专利名称：γ-聚谷氨酸的谷氨酸非依赖性生产方法
技术领域：
本发明属于聚谷氨酸的生产方法，具体涉及一种Y-聚谷氨酸的谷氨酸非依赖性生产的新方法。
背景技术：
Y -聚谷氨酸(Poly-Y-glutamatic acid, Y-PGA),是一种由多种微生物产生的水溶性和可生物降解的聚氨基酸。聚谷氨酸是一种对人体和环境无毒害的新型天然高分子，其独特的结构特性赋予高度吸水性、良好的渗透性、生物相容性和生物可降解性，广泛应用于农业、医药、食品、化妆品等许多领域，是一种公认的极有发展潜力的绿色化学产品。 Y-聚谷氨酸的生产主要利用芽孢杆菌属的一些菌株，直接发酵生产。相对以石油衍生品为基础的聚合物，Y -聚谷氨酸合物能够通过可再生原料合成，具有相当大的市场潜力。Y-PGA生产方法分为两类一类是在发酵培养基中添加L-谷氨酸作为Y-PGA 合成的前体，由微生物吸收培养基中的谷氨酸，并利用其合成酶系将单体谷氨酸聚合产生 Y -PGA,即谷氨酸依赖性合成方法，例如专利CN1644677A所述的Y -PGA生产方法；另外一类是在发酵培养基中不添加L-谷氨酸，有微生物直接将培养基中的糖质原料转化为内源性谷氨酸，再由自身的合成酶系聚合产生Y-PGA，这称为从头合成，即谷氨酸非依赖性合成方法，也称为从头合成，例如专利CN 1932007A所述的Y -PGA生产方法。两种生产方法中，Y -聚谷氨酸生产水平很大程度上受到培养基成分和培养条件的影响。许多研究已经确定了生产Y-PGA的最佳培养基成分。通常使用的培养基包括碳源，氮源和无机盐类，L-谷氨酸依赖性合成方法需要加入大量外源谷氨酸作为聚谷氨酸的前体。一般来说合适的碳源通常是葡萄糖，甘油，麦芽糖，柠檬酸，果糖，蔗糖，淀粉等，合适的氮源通常是氯化铵，硫酸铵，蛋白胨，酵母膏等。已有大量文献报道了谷氨酸依赖性合成方法生产聚谷氨酸的方法，包括培养基组分的优化，间歇发酵和流加发酵方法，Y-PGA的提取分离方法等。流加发酵的方式包括流加糖类为细胞生长和聚合物合成提供能量(参见专利CN1556859A);流加L-谷氨酸前体增加聚谷氨酸产量。目前的发酵生产聚谷氨酸的方法中，培养基中需要添加谷氨酸作为前体导致了高的原料成本，成为工业化生产和应用的主要瓶颈之一。而不添加谷氨酸的发酵过程，只能产生低浓度的聚谷氨酸，过低的生产效率不适合工业化规模的生产。因此，通过开发新的发酵生产方法，以较为廉价的底物替代L-谷氨酸，生产高浓度的Y-聚谷氨酸，成为市场的新需求。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种Y -聚谷氨酸的谷氨酸非依赖性生产方法，能够以较为廉价的成本，生产高浓度的Y -聚谷氨酸。本发明方法所采用的技术方案包括如下步骤将芽孢杆菌属微生物接种到含有发酵培养基的发酵容器中，在有氧条件下培养，发酵过程中持续搅拌，向发酵培养基中加入草酸，使其产生Y-聚谷氨酸。草酸采用流加方式加入到发酵培养基中，在补料分批发酵条件下培养芽孢杆菌属微生物，使其产生Y-聚谷氨酸；当草酸浓度低于lg/L时，开始流加草酸溶液，使其维持到l_12g/L。其中芽孢杆菌属微生物选自具有Y-聚谷氨酸合成能力的枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌或巨大芽孢杆菌中的任意一种，优选枯草芽孢杆菌C10(Bacillus subtilis CIO)(保藏号 CGMCC No. 4924)或枯草芽孢杆菌 ZJU7 (Bacillus subtilis zju_7)(保藏号 CGMCC No. 1250)菌株。本方法中使用的发酵培养基不包含谷氨酸。草酸可由草酸盐代替。在补料分批发酵过程中机酸是以间歇流加的方式加入发酵培养基。向发酵培养基中流加草酸的同时也可以流加氮源，使氮源浓度维持在I 10g/L，其中氮源选自氯化铵，硫酸铵、蛋白胨或酵母膏中的任意一种。本发明的方法中，草酸添加到培养基中，其作用是作为Y-PGA合成的刺激剂，刺激菌体细胞产生高浓度的Y-PGA，Y-PGA的前体谷氨酸来自于菌体自身合成，发酵过程中，草酸被菌体吸收并分解为二氧化碳。因此，该方法同时也为草酸或草酸盐提供了一种新的用途。发酵培养基中除草酸之外的其他成分包括现有用于生产Y-聚谷氨酸的氮源、碳源和无机盐。如使用葡萄糖、蔗糖、果糖、甘油、淀粉作为碳源；使用氯化铵、硫酸铵、蛋白胨、 牛肉膏、酵母膏、玉米粉等作为氮源；也包括菌体生长所需的各种无机盐如铁盐，镁盐，钾盐,钙盐,磷酸盐。本发明所说的“草酸采用流加方式加入到发酵培养基中，在补料分批发酵条件下培养芽孢杆菌属微生物，使其产生Y -聚谷氨酸”是指在发酵过程中，不断向培养基中加入草酸，使草酸的浓度维持在一定的范围内，即不断的对草酸进行补料。“间歇流加的方式”是指加入草酸的时候是时断时续的加入或者不是以恒速加入。本发明和现有技术相比具有以下有益效果本发明方法使微生物持续产生高浓度Y -聚谷氨酸，而所使用的培养基中避免了添加昂贵的谷氨酸，合成所需要的底物为廉价糖质原料和草酸，具有成本优势。使用本发明的方法生产聚谷氨酸，通过向发酵培养基中流加草酸使其维持在一定的浓度范围内，一方面避免了草酸对于菌体细胞的毒性和生长抑制作用，另一方面促使菌体持续不断合成Y-PGA，显著增加Y-PGA产量，其浓度最高可达到37. 5g/L。本发明的方法周期短，易于操作，可用于工业规模的生产。
图I是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ClO在IOL发酵罐中添加草酸分批发酵过程曲线图。图2是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ClO在IOL发酵罐中补料分批发酵过程曲线图(间歇流加草酸溶液)。图3分批发酵和补料分批发酵的结果比较图。
具体实施例方式以下结合说明书附图和实施例对本发明作进一步说明，但不用来限制本发明的范
4
α -酮戊二酸延胡索酸
琥珀酸
13. 6 8. 2 12. 8 25. 3 11. 5 13. 6 15. 4 8. 2
3. 486
2.814
3.108 5. 958
2.319
3.221 3. 745 2. 172实施例I是在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ClO中一次性加入各种有机酸 (分批发酵方式)产生的Y-PGA产量，其中加入草酸的Y-PGA产量最高。实施例2实施例2与实施例I的区别在于步骤3)中的发酵培养基组成葡萄糖80g/L，氯化铵18g/L，KH2P04 O. 5g/L， MgS04 · 7H20 O. 5g/L, FeC130. 05g/L, MnS04 · H20 0. lg/L, CaC120. I lg/L, pH 7。除上述组围。实施例IY-聚谷氨酸的谷氨酸非依赖性生产方法，包括以下步骤步骤I)菌株活化将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ClO在平板上划线, 37°C，培养12h。平板培养基组成为蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，氯化钠5g/L，葡萄糖IOg/ L，琼脂 15g/L，pH 7。步骤2)种子的制备将活化的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ClO菌种挑取接入液体种子培养基，装液量为250ml三角瓶20ml培养基，37°C，200rpm (转/分钟)，振荡培养12h。上述的种子培养基组成蛋白胨10g/L,牛肉膏5g/L,氯化钠5g/L,葡萄糖10g/L, pH 7。步骤3)摇瓶发酵将制备好的种子液按5%的比例接入发酵培养基，装液量为 250ml三角瓶30ml培养基，37 °C，200rpm,振荡培养36h。上述的发酵培养基组成葡萄糖120g/L，氯化铵18g/L，KH2P04 5g/L，MgS04 ·7Η20 O. 5g/L,FeC13 0. 05g/L，MnS04 · H20 0. lg/L, CaC120. I lg/L, pH 7。除上述组分外，该发酵培养基中添加草酸、琥珀酸、苹果酸、柠檬酸、草酰乙酸、异柠檬酸、α -2 ‘酮戊二酸或延胡索酸中的任意一种，添加量为10g/L。步骤4)产物分离提取发酵结束后离心除去发酵液中的菌体，上清液中加入4倍体积甲醇，4°C放置lh，离心收集沉淀，冷冻干燥后得到白色γ-PGA。不同种类草酸对细胞生长和Y-PGA产量的影响见表I。实验结果表明，添加10g/L草酸，产生最高浓度的Y-PGA，Y-PGA产量达到25. 3g/ L0表I草酸对细胞生长和Y -PGA产量的影响
草酸(10g/L)细胞干重(g/L)Y-PGA (g/L)
平果fe 梓檬酸草酸草酰乙异柠檬分外，该发酵培养基中另外添加草酸，取6种添加量(分别在6个实验罐中)，添加量分别为 0g/L，5g/L，10g/L、12g/L、15g/L、20g/L。其余步骤特征都与实施例I相同。草酸添加量对细胞生长和Y -PGA产量的影响见表2。实验结果表明，随着加入草酸浓度的增加，产生的Y-PGA浓度增加，最终当加入 12g/L草酸的条件下，产生最高浓度的γ-PGA，达到27. lg/L，当草酸浓度超过15g/L时严重抑制了菌体的生长和Y -PGA产生。表3草酸添加量对聚谷氨酸产量的影响
权利要求
1.Y-聚谷氨酸的谷氨酸非依赖性生产方法，其特征在于，其过程如下将芽孢杆菌属微生物接种到含有发酵培养基的发酵容器中，在有氧条件下培养，发酵过程中持续搅拌；向发酵培养基中加入草酸，使其产生Y-聚谷氨酸。
2.根据权利要求I所述的Y-聚谷氨酸的谷氨酸非依赖性生产方法，其特征在于，所述的草酸采用流加方式加入到发酵培养基中，在补料分批发酵条件下培养芽孢杆菌属微生物，使其产生Y-聚谷氨酸。
3.根据权利要求2所述的Y-聚谷氨酸的谷氨酸非依赖性生产方法，其特征在于，当草酸浓度低于lg/L时，开始流加草酸溶液，使其维持到l_12g/L。
4.根据权利要求3所述的Y-聚谷氨酸的谷氨酸非依赖性生产方法，其特征在于，所述的芽孢杆菌属微生物选自枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌或巨大芽孢杆菌中的任意一种。
5.根据权利要求4所述的Y-聚谷氨酸的谷氨酸非依赖性生产方法，其特征在于，所述的枯草芽孢杆菌选用枯草芽孢杆菌CIO (Bacillus subtilis CIO)(保藏号CGMCC No. 4924) 或枯草芽抱杆菌 ZJU7 (Bacillus subtilis z ju_7)(保藏号 CGMCC No. 1250)菌株。
6.根据权利要求5所述Y-聚谷氨酸的谷氨酸非依赖性生产方法，其特征在于，向发酵培养基中流加草酸的同时也流加氮源，使氮源浓度维持在I 10g/L。
7.根据权利要求6所述Y-聚谷氨酸的谷氨酸非依赖性生产方法，其特征在于，所选的氮源选自氯化铵、硫酸铵、玉米粉、牛肉膏、蛋白胨或酵母膏中的任意一种。
8.根据权利要求1-7任一权利要求所述的Y-聚谷氨酸的谷氨酸非依赖性生产方法， 其特征在于，所述草酸由草酸盐代替。
全文摘要
本发明公开了提供了一种γ-聚谷氨酸的谷氨酸非依赖性生产方法。现有技术生产的γ-聚谷氨酸浓度低的、成本高。本发明在培养需氧芽孢杆菌(Bacillus sp.)过程中，通过向培养基中流加有机酸或有机酸与氮源的混合物，促使菌体将糖质原料和有机酸转化为γ-聚谷氨酸，培养基中不需要另外添加前体物L-谷氨酸。本发明生产γ-聚谷氨酸的发酵方法周期短，易于操作，可用于工业规模的发酵，具有很好的应用价值。
文档编号C12R1/07GK102586354SQ20121006269
公开日2012年7月18日 申请日期2012年3月9日 优先权日2012年3月9日
发明者张慧莉, 徐志南, 蔡谨, 黄磊 申请人:浙江德清汇宁生物科技有限公司