAAGCTCCCC TGGCAAATGG TGTTCATAAA481 GAGCCAATTG TTACTTGGGT GCACAAGATT TTTCAGGGTA TACTTACCAA CGAGACAAGG541 TGTCTACGGT GTGAGACAGT AACAGCAAGA GATGAAACTT TCCTAGACCT GAGCCTTGAT601 ATTGAACAGA ACAGTTCGAT AACTAGCTGT TTGAAAAACT TCAGCTCCAC AGAGACTCTA661 CATGCAGAAG ACAAGTTTTT CTGTGACAAA TGCTGCAGTT TACAAGAAGC GCAGAAGAGA721 ATGAAGATTA AGAAACCGCC ACACATCTTA GTTATACATC TGAAACGGTT CAAATACATG781 GAACAGTTGG GCCGCTACAA GAAGCTATCG TACAGAGTCG TCTTCCCTCT GGAACTGAAA841 CTCAGCAACA CAGTGGATGA ATATGTGGAC ATTGAGTACT CTCTCTTTGC AGTCGTGGTT901 CATGTCGGAA GTGGACCTAA CCAGGGTCAT TATGTTAGCC TCGTGAAATC CCATAACCAC961 TGGCTCTTCT TTGATGATGA GAGTGTCGAA ATAATTGAAG AATCTGCTGT TCAAACATTC1021 TTCGGTTCAT CGCAAGAGTA CTCAAGTAAT ACTGATCATG GCTACATCTT GTTATACGAG1081 AGCCTCGGAA CAAGATAG序列表2(SEQ ID No.2)MGAAGSKLEK ALGDQFPEGE RYFGFENFGN TCYCNSVLQA LYFCAPFREQ LLEHYANNKADAEENLLTCL ADLFSQISSQ KKKTGVIAPK RFVQRLKKQN ELFRSYMHQD AHEFLNYLLNELVEILEKET QATKADNETS SSPEKIANVL KAPLANGVHK EPIVTWVHKI FQGILTNETRCLRCETVTAR DETFLDLSLD IEQNSSITSC LKNFSSTETL HAEDKFFCDK CCSLQEAQKRMKIKKPPHIL VIHLKRFKYM EQLGRYKKLS YRVVFPLELK LSNTVDEYVD IEYSLFAVVVHVGSGPNHGH YVSLVKSHNH WLFFDDESVE IIEESAVQTF FGSSQEYSSN TDHGYILLYESLGTR*
权利要求
1.一种多核苷酸，具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
2.一种蛋白质，具有如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。
3.如权利要求1所示的多核苷酸，其为拟南芥矮化性状相关的特异基因。
4.一种控制植株矮化的方法，包括将权利要求1所述的多核苷酸在转基因植物中过量表达。
全文摘要
本发明提供了一种与拟南芥矮化性状相关的特异基因AT2g22310;基因AT2g22310编码的蛋白质序列;以及一种控制植株矮化的方法,是将AT2g22310基因在转基因植物中过量表达,可以使植株矮化,提高植物耐肥抗倒能力。
文档编号C07H21/00GK1379038SQ0210015
公开日2002年11月13日 申请日期2002年1月16日 优先权日2002年1月16日
发明者瞿礼嘉, 康定明, 张瑶, 董一宇, 秦跟基, 申云平, 邓兴旺, 顾红雅, 陈章良 申请人:北京大学