专利名称：一种副溶血性弧菌检测试剂盒及其检测方法
技术领域：
本发明属于生物检测领域，具体地说涉及一种副溶血性弧菌的检测试剂盒及其检测方法，可广泛应用于各级食品药品监督管理机构、出入境检验检疫机构、疾病预防控制机构等对水产食品中的副溶血性弧菌的检测和监测。
背景技术：
副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus, Vp)是一种嗜盐性细菌,隶属弧菌科中的弧菌属，1950年在日本发生的一次食物中毒事件中发现并分离得到。它主要存在于海水、鱼、虾、贝类和腌醉制生食动物性海产品中。其引起的食物中毒，临床上以腹痛、呕吐、腹泻等为主要症状。目前，在我国沿海城市副溶血性弧菌引起的食物中毒在细菌性食物中毒事件中所占比例已经超过沙门氏菌、大肠杆菌0157:H7、金黄色葡萄球菌等，位居首位。而且副溶血性弧菌所致食物中毒也呈世界性分布，发病呈上升趋势。美国和欧盟等国家对进口养殖鱼类，虾类以及其相关加工制品都要求副溶血性弧菌不得检出。因此，检测水产品中的副溶血弧菌对于食物中毒的预防、水产食品的安全监测及市场健康有序运行具有重要意义。目前，针对副溶血性弧菌的检测大多都采用PCR、实时定量PCR、DNA探针和ELISA等方法，不仅有成本高、耗时长、灵敏度低等缺点，而且无法实现高通量处理样品，不能满足诸多食品安全监测机构的需要。因此，副溶血性弧菌的检测迫切需要发展快速、简便、可靠、实用、高灵敏度和高特异性的高通量检测方法。环介导等温扩增(Loopmediated isothermal amplification, LAMP)技术是 Notomi于2000年报道的一种等温核酸扩增方法。它利用6种特异性引物，在链置换活性的 DNA聚合酶的作用下完成DNA的体外扩增，15min-lh之内扩增效率就可达到109-1010个拷贝，其灵敏度是普通PCR方法的10-100倍。LAMP法不需要昂贵的实验设备，只需要60-65°C 的水浴即可完成，且通过肉眼观察浊度或颜色变化就可判读结果。具有简便、快速、成本低廉、高灵敏度等特点。该技术在临床疾病的诊断、流行性细菌或病毒的定性定量检测以及动物胚胎性别鉴定等方面得到广泛应用。目前，LAMP技术应用于副溶血性弧菌的检测已有相关报道，检测基因涉及到tlh，tdh，trh，toxR基因。虽然该技术仅需Ih内就可以完成检测， 但是应用在对实际样品中的副溶血性弧菌靶基因诊断时，繁杂的样品前处理过程影响了该技术的检测效率。免疫磁分离(Immonumagnetic Separation, IMS)技术是一种用来做细胞分离和微生物富集捕获的样品前处理方法。頂S可以有效的富集目的细胞，并有效的去除食品样品或临床样品中的抑制因子，缩短增菌时间，是有效的样品前处理方法。与单纯的LAMP检测技术相比，采用MS进行样品液前处理，可以有效的富集目的菌，缩短增菌时间，去除食品样品中的环境抑制因子，为后续的检测提供便利、节省时间、提高灵敏度。目前，采用免疫富集和LAMP技术联合使用的报道多见于病毒类的研究，如甲型流感病毒。目前尚未有采用MS-LAMP对副溶血性弧菌进行高通量检测的相关报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种副溶血性弧菌的检测试剂盒，使其具有操作简单、快速、特异性好、灵敏度高等优势，为各级食品安全检测机构实现对副溶血性弧菌的快速、准确检测和监测提供技术支持。本发明需要解决的技术问题在于提供一套副溶血性弧菌的检测方法，该方法结合免疫学方法和分子技术，可直接从复杂样品中检测副溶血性弧菌。本发明需要解决的技术问题还在于，提供一套基于副溶血性弧菌tlh基因的环介导等温扩增技术的特异性引物，为副溶血性弧菌检测试剂盒的高灵敏度和高特异性提供保障。为了实现上述目的，本发明采用以下技术措施这种副溶血性弧菌的检测试剂盒，其特征在于它包括(I)免疫富集反应体系组分偶联了副溶血性弧菌多克隆抗体的直径I. 0-2. 8μπι免疫磁珠；含O. 02% w/v叠氮化钠、以及含O. 1% w/v牛血清白蛋白的pH为7. 4的磷酸盐缓冲液组成的免疫磁珠保护液；含有1% w/v牛血清白蛋白的pH7. 4为磷酸盐缓冲液的免疫磁珠工作液；含三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液O. 05mol/L、pH为6. 4免疫富集反应液；含0—0. I % Tween-20免疫富集洗脱液。(2)环介导等温核酸扩增体系组分反应缓冲液由20mM KCl ;20mM(NH4)2S04、40mM Tris、8mM MgS04、0. 2% Tween-20组成的反应缓冲液；含 IOmM dNTP ；20μΜ FIP/BIP、20 μ MLF/LB ;8000U/ml Bst DNA 聚合酶;
200 μ M羟基萘酚蓝。(3) 一套基于副溶血性弧菌tlh基因的环介导等温扩增技术的特异性引物两条外引物F3、B3，、两条内引物FIP、BIP，两条环引物LF，LB。所述的两条外引物F3、B3、两条内引物FIP、BIP、两条环引物LF，LB其序列分别如下F35，-GATACTCACGCCTTGTTCGA-3’
B35，-TGCAACATAGCGGTGAGTTG-3，
FIP5，-CGACAGACGATGAGCGGTTGAT-CCGAAGAGCACGGTTTCG-3
BIP5，-CCACGCATTGCGCTCTGAGT-TGTTGTTGGATGCGTGACAT-3
LF5，-AGGATCGCTCGCGTTCA-3，
LB5，-CAGCGTCTGGTGCTGAGAAG-3’。所述的一种副溶血性弧菌的检测试剂盒，其检测方法为(I)取免疫磁珠溶液不少于O. 75mg,经磁力架富集分离去除免疫磁珠保护液，等体积加入免疫磁珠工作液，备用；(2)在反应管中加入免疫富集反应液和待检测样品共50ml，再加入备用的免疫磁珠，洗脱管中加入免疫富集洗脱液35ml，采用pathatrix 仪器进行免疫富集，反应结束后， 加入100 μ I PBS重悬免疫磁珠，备用；(3)取免疫磁珠和菌体细胞的复合物100μ l，5000rpm/min，离心lmin，去除上清液，加入50 μ I去离子水，95°C，煮沸5min，热裂解法提取DNA后置于4°C冰箱备用。
(4)按反应缓冲液，12. 5 μ I ；10mM dNTP, I μ I ；20μΜ F3/B3，0. 5μ I ；20μΜ FIP/ ΒΙΡ,2μ I ；20μΜ LF/LB，I μ I ;8000U/ml Bst DNA 聚合酶，I μ I ;200 μ ΜΗΝΒ，2 μ I ;DNA 模板，2μ I配置反应体系实现环介导等温核酸扩增；反应体系反应温度为64°C，时间为 30min,85°C灭活5min ;最后用肉眼观察反应后颜色变化,并根据潘冬色卡判定结果。根据以上技术方案提出的这种副溶血性弧菌的检测试剂盒及其检测方法同现有技术相比，通过将免疫富集和环介导等温扩增技术相结合，从样品液制备到判定结果耗时 70min，检测灵敏度可达到3. 791og CFU/25g。具有操作过程简便、耗时短、特异性强、灵敏度高等特点。该方法能有效的分析样品带菌状态，能实现高通量处理样品，大大节省劳动力， 可广泛应用于各级食品药品监督管理机构、疾病预防控制实验室等对水产品和临床病人胃肠道呕吐物、血液、粪便等样品中副溶血性弧菌的富集捕获和后续检测。
图I为MBs-LAMP反应检测副溶血性弧菌的浊度结果试管展示图；图2为MBs-LAMP反应检测副溶血性弧菌的电泳结果示意图；图3为MBs-LAMP灵敏度检测的电泳结果示意图。图I中1-副溶血性弧菌阳性结果2-副溶血性弧菌阴性结果3-白色沉淀。图2中M-Marker I-副溶血性弧菌阳性结果2_副溶血性弧菌阴性结果3-以水作为空白对照的结果图3 中M_Marker 阳性对照；1 :起始接种量为 8. 791og CFU/25g ;2_7. 791og CFU/25g；3 6.791og CFU/25g；4 :5.791og CFU/25g；5 :4.791ogCFU/25g；6 :3.791og CFU/25g ；7 2. 791og CFU/25g ；C :空白对照；9 :阴性对照
具体实施例方式本发明提出的试剂盒工作原理是本试剂盒采用免疫富集和环介导等温扩增技术相结合的方法检测副溶血性弧菌。采用副溶血性弧菌多克隆抗体，制备免疫磁珠，采用免疫学方法进行实际样品中副溶血性弧菌的初筛，再根据其种属特异性基因tlh基因设计LAMP 特异性引物，在核酸水平进行分子手段的检测，从而有效的避免了单纯的免疫学方法或者分子方法检测假阳性或漏检情况，是副溶血性弧菌快速检测的新发展方向。以下结合附图进一步阐述本发明，并给出本发明的实施例。这种副溶血性弧菌的检测试剂盒，其特征在于它包括(I)免疫富集反应体系组分偶联了副溶血性弧菌多克隆抗体的直径I. 0-2. 8 μ m免疫磁珠；含O. 02% w/v叠氮化钠、以及含O. 1% w/v牛血清白蛋白的pH为7. 4的磷酸盐缓冲液组成的免疫磁珠保护液；含有1% w/v牛血清白蛋白的pH为7. 4的磷酸盐缓冲液的免疫磁珠工作液；0. 05mol/ L、pH为6. 4的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液作为免疫富集反应液；含0—0. I % Tween-20 的pH为7. 4的磷酸盐缓冲液组成的免疫富集洗脱液。(2)环介导等温核酸扩增体系组分反应缓冲液由20mM KCl ;20mM(NH4)2S04、40mM Tris、8mM MgSO4^O. 2% Tween-20 组成；10mM dNTP ;20 μ M F3/B3 ;20 μ M FIP/BIP ；20 μ MLF/LB ；8000U/ml Bst DNA 聚合酶；200 μ M羟基萘酚蓝。(3) 一套基于副溶血性弧菌tlh基因的环介导等温扩增技术的特异性引物两条外引物F3和B3、两条内引物FIP和BIP、两条环引物LF和LB。所述的两条外引物F3和B3、两条内引物FIP和BIP、两条环引物LF和LB其序列分别如下F35，-GATACTCACGCCTTGTTCGA-3’
B35，-TGCAACATAGCGGTGAGTTG-3，
FIP5，-CGACAGACGATGAGCGGTTGAT-CCGAAGAGCACGGTTTCG-3
BIP5，-CCACGCATTGCGCTCTGAGT-TGTTGTTGGATGCGTGACAT-3
LF5，-AGGATCGCTCGCGTTCA-3，
LB5，-CAGCGTCTGGTGCTGAGAAG-3’。所述的这种副溶血性弧菌的检测试剂盒，其检测方法为(I)取免疫磁珠溶液不少于O. 75mg，经磁力架富集分离去除免疫磁珠保护液，等体积加入免疫磁珠工作液，备用。(2)在反应管中加入免疫富集反应液和待检测样品共50ml，再加入备用的免疫磁珠，洗脱管中加入免疫富集洗脱液35ml，采用Pathatrix 仪器进行免疫富集，反应结束后， 加入100 μ I PBS重悬免疫磁珠，备用。(3)取免疫磁珠和菌体细胞的复合物100μ l，5000rpm/min，离心lmin，去除上清液，加入50 μ I去离子水，95°C，煮沸5min，热裂解法提取DNA后置于4°C冰箱备用。(4)按反应缓冲液，12. 5 μ I ；10mM dNTP, I μ I ；20μΜ F3/B3，0. 5μ I ；20μΜ FIP/ ΒΙΡ, 2 μ I ;20 μ M LF/LB, I μ I ；8000U/ml Bst DNA 聚合酶，I μ I ;200 μ M HNB, 2 μ I ；DNA 模板，2μ I配置反应体系实现环介导等温核酸扩增；反应体系反应温度为64°C，时间为 30min,85°C灭活5min ;最后用肉眼观察反应后颜色变化,并根据潘冬色卡判定结果。实施例I下面对本发明的具体内容作进一步的说明一、采用副溶血性弧菌的多克隆抗体，利用EDC/NHS活化法将所述副溶血性弧菌的多克隆抗体偶联在表面包被着羧基的磁珠上，获得制备副溶血性弧菌的免疫磁珠。羧基磁珠偶联副溶血性弧菌多克隆抗体的具体操作如下取Iml磁珠于2ml的离心管中，用25mM的2_ (N-吗啉代)乙磺酸MES (pH5)洗涤磁珠两次。再加入500 μ I EDC (碳二亚胺，50mg/ml)和500 μ I NHS (N-羟基琥珀酰亚胺， 50mg/ml),混合均勻，室温反应30min。将200 μ 16. 39mg/ml的多抗加入到经过活化的磁珠， 再加入MES补足1ml，混合均匀，室温下培养3h。加入Iml封闭液(含有I %牛血清白蛋白 BSA的PBS)，封闭未反应位点30min。加入Iml PBS洗涤两次。加入保存液(含O. 02%叠氮化钠NaN3,0. I %牛血清白蛋白BSA的PBS) I. 5ml，配置成终浓度为15mg/ml的免疫磁珠溶液，4 °C冰箱保存备用。二、重悬已偶联多抗的免疫磁珠，将其加入到反应管中，再加入反应液和样品液， 在洗脱管中加入洗漆液，米用Pathatrix 系统进行免疫富集。应用制备的免疫磁珠对副溶血性弧菌进行富集捕获，步骤如下(I)取免疫磁珠溶液100 μ I于灭菌的2ml离心管中，置于磁力架上，静置2min，待磁珠完全吸附在带磁场的一侧后，去除上清液，再加入同样体积的PBS，混合均匀，于垂直混合仪上洗漆5min。(2)取 Tris-HCl (pH 6.4)50ml 置于一次性样品管(sample tube)中，加入 Iml 试验用菌液和100 μ I磁珠，在洗脱管(elution tube)中加入35ml的PBST (PBS+0. 05% Tween-20),将一次性套装(consumable)用无菌管路连接。(3)打开Pathatrix 仪器，待显示“Pathatrix ”时，即可取下反应槽(cartridge), 将已安装好的一次性套装放置在反应槽中，按下红色按钮，15min后，待红绿灯交替显示时， 再按一次，约Imin后完成IMS。(4)取下整套装置，取出洗脱管，置于磁力管架上，待磁珠被吸附在一侧时，去除上清液，加入200 μ I PBS,保存在-20°C。三、模板DNA制备取免疫磁珠和菌体细胞复合物100 μ l,5000rpm/min,离心2min，去除上清液。加 AddH2O 50μ 1，混合均匀，95°C，温浴5min，取出备用。四、LAMP反应(I)配置 LAMP 反应缓冲液IOOmM 的 KCl 溶液 200 μ I，IOOmM 的(NH4) 2S04 溶液 200 μ I, IOOmM pH 8· 8 的 Tris-base 溶液 400 μ 1，IM 的 MgSO4 溶液 18 μ 1，加入 O. 2 % 的 Tween-20,再加入180 μ I ddH20,混合均勻，备用。(2)配置 LAMP 反应体系反应缓冲液，12. 5 μ I ；10mM dNTP, I μ I ;20 μ M F3/B3， O. 5 μ I ;20 μ M FIP/BIP, 2 μ I ;20 μ M LF/LB, I μ I ；8000U/mL BstDNA 聚合酶，I μ I ;200 μ M ΗΝΒ，2μ I ;0嫩模板，2 4 I。(3)设定反应温度为 64°C，30min ;85°C，5min。五、LAMP反应产物的检测(I)浊度变化观察法采用Mg2+终浓度为9mM-10mM进行LAMP反应。结束后，直接采用肉眼观察浊度变化，或者将反应管采用4000-6000rpm/min，离心lmin，观察离心管底部的白色沉淀。有白色沉淀者即为副溶血性弧菌阳性，否则为副溶血性弧菌阴性(见图I)。从图UMBs-LAMP反应检测副溶血性弧菌的浊度结果可以看出左边的试管内产生白色沉淀，即表示阳性；右边的试管内不产生沉淀即为阴性。(2)羟基萘酚蓝(HNB)预染色法20mM的HNB保存在4°C冰箱内，备用。将其稀释100倍，成200 μ M，取2 μ I加入到反应体系。反应后观察颜色变化。将LAMP的颜色反应结果与潘冬色卡进行对比，副溶血性弧菌阴性和阳性反应与潘冬色卡数字值的对应结果见表I。表中所列的每个数值代表潘冬色卡上相应的颜色，以此作为基准，将HNB染色结果可能出现的副溶血性弧菌阳性和阴性反应管的颜色与之比对，大量实验数据表明如表中所列编号的代号2718U,2728U, 278U, 279U, 283U, 284U, 285U, 291U, 292U, 290U, 291U, 292U, 2905U, 2915U, 2925U, 297U, 298U, 299U, 2975U, 2985U, 2995U 均为副溶血性弧菌 HNB 染色阳性结果；编号代号为243U, 244U, 245U, 250U, 251U, 252U, 256U, 2562U, 2572U,2562U,2572U,2563U,2567U,2577U,2573U,263U,264U,265U,2635U,2645U,2655U, 2665U均为副溶血性弧菌HNB染色阴性结果。
表I为MBs-LAMP反应检测副溶血性弧菌的HNB染色结果与潘冬色卡对比结果比对表
IMS-LAMP检测结果潘冬色卡对应色数字值
2718U, 2728 U, 278 U, 279 U, 283 U, 284 U, 285 U，291 U, 292 U, 290 U, 291 阳性U, 292 U, 2905 U, 2915 U, 2925 U，297
U, 298 U, 299 U, 2975 U，2985 U, 2995
U
243 U, 244 U, 245 U, 250 U, 251 U, 252 U, 256 U, 2562 U, 2572 U, 2562 U, 阴性2572 U, 2563 U, 2567 U, 2577 U，2573
U, 263 U, 264 U, 265 U, 2635 U, 2645 U, 2655 U, 2665 U(3)电泳检测配置2%琼脂糖凝胶,取LAMP反应液加入Loading buffer进行上样,选择100V电压，电泳30min，EB染色lOmin，照胶(见图2)。电泳结果呈现梯状条带即为副溶血性弧菌阳性，无条带则为副溶血性弧菌阴性。实施例2灵敏度检测将8. 791og CFU/ml的副溶血性弧菌培养液进行10倍的梯度稀释，取各稀释度 (I(T1-KTe)菌液各Iml接种于煮沸的虾体表面。待干后加入APW(碱性蛋白胨水)225ml， 低速拍打90s。取均质液25ml力口入至丨J 50ml离心管中，4000rpm离心5min,去除上清液, 加入Tris-HCl (pH6. 4) 50ml,加入免疫磁珠100 μ 1，洗脱管中加入35ml PBS (+0. 05 % Tween-20)，装好反应套装，进行免疫富集。在反应结束后，采用LAMP方法检测结果，观察颜色变化并采用电泳检测结果。电泳检测结果表明，LAMP可以检测到人工污染虾样的灵敏度为3. 791og CFU/25g(见图3)。采用HNB预染色法检测，可以明显的观察到第5管开始呈现阴性结果，与电泳检测结果一致(见表2)。因此，人工模拟副溶血性弧菌污染南美白对虾的样品时，IMBs-LAMP的检测副溶血性弧菌的灵敏度可达到3. 391og CFU/25g。表2. IMBs-LAMP灵敏度检测的HNB染色与潘冬色卡对比结果
权利要求
1.一种副溶血性弧菌的检测试剂盒，其特征在于它包括(1)免疫富集反应体系组分偶联了副溶血性弧菌多克隆抗体的直径I. 0-2. 8 μ m免疫磁珠；含O. 02% w/v叠氮化钠、以及含O. I % w/v牛血清白蛋白的pH为7. 4的磷酸盐缓冲液组成的免疫磁珠保护液；含有1% w/v牛血清白蛋白的pH为7. 4的磷酸盐缓冲液组成的免疫磁珠工作液；0. 05mol/L、 pH为6. 4的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液作为免疫富集反应液；含0—0. 1% Tween-20 的pH为7. 4的磷酸盐缓冲液作为免疫富集洗脱液；(2)环介导等温核酸扩增体系组分反应缓冲液由 20mM KCl ；20mM(NH4)2S04,40mM Tris、8mM MgS04、0. 2% Tween-20 组成的反应缓冲液；含 IOmM dNTP ；20μΜ FIP/BIP、20 μ MLF/LB ;8000U/ml Bst DNA 聚合酶; 200 μ M羟基萘酚蓝；(3)一套基于副溶血性弧菌tlh基因的环介导等温扩增技术的特异性引物两条外引物F3和B3、两条内引物FIP和BIP、两条环引物LF和LB。
2.如权利要求I所述的一种副溶血性弧菌的检测试剂盒，其特征在于所述的两条外引物F3和B3、两条内引物FIP和BIP、两条环引物LF和LB，其序列分别如下F35’ -GATACTCACGCCTTGTTCGA-3’B35’ -TGCAACATAGCGGTGAGTTG-3’FIP5 ’ -CGACAGACGATGAGCGGTTGAT-CCGAAGAGCACGGTTTCG-3BIP5 ’ -CCACGCATTGCGCTCTGAGT-TGTTGTTGGATGCGTGACAT-3LF5， -AGGATCGCTCGCGTTCA-3’LB5’ -CAGCGTCTGGTGCTGAGAAG-3’。
3.如权利要求I所述的一种副溶血性弧菌的检测试剂盒，其检测方法为(1)取免疫磁珠溶液不少于O.75mg，经磁力架富集分离去除免疫磁珠保护液，等体积加入免疫磁珠工作液，备用；(2)在反应管中加入免疫富集反应液和待检测样品共50ml，再加入备用的免疫磁珠， 洗脱管中加入免疫富集洗脱液35ml，采用pathatrix 仪器进行免疫富集，反应结束后，加入 100 μ I PBS重悬免疫磁珠，备用；(3)取免疫磁珠和菌体细胞的复合物100μl，5000rpm/min，离心lmin，去除上清液，加 Λ 50 μ I去离子水，95°C，煮沸5min，热裂解法提取DNA后置于4°C冰箱备用。(4)按反应缓冲液，12.5 μ I ；10mM dNTP, I μ I ；20μΜ F3/B3，0. 5μ I ；20μΜ FIP/BIP, 2 μ I ;20 μ M LF/LB, I μ I ；8000U/mL Bst DNA 聚合酶，I μ I ;200 μ MHNB, 2 μ I ；DNA 模板， 2μ1配置反应体系，实现环介导等温核酸扩增；反应体系反应温度为64°C，时间为30min， 85°C灭活5min ;最后用肉眼观察反应后颜色变化，并根据潘冬色卡判定结果。
全文摘要
本发明涉及的一种副溶血性弧菌的检测试剂盒，其特征在于它包括(1)免疫富集反应体系组分(2)环介导等温核酸扩增体系组分(3)一套基于副溶血性弧菌tlh基因的环介导等温扩增技术的特异性引物两条外引物F3、B3，、两条内引物FIP、BIP，两条环引物LF，LB。采用免疫富集和环介导等温扩增技术相结合的方法检测副溶血性弧菌。采用副溶血性弧菌多克隆抗体，制备免疫磁珠，采用免疫学方法进行实际样品中副溶血性弧菌的初筛，再根据其种属特异性基因tlh基因设计LAMP特异性引物，在核酸水平进行分子手段的检测，从而有效的避免了单纯的免疫学方法或者分子方法检测假阳性或漏检情况，是副溶血性弧菌快速检测的新发展方向。
文档编号C12Q1/04GK102586452SQ20121006279
公开日2012年7月18日 申请日期2012年3月12日 优先权日2012年3月12日
发明者卢瑛, 孙晓红, 潘迎捷, 苏晨曦, 赵勇 申请人:上海海洋大学