专利名称：：拟南芥At168基因在提高作物赖氨酸和蛋白质含量中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及来源于拟南芥的一个蛋白质和基因的用途，特别涉及拟南芥Atl68基因在提高作物赖氨酸和/或蛋白质含量中的应用。
背景技术：
：赖氨酸作为人和单胃动物所必需的氨基酸，在主要禾谷类作物如玉米、水稻、小麦的种子中含量很低，成为主要的限制性氨基酸，严重影响了其营养品质。玉米中蛋白质的合成受到120多个基因的控制，基因之间关系复杂，通常至少要选择10代以上才能得到目的性状的株系。随着生物技术的发展，采用传统育种与分子育种相结合，可以打破物种生殖隔离的障碍，实现物种之间基因的自由交流。而利用植物基因工程改良作物营养及加工品质，其应用潜力不仅仅在于提高初级农产品本身的价值，还涉及到加工成本的降低、加工工艺的简化、产品市场竞争力的提高等多个环节。目前，通过转基因途径提高作物中的赖氨酸含量，主要有以下几个途径I、人工改造或设计高赖氨酸蛋白基因美国先锋公司(PioneerHi-bredInc.)通过改造天然的基因编码序列，用必需氨基酸替代天然蛋白中的部分非必需氨基酸，获得了赖氨酸含量占14%的蛋白基因，将改造好的基因转入植物，可以提高作物的赖氨酸含量。先锋公司对该研究方法拥有专利(W09410315)。另外,少数文献报道了从头合成(denovosynthesis)高赖氨酸蛋白基因的工作，是设计出自然界不存在的基因，因此难以全面了解其所编码的蛋白的特性，目前只在模式植物(烟草)的种子上获得表达(Othanietal.Normalandlysine-containingzeinsareunstableintransgenictobaccosweeds.PlantMolBiol1991,16(I):117-128;Keeleretal.Expressionofdenovohigh—lysinea-helicalcoiled—coilproteinsmaysignificantIyincreasetheaccumulatedlevelsoflysineinmatureseedsoftransgenictobaccoplants.PlantMolBiol.1997,34:15-29.)。2、改变氨基酸的合成和代谢途径赖氨酸的合成受两个关键酶——二氢吡啶二羧酸合成酶(DHDPS)和天冬氨酸激酶(AK)的调控。酶的活性受产物的反馈抑制。用突变的方法筛选出对赖氨酸不敏感的AK和DHDPS，将对赖氨酸不敏感的AK和DHDPS基因转入植物，可以提高植物中游离赖氨酸的含量(Perletal.Regulationoflysinesynthesisintransgenicpotatoplantsexpressingabacterialdihydrodipicolinatesynthaseintheirchloroplasts.PlantMolBiol,1992,19:815-823)。杜邦公司(DuPontCo.)在该研究领域拥有专利(US5773691)。Falco等将编码对赖氨酸不敏感的谷氨酸棒状杆菌的DHDPS的dapA基因与菜豆种子的蛋白特异启动子连接转化油菜，发现转基因油菜的种子中游离赖氨酸的积累增加了100多倍。但游离赖氨酸在大豆及油菜种子中的高水平积累会影响种子的饱满度和发芽率(Falcoetal.Transgeniccanolaandsoybeanseedswithincreasedlysine.Bio/Technol.1995,13:577-582)。3、降低醇溶蛋白含量，增加赖氨酸含量美国新泽西大学和孟山都公司的研究人员应用RNA干扰技术，抑制玉米种子中22KD(Segaletal.AnewopaquevariantofmaizebyasingledominantRNA-interference-inducingtransgene.Genetics,2003,165(I):387-397)或19KD(Huangetal.Generationofmarker-freetransgenicmaizebyregulartwo-borderAgrobacteriumtransformationvectors.TransgenicRes,2004,13(5):451-461)酉享溶蛋白基因的表达，降低籽粒中22KD或19KD醇溶蛋白的含量，结果使玉米籽粒中赖氨酸含量比对照提高了15%-20%，但让人遗憾的是转基因玉米的籽粒表型同o2突变体一样，籽粒软质，易感病，不易贮存。后来，孟山都公司的Huang等(2005)把两种不同的转基因玉米杂交，得到同时转19KDRNAi和dapA(来自微生物对赖氨酸不敏感的二氢吡啶二羧酸合成酶基因)的植株，其F1籽粒中总赖氨酸的含量由对照的0.27%提高到0.55%-0.62%，接近o2基因的水平，但其籽粒的表型缺陷(软质胚乳)仍然存在(Huangetal.High-Iysinecornproducedbythecombinationofenhancedlysinebiosynthesisandreducedzeinaccumulation.PlantBiotechJ，2005，3:555-569)。4、引入外源优质蛋白基因1997年美国夏威夷大学的辛世文等从四棱豆中分离得到一个高赖氨酸蛋白基因(W09707665)，该基因所编码的蛋白质赖氨酸含量约为11%(质量比)。但研究发现该蛋白是一个过敏原，因此使其应用受到限制。
发明内容本发明所要解决的技术问题是提供蛋白质Atl68及编码核酸分子的新用途，所述蛋白质Atl68的氨基酸序列如序列表中序列2所示。序列表中的序列2由168个氨基酸残基组成，赖氨酸含量为20.3%(质量比)。本发明所提供的一种新用途是培育高赖氨酸含量和/或高蛋白质含量的转基因植物的方法。本发明所提供的培育高赖氨酸含量和/或高蛋白质含量的转基因植物的方法，包括如下步骤将Atl68基因导入目的植物中，得到具有如下I)-3)中至少一种性状的转基因植物1)赖氨酸含量和蛋白质含量均高于所述目的植物；2)赖氨酸含量高于所述目的植物；3)蛋白质含量高于所述目的植物；所述Atl68基因是编码序列表中序列2所不蛋白质的DNA。其中所述Atl68基因可先进行如下修饰，再导入宿主中，以达到更好的表达效果I)根据实际需要进行修饰和优化，以使基因高效表达；例如，可根据受体植物所偏爱的密码子，在保持本发明蛋白质Atl68的氨基酸序列的同时改变其密码子以符合植物偏爱性；优化过程中，最好能使优化后的编码序列中保持一定的GC含量，以最好地实现植物中导入基因的高水平表达，其中GC含量可为35%、多于45%、多于50%或多于约60%；2)修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰；3)与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括4组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；尽管证明了来源于双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达；4)与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率；例如来源于CaMV的tml，来源于rbcS的E9;任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接；5)引入增强子序列，如内含子序列(例如来源于Adhl和bronzel)和病毒前导序列(例如来源于TMV，MCMV和AMV)。本发明中所述Atl68基因的编码序列均具体可为序列表中序列I的第1-507位核苷酸。所述Atl68基因可通过Atl68基因表达盒或含有所述Atl68基因表达盒的Atl68基因表达载体导入目的植物。本发明中所述At168基因表达盒均可含有At168基因和启动所述At168基因转录的启动子，所述Atl68基因编码序列表中序列2所示蛋白质Atl68。本发明中所述Atl68基因表达盒均指能够在宿主细胞中表达序列表中序列2所示蛋白质Atl68的DNA，该DNA不但可包括启动Atl68基因转录的启动子，还可包括终止Atl68基因转录的终止子。进一步，所述Atl68基因表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S;来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP"，Chao等人(1999)PlantPhysiol120:979-992);来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关I(PRl)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸甲酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187,267);四环素诱导型启动子(美国专利5，057，422);种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利200710099169.7))，种子忙存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆betaconglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBOJ.4:3047-3053))。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于农杆菌胭脂碱合成酶终止子(N0S终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV35S终止子、tml终止子、豌豆rbcSE9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如0dell等人(I985)Nature313:810;Rosenberg等人(1987)Gene,56125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot(1991)Cell,64:671；Sanfacon等人GenesDev.,5:141;Mogen等人(1990)PlantCell,2:1261;Munroe等人(1990)Gene，91:151;Ballad等人(1989)NucleicAcidsRes.17:7891Joshi等人(1987)NucleicAcidRes.，15:9627)。在本发明的实施例中，所述Atl68基因表达盒中启动所述Atl68基因转录的启动子为谷子种子特异性启动子pF128，其核苷酸序列如序列表中的序列3。可用现有的植物表达载体构建含有所述Atl68基因表达盒的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pR0KII、pBin438、PCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391_Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptll基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对methatrexate抗性的dhfr基因,赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。在本发明的实施例中，含有所述Atl68基因表达盒的Atl68基因表达载体含有两个T-DNA区，一个T-DNA区含有选择标记基因表达盒，另一个T-DNA区含有所述Atl68基因表达盒。所述选择标记基因表达盒除了将所述Atl68基因表达盒中的Atl68基因替换为选择标记基因外，其它元件(如启动子、终止子和增强子)均可相同，其它元件也可不同，如启动子具体可为花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子。所述选择标记基因可为在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptll基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的潮霉素磷酸转移酶基因hpt，和赋予对methatrexate抗性的dhfr基因,赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。在本发明的实施例中，所述选择标记基因为潮霉素磷酸转移酶基因hpt。在本发明的实施例中，含有所述两个T-DNA区的Atl68基因表达载体具体为pSB130_FA168。pSB130_FA168是将所述谷子种子特异性启动子PF128插入pSB130的HindIII和BamHI位点，并将所述Atl68基因插入pSB130的BamHI和SacI位点得到的重组载体(图2)。所述Atl68基因表达载体可通过使用Ti质粒，植物病毒栽体，直接DNA转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞(Weissbach,1998,MethodforPlantMolecularBiologyVIII，AcademyPress，NewYork，pp.411-463；GeisersonandCorey,1998，PlantMolecularBiology(2ndEdition)。所述目的植物可为单子叶植物或双子叶植物。当所述目的植物为玉米等禾本科作物时，所述转基因植物具有如下a)-c)中至少一种特性a)所述转基因植物种子中赖氨酸含量和蛋白质含量均高于所述目的植物的种子山)所述转基因植物种子中赖氨酸含量高于所述目的植物的种子；c)所述转基因植物种子中蛋白质含量高于所述目的植物的种子。所述转基因植物理解为不仅包含将所述基因转化目的植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。本发明所提供的另一种新用途是以下I)-4)中的任一种物质在提高植物中赖氨酸含量和/或蛋白质含量中的应用I)编码Atl68的核酸分子，所述Atl68是序列表中序列I所示的蛋白质；2)所述At168;3)含有I)所述核酸分子的表达盒；4)含有I)所述核酸分子的载体。其中，序列表中的序列I由168个氨基酸组成。所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA;所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。所述核酸分子具体可为编码Atl68的基因，所述基因的编码序列具体可为序列表中序列2的第1-507位核苷酸。上述应用中，3)所述的表达盒具体可为上述Atl68基因表达盒，4)所述的载体具体可为上述Atl68基因表达载体。上述方法和上述应用中提到的所述Atl68基因表达盒或所述Atl68基因表达载体也属于本发明的保护范围。含有上文所述Atl68基因表达盒的重组微生物或含有上文所述Atl68基因表达载体的重组微生物也属于本发明的保护范围。其中，所述重组微生物具体可为细菌，酵母，藻和真菌。其中，细菌可来自埃希氏菌属(Escherichia),欧文氏菌(Erwinia),根癌农杆菌属(Agrobacterium)、黄杆菌属(Flavobacterium),产喊菌属(Alcaligenes),假单胞菌属(Pseudomonas),芽胞杆菌属(Bacillus)等。实验证明，将Atl68基因转入玉米制备的转基因玉米种子中赖氨酸含量最高达种子干重O.43%，比野生型对照提高43.3%;蛋白质含量最高达种子干重的13.94%，比野生型对照提高33.8%。而且高赖氨酸和高蛋白质的性状可以稳定遗传。克服了大多数玉米品质改良方法中所面临的赖氨酸和蛋白质含量不能同时提高的难题。本发明所用的目的基因为来自拟南芥的Atl68基因，其编码的蛋白质赖氨酸含量为20.3%，高于迄今已报道的天然或经改造过的高赖氨酸蛋白。本发明的Atl68基因可以显著提高转基因作物种子中赖氨酸和蛋白质含量，可用于提高作用营养品质。图I为pSB130-FA168的构建流程2为玉米的转化和再生过程图3为RO代玉米基因组DNA的PCR检测结果图4为Rl代玉米种子蛋白质的Western检测结果具体实施例方式实施例I、利用Atl68基因培育高赖氨酸含量和高蛋白质含量的转基因玉米l、Atl68基因的分离根据拟南芥基因组序列(GenBankAB024024)设计引物Atl68Pl5/-GCGGATCCATGGGTTATTGGAAGTCGAAGG-3'和At168P25'-CCGAGCTCTCAAGCCTTTTGTGGCGCAGCC-3',5'端引物引入BamHI酶切位点，3'端引物引入SacI酶切位点。以拟南芥基因组DNA为模板，进行PCR扩增At168基因。扩增条件如下95°C，变性Imin;55°C，退火O.5min；72°C,延伸O.5min;扩增循环数35;最后72°C，延伸IOmin;4°C保存。取适量PCR产物，O.8%琼脂糖凝胶电泳检测。将PCR产物用BamHI和SacI酶切后，连接到pGEM_7Zf(+)(Promega)的BamHI和SacI位点上，进行酶切和序列测定，将含有Atl68基因的重组载体命名为pGEM-7Zf(+)-A168。Atl68基因的核苷酸序列如序列表中序列I所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列如序列表中的序列2所示。2、Atl68基因表达载体的构建及转化农杆菌本步骤构建的Atl68基因表达载体是pSB130-FA168，它含有两个T-DNA区，一个T-DNA区含有选择标记基因表达盒，另一个T-DNA区含有Atl68基因表达盒。Atl68基因表达盒由Atl68基因、启动Atl68基因转录的谷子种子特异启动子pF128和胭脂碱合成基因nos的3’转录终止区域组成。其中，谷子种子特异启动子PF128，其驱动的目的基因主要在授粉后15-25天表达，可避免目的基因的表达对植株生长发育的影响。此外，利用来源于谷子的调控序列还可避免用玉米中的序列如19Z启动子等可能引起的转基因植物中同源抑制和重组的发生，使目的基因的表达更稳定。选择标记基因表达盒由潮霉素磷酸转移酶(hpt)基因、启动潮霉素磷酸转移酶(hpt)基因转录的花椰菜花叶病毒(CaMV)35s启动子和胭脂碱合成酶(NOS)基因的3’转录终止区域(终止子)组成。其中，潮霉素磷酸转移酶(hpt)基因编码氨基糖苷4-磷酸转移酶APH(4)-I。pSB130-FA168的构建流程如图I所示，具体构建方法如下用HindIII和BamHI将谷子种子特异性启动子pF128(其核苷酸序列为序列表中的序列3)从质粒pBIpF128(CN101063139B(中国专利200710099169.7))上切下，连接到双-T载体pSB130(于恒秀，刘巧泉，王玲等，无抗性选择标记转APl基因抗病水稻新品系的选育，中国农业科学，2005,38(12)=2373-2379;来自香港中文大学辛世文教授；公众可从中国农业大学获得；该质粒上有两个T-DNA，一个包含选择标记基因hpt，另一个T-DNA上有多克隆位点，可以克隆目的基因)，形成重组质粒PSB130-F128。再用BamHI和SacI酶切pGEM-7Zf(+)-A168，回收含有Atl68基因的小片段，与BamHI和SacI酶处理的质粒PSB130-F128连接，构建得到质粒pSB130_FA168(图2)。采用冻融法将质粒pSB130_FA168直接转入根癌农杆菌农杆菌LBA4404，获得含有重组质粒pSB130-FA168的农杆菌LBA4404(pSB130-FA168)。农杆菌转化技术为公知技术。3、用pF128::Atl68嵌合基因转化玉米农杆菌LBA4404(pSB130-FA168)转化及玉米的再生过程如图2所示，具体步骤如下取授粉后10-12天的玉米杂交组合178X黄A(玉米自交系178和黄A:(《山西玉米品种志》，P386-387。贾明进等，中国农业出版社ISBN:7-109-07847-7，2003年5月。玉米自交系178和黄A由中国农业大学许启凤教授提供，公众可从中国农业大学获得)雌穗，灭菌后剥取幼胚，放于培养基A上(N6培养基，含2mg/L2，4_D，O.69g/LL-脯氨酸，100mg/L酪蛋白水解物，2%蔗糖)。农杆菌LBA4404(pSB130-FA168)在YEB固体培养基(含链霉素(Sm)125μg/mL，卡那霉素(Kan)100μg/mL)上培养两天后，在平板上刮菌，用适量D_inf培养基悬浮农杆菌，黑暗条件下以75rpm震荡培养2_4小时后备用。选取大小在I.5-2.Omm的幼胚放入2mL离心管中，加入不含农杆菌的D-inf培养基，浸泡并冲洗2次后，倒去剩余培养基，加入OD600为O.3-0.4的农杆菌LBA4404(pSB130-FA168)悬浮液，侵染IOmin左右。将侵染过的幼胚放在滤纸上吹干后，移入D-共培养培养基，22°C暗培养3天。将共培养3天后的幼胚在含1/1000噻孢霉素(Cef)的无菌水中洗三次，然后用滤纸吸干，转入含250mg/LCef的D-共培养培养基上，25°C暗处恢复培养7天；将恢复培养后的幼胚转移到D-筛选培养基上，2周继代一次，共筛选三轮，潮霉素浓度依次为10、15、20mg/mL。6周后，将抗性愈伤转移到D-恢复培养基上，28°C条件下暗培养2周；然后转到D-诱导培养基上暗培养。2周后，将愈伤组织转到D-分化培养基上，在光照周期为亮/暗=16小时/8小时，28°C条件下培养，每两周继代一次。将发生绿芽的愈伤组织切分，当小植株长到23cm高时，转移进三角瓶中(含生根培养基)继续培养。34叶期且根系较发达时，将小苗移栽花盆中，外罩塑料袋保温保湿。57天后，去掉塑料袋，在温室中培养，直至开花结实。该步骤中所用的培养基组成如下D基本培养基N6培养基大量元素+B5培养基微量元素+D有机物+100mg/L肌醇+0.5g/L水解干酪素+0.7g/LL-脯氨酸D有机物100X母液浓度氯化胆碱9.7mg/L核黄素4.89mg/L生物素10.016mg/L叶酸4.85mg/L烟酸19.94mg/LVBl47.222mg/LD-泛酸钙10.0mg/LVB619.94mg/LVB120.0135mg/L对氨基苯甲酸4.94mg/LD-inf培养基D基本培养基附加:2，4_D2mg/L,68.4g.L—1蔗糖，36g.L—1葡萄糖，100μM乙酰丁香酮(AS)，pH5.2οD-共培养培养基D基本培养基附加硝酸银O.85mg·L_\半胱氨酸300mg·L_S100μMAS,MESO.5g·Λ2，4-2mg/L，30g·L—1蔗糖，凝胶3g·ΛpH5.8。D-筛选培养基D基本培养基附加硝酸银0.85π^·ΛMESO.5g·L—1，Cef250mg·L-1,Hyg10_20mg·L-1,2,4-D2mg/L,30g·L-1鹿糖，琼脂8g·L1,pH5.8。D-恢复培养基D基本培养基附加硝酸银O.85mg·L—1，MESO.5g·L1，Cef250mg·L1,2,4-D0.4mg/L,6-BA2mg/L,30g·L1鹿糖，凝胶3g·L\pH5.8。D-诱导培养基D基本培养基附加2，4-DO.4mg/L,6-BA2mg/L,50g-Γ1蔗糖，琼脂8g·λρΗ5.8οD-分化培养基D基本培养基附加30g·L-1蔗糖，琼脂8g·L1，pH5.8。生根培养基MS培养基+NAAO.5-1.Omg1714、转基因玉米基因组DNA的PCR检测提取RO代(转基因当代植株)玉米基因组DNA，PCR扩增Atl68基因，引物Atl68P3:5'-ATGGGTTATTGGAAGTCGAAGG-3',Atl68P45'-TCAAGCCTTTTGTGGCGCAGCC-3'PCR反应体系如下成分_体积_植物基因组DNA(0.51.0μLPgW2XTaqMasterMix0.5μΕ3’引物(ΙΟμΜ)0.5pL5’引物(ΙΟμΜ)0.5pLddH20补足至20μL扩增条件为95°C，变性Imin;55°C，退火O.5min;72°C，延伸O.5min;扩增循环数30;72°C，再延伸IOmin;取适量PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测，扩增片段长度约500bp。其余产物_20°C保存。PCR扩增结果表明被检的10株RO代植株，有9株均扩增得到Atl68基因，而野生型植株未检测出(图3)。图3中，M为D2000Plus(GenStar)，ck_为玉米杂交组合178X黄A;其它为10株RO代植株的编号。5、PCR检测Tl代玉米植株Atl68基因和抗性基因hpt的分离将RO代PCR检测阳性的玉米植株自交，获得Rl代种子，种植，提取Rl代植株叶片基因组DNA，分别用Atl68引物(Atl68P3和Atl68P4)和hpt引物进行PCR扩增Atl68基因和抗性基因hptοhpt引物为hptPl5'-TCGGCTCCAACAATGTCCTG-3'和hptP25'-CGGTCGGCATCTACTCTATTCC-3'，反应体系同步骤4，hpt基因扩增条件为95°C，变性Imin;52°C，退火O.5min;72°C，延伸O.5min;扩增循环数30;72°C，再延伸IOmin;取适量PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测，扩增片段长度约500bp。其余产物_20°C保存。结果显示，Rl代植株中目的基因和选择标记基因发生分离，获得了13株只含有目的基因，没有抗性基因的转基因植株，表明利用双-T载体系统是获得Marker-free转基因玉米的一个可行途径。然后选择Rl代转基因植株进行加代种植，对每代植株进行PCR检测，通过后代基因分离，选出无抗性标记基因且目的基因(Atl68基因)纯合的株系，目前已经得到R4代植株。其中，部分Rl代植株PCR检测结果如表I所示。表I.部分Rl代植株PCR检测结果权利要求1.培育高赖氨酸含量和/或高蛋白质含量的转基因植物的方法，包括如下步骤将Atl68基因导入目的植物中，得到具有如下1)-3)中至少一种性状的转基因植物1)赖氨酸含量和蛋白质含量均高于所述目的植物；2)赖氨酸含量高于所述目的植物；3)蛋白质含量高于所述目的植物；所述Atl68基因编码序列表中序列2所不蛋白质。2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述基因的编码序列是序列表中序列I的第1-507位核苷酸。3.根据权利要求I或2所述的方法，其特征在于所述基因通过权利要求7所述的Atl68基因表达盒或权利要求7所述的Atl68基因表达载体导入目的植物。4.根据权利要求I或2或3所述的方法，其特征在于所述目的植物为禾本科作物，如玉米；所述转基因植物具有如下a)-c)中至少一种特性a)所述转基因植物种子中赖氨酸含量和蛋白质含量均高于所述目的植物的种子山)所述转基因植物种子中赖氨酸含量高于所述目的植物的种子；c)所述转基因植物种子中蛋白质含量高于所述目的植物的种子。5.以下1)-4)中的任一种物质在提高植物中赖氨酸含量和/或蛋白质含量中的应用1)编码Atl68的核酸分子，所述Atl68是序列表中序列2所示的蛋白质；2)所述At168；3)含有I)所述核酸分子的表达盒；4)含有I)所述核酸分子的载体。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述表达盒为权利要求7所述的Atl68基因表达盒，所述载体为权利要求7所述的Atl68基因表达载体。7.Atl68基因表达盒或含有所述Atl68基因表达盒的Atl68基因表达载体；所述Atl68基因表达盒含有Atl68基因和启动所述Atl68基因转录的启动子，所述Atl68基因编码序列表中序列2所不蛋白质。8.根据权利要求7所述的表达盒或表达载体，其特征在于所述启动子为谷子种子特异性启动子PF128。9.根据权利要求8所述的表达载体，其特征在于所述表达载体含有两个T-DNA区，一个T-DNA区含有选择标记基因表达盒，另一个T-DNA区含有所述Atl68基因表达盒。10.含有权利要求7或8所述Atl68基因表达盒的重组微生物或含有权利要求7-9中任一所述Atl68基因表达载体的重组微生物。全文摘要本发明公开了拟南芥At168基因在提高作物赖氨酸和/或蛋白质含量中的应用。其中的一个应用是培育高赖氨酸含量和/或高蛋白质含量的转基因植物的方法。该方法包括如下步骤将At168基因导入目的植物中，得到具有如下1)-3)中至少一种性状的转基因植物1)赖氨酸含量和蛋白质含量均高于所述目的植物；2)赖氨酸含量高于所述目的植物；3)蛋白质含量高于所述目的植物；所述At168基因编码序列表中序列2所示蛋白质。本发明的At168基因可以显著提高转基因作物种子中赖氨酸和蛋白质含量，可用于提高作用营养品质。文档编号C12N1/15GK102586320SQ20121006378公开日2012年7月18日申请日期2012年3月12日优先权日2012年3月12日发明者于静娟,常玉洁,敖光明,文柳璎,朱登云,申二丽,赵倩申请人:中国农业大学