专利名称：一种抗RNA病毒siRNA分子的设计方法
技术领域：
本发明属于RNA干扰技术领域，特别涉及一种抗RNA病毒siRNA分子的设计方法。
背景技术：
RNA类病毒种类很多，分布广泛，水生和陆生动物以及人类均有感染。如对水生养殖虾类造成严重威胁的桃拉病毒(TSV)、罗氏沼虾诺达病毒(MrNV)、传染性肌肉坏死病毒(IMNV)和对陆生动物包括人类危害巨大的流感病毒(Flu virus)、人甲型肝炎病毒(HAV)、艾滋病毒(HIV)，以及各种冠状病毒如严重急性呼吸综合征病毒(SARS-CoV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)等。由于RNA病毒在RNA的复制过程中，其错误修复机制的酶的活性很低，几乎是没有的，所以其变异很快；而疫苗是要根据病毒的固定基因或蛋白进行开发制作的，所以RNA病毒疫苗较难开发！RNA干扰技术，作为一种以短双链RNA(SiRNA)代替传统反义核酸的转录后基因沉默机制，自2002年被《Science》评为年度10大突破以来，已经被迅速而广泛地应用到了基因功能、基因表达调控机制等热门领域，并为疾病基因治疗、抗病毒感染开辟了新的途径。相对于传统基因治疗对基因水平上的敲除，整个流程设计更简便，作用更迅速，效果更明显，成为研究人员公认的高效特异、经济便捷的研究工具，在细胞水平和动植物体内均表现出高效特异的抗病毒能力。由于RNA干扰技术是转录后基因沉默机制，直接靶标是病毒转录产生的mRNA，那么对于RNA病毒尤其是正链RNA病毒而言，RNA干扰技术就可直接降解病毒基因，因此RNAi技术对于RNA类病毒的防治而言无疑是一个上佳之选。许多研究结果也证实，RNA干扰技术抗病毒领域取得了预期的成果。但是，由于抗病毒用siRNA仅仅是21个碱基对的短小序列，根据常规的小RNA设计原则，多数病毒基因组将产生成百上千个候选siRNA。尤其是像冠状病毒科成员那样的基因组巨大的RNA病毒，根据常规设计原则将需要花费大量的人力、物力，用来筛选在实际应用中能高效抗病毒的siRNA(由于目标RNA的空间结构等原因，导致许多理论上符合“有效”原则的siRNA在实际应用中无效或低效)。因此，如何有效缩小高效siRNA的筛选范围一直是RNA干扰技术研究人员探究的热点问题，也是关系到能否有效降低RNA干扰技术的研究与应用成本，使其最终能在生产实践中得到推广、应用的关键问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种抗RNA病毒siRNA分子的设计方法，该方法设计的siRNA分子，将在保证获得高效抗病毒siRNA的前提下，大幅缩小RNA分子筛选范围，显著降低抗病毒研究和应用成本，有利于RNA干扰技术在抗RNA病毒领域的推广和应用。本发明中一种抗RNA类病毒siRNA分子的设计方法，包括(I)在RNA病毒的基因组中选择序列保守的病毒酶的编码基因作为siRNA的靶标；
(2)利用siRNA设计软件生成抗RNA类病毒的小RNA分子；(3)根据siRNA设计规则，筛选理论上高效的siRNA用于实验研究。所述步骤(I)中的序列保守的RNA病毒酶为RNA依赖的RNA聚合酶(RdRP)。所述步骤(3)中的小RNA分子的抗病毒应用形式为，把小RNA分子构建成含RNA聚合酶III启动子U6的表达质粒。表I是shRNA在TGEV不同结构基因和RdRP基因上的靶向序列。其中，shPl和 shP2靶向TGEV RdRP基因，而shSl、shS2、shM、shNl和shN2分别靶向TGEV的不同结构基因；shT靶向与TGEV基因没有同源性的一段任意序列，用作显示shRNA干扰特异性的对照。表I
shRNA靶向序列
shPl5--GTACTGGGATCGCACATAT-3 ’
shP2 5'-GGCAAGAGCTCGTACAGTA-3， shS I 5'-CCAGTGGAATCTC ATTGAA-3 ’shS25'-CTAGTTCTGACTTTGTTCA-3J
shM 5'-GAAGTTGAAAGCAAGTAGT-3， shNl 5'-CAAGAAGGATGACAGTGTA-3 ’ shN2 5'-GGATGACAGTGTAGAACAA-3， shT5'-GACTTCATAAGGCGCATGC-3，我们通过对RNA病毒一TGEV进行细胞水平的RNA干扰研究发现，在分别靶向病毒RdRP基因和结构蛋白基因的siRNA中，两个靶向RdRP的小RNA表现出远远高于其他siRNA的抗病毒效果。随后在小型猪体内水平进行的抗病毒应用研究，进一步证实了这两个siRNA分子抗病毒的高效性和特异性。有益效果本发明把siRNA的作用靶标锁定在RNA依赖的RNA聚合酶，有两个意义(I)RdRP保守程度高，对于容易变异的RNA病毒而言很重要，因为根据Genbank中的序列设计的siRNA，有可能靶向的病毒本身在该处出现了序列变异，而研究表明，即使I个碱基的变化都会导致siRNA的抗病毒效果大幅降低。(2)部分RNA病毒如冠状病毒基因组巨大。以TGEV为例，得到的理论上“有效”的siRNA将大于1000个。如果把这些siRNA全部在细胞水平进行筛选研究，无疑将耗费大量的人力、物力。而根据本发明设计的siRNA分子，将在保证获得高效抗病毒siRNA的前提下，大幅缩小RNA分子筛选范围，显著降低抗病毒研究和应用成本，有利于RNA干扰技术在抗RNA病毒领域的推广和应用。
图I是CPE分析不同shRNA表达载体对TGEV的抑制作用。其中，m表示孔中部细胞，s表示孔边缘细胞；normal是阴性对照(未处理的正常细胞)；mock是阳性对照(只感染TGEV);图2是MTS法分析不同shRNA表达载体对ST细胞的保护作用。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。 实施例I 小RNA分子的设计与合成(I)分别选取TGEV结构蛋白和RdRP的编码基因；(2)利用软件生成抗TGEV的siRNA分子。(3)按照已公布的小RNA序列设计规则，选择理论上高效的siRNA分子，并构建成发卡型小RNA(shRNA)分子(表I)。(4) shRNA分子插入载体构建成含U6启动子的质粒表达载体。实施例2shRNA表达质粒转染ST细胞(I) ST细胞(2-3 X IO4个/孔)接入48孔板于完全DMEM中培养；(2)向转染试剂 TransFast transfection reagent 中加入 400 μ I 无 DNase 水，漩涡震荡溶解，_20°C保存；(3)溶解质粒DNA1. 2 μ g溶于300 μ I无血清无双抗培养基中；(4)室温溶化转染试剂并涡旋，取3. 6 μ I加入DNA/DMEM混合物中，涡旋混匀；室温孵育10-15分钟，形成转染复合物；(5)移去ST细胞中的培养基，加入转染复合物100 μ I/孔，继续于37°C 5% CO2培养箱中孵育I小时；向ST细胞中加入400 μ I无双抗完全培养基(含5% NBS);在37°C,5% CO2的培养箱中继续培养。实施例3TGEV感染ST细胞shRNA表达质粒转染ST细胞28h后移去细胞培养基，按200CCID5(I的量接种TGEV。40h后，分析细胞病变、细胞毒性(MTS)或抽提病毒RNA做定量RT-PCR检测。。实施例4细胞病变(CPE)分析因为TGEV复制增殖而导致的细胞病变非常典型，在普通显微镜下即可清楚显示是否出现了细胞病变以及病变的程度。所以，在对细胞转染shRNA表达载体并感染TGEV后，我们即可通过对细胞病变的观察，比较不同shRNA表达载体抑制病毒复制、抵抗细胞病变的能力。从图I中，我们可以看出，在接毒40h后，靶向RdRP基因的shP2和shPl表达质粒转染孔未出现细胞病变或只在培养孔边缘呈现微弱的疑似“病变”(说明=TGEV病变一般从孔边缘开始向孔中部漫延)，而其他靶向TGEV结构基因的shRNA干扰孔均出现了 TGEV特征性病变，只是病变程度不同。其中，shSl和shNl表达质粒的抗病变能力稍强，只在孔的边缘出现不同程度的病变，而shS2、shM和shN2干扰孔的病变程度较重，几乎整孔细胞出现病变。而且，shS2和shN2干扰孔的病变与非特异干扰孔shT的情况接近。CPE分析结果表明，大多设计的shRNA均显示了对TGEV在ST细胞中增殖的抑制作用，但是，靶向RdRP基因的shRNA对TGEV的抑制效果明显好于靶向结构基因的shRNA。实施例5
细胞毒性(MTS)试验ST细胞(1-1.5X104个/孔)按48孔板同样的方法在96孔板进行质粒转染和病毒感染试验，每孔质粒和病毒量分别为48孔板的一半。接毒36h后，按MTS试剂说明，向100μ I/孔培养基中加入20μ I/孔MTS后继续在37°C，5%C02的培养箱中孵育4小时。最后在492nm处测定各孔液体吸光值。通过MTS试验准确测量TGEV感染后各干扰孔的活细胞数量，可以准确显示各shRNA表达载体对ST细胞的保护程度，反映各自抗TGEV感染的能力。图2纵坐标表示不同shRNA干扰孔的吸光值。我们可以清楚地看出，靶向病毒RdRP基因的两个shRNA干扰孔的吸光值仅次于阴性对照(正常细胞)孔，而远远高于其他shRNA干扰孔的值。也就是说，靶向病毒RdRP基因的两个shRNA干扰孔中活细胞最多。显而易见，各shRNA表达载体干扰孔中活细胞的数量关系与CPE分析的结果基本一致。CPE和MTS的分析结果均证明，靶向病毒RdRP基因的shRNA的抗病毒效果显著好于靶向病毒结构基因。
权利要求
1.一种抗RNA病毒SiRNA分子的设计方法，包括 (1)在RNA病毒的基因组中选择序列保守的病毒酶的编码基因作为siRNA的靶标； (2)利用siRNA设计软件生成抗RNA病毒的小RNA分子； (3)根据siRNA设计规则，筛选理论上高效的siRNA用于实验研究。
2.根据权利要求I所述的一种抗RNA病毒siRNA分子的设计方法，其特征在于所述步骤(I)中的序列保守的RNA病毒酶为RNA依赖的RNA聚合酶。
3.根据权利要求I所述的一种抗RNA病毒siRNA分子的设计方法，其特征在于所述步骤(3)中的小RNA分子的抗病毒应用形式为把小RNA分子构建成含RNA聚合酶III启动子U6的表达质粒。
全文摘要
本发明涉及一种抗RNA类病毒siRNA分子的设计方法，包括(1)选择RNA病毒内部、序列保守的RNA依赖的RNA聚合酶作为siRNA的靶标；(2)利用siRNA设计软件生成抗RNA病毒的小RNA分子；(3)根据siRNA设计规则，筛选理论上高效的siRNA用于实验研究；(4)小RNA分子的抗病毒应用形式为含RNA聚合酶III启动子U6的表达质粒。运用本方法选择抗病毒靶标序列可显著提高获得高效抗病毒小RNA分子的几率，大幅缩小RNA干扰靶点的选择范围，提高工作效率，显著降低RNA干扰技术研究和应用成本。
文档编号C12N15/113GK102643815SQ20121006323
公开日2012年8月22日 申请日期2012年3月12日 优先权日2012年3月12日
发明者华修国, 周俊芳, 崔立, 房文红 申请人:中国水产科学研究院东海水产研究所