专利名称：一种具有低温活性的外切菊粉酶z2-5及其基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程技术领域，具体地说是一种具有低温活性的外切菊粉酶Z2-5 及其基因。
背景技术：
菊粉，又称菊糖，是一类天然果聚糖的混合物，它由果糖分子通过β _2，1糖苷键连接，聚合度从2-60，其终端为葡萄糖单位(ETTALI BIM et al. Appl Microbiol Biotechnol, 1987，26: 13-20.)。它广泛存在于菊芋、Helianthus tuber osus)、牛蒡(Arctium)、菊苣(JOhicory intybus)等多种尚未开发利用的植物中(GoudaM K. Biological Sciences, 2002, 5 (5) 589-593·)。菊粉酶(InulinaSe，EC3. 2. 1.7)，学名β _2，1_D_果聚糖酶，又叫β-果聚糖酶，是一种能降解菊粉成果糖和低聚果糖的多糖水解酶。菊粉酶具有两种作用方式，一种为外切型，从非还原端逐个水解β _2，1糖苷键，生成一分子果糖和少一个果糖单位的果聚糖，最终生成果糖和葡萄糖；另一种为内切型，水解菊粉多糖链内部的β_2，1糖苷键，产生降低了聚合度的低聚果糖。据不完全统计，产菊粉酶的丝状真菌有17属40余种，酵母菌有10 属20余种，细菌有12属10余种(杨慧敏，贵州农业科学，2004,32(3) 83-84)。外切菊粉酶可以菊芋作为原料发酵生产酒精，水解菊粉制备高果糖浆。高果糖浆 (HFCS，High Fructose Corn Syrup)，具有冷甜性，风味的不掩盖性，溶解度高，保健性好等特点，广泛应用于饮料，雪糕、冰淇淋，烘焙食品，罐头等食品中(张乐兴，广州食品工业科技，2003，19(1): 44-45)。以菊粉为原料，利用酸法和酶法皆可制备高果糖浆，酸法虽然产量高，成本低，但副产物多，色素重，分离精制困难。若利用菊粉酶制备果糖，其工艺简单，转化率高，产物纯，果糖含量可达90%以上。具有低温活性的外切菊粉酶制剂可应用于低温生境和低温加工过程，但是，目前所报导的外切菊粉酶多为中温或高温酶，具有低温(0 - 20°C)活性的外切菊粉酶非常少。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有低温活性的外切菊粉酶Z2-5。本发明的再一目的是提供编码上述外切菊粉酶的基因。本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。本发明所述外切菊粉酶Z2-5可得自鞘氨醇杆菌QSphingobacterium sp. )。Z2_5 的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。外切菊粉酶Z2-5总共含501个氨基酸，其中N端22个氨基酸为其预测信号肽序列“MIKLKKYGVLMLLLGVFGTSLA”，成熟的外切菊粉酶Z2-5含479个氨基酸。本发明通过PCR的方法分离克隆了外切菊粉酶Z2-5的编码基因其全长1506bp，起始密码为ATG，终止密码为TAA。该基因序列如SEQ ID N0. 2所示。经BLAST比对，该外切菊粉酶基因编码的氨基酸序列与GenBank中Sphingobacterium spiritivorum ATCC 33300来源的潜在外切菊粉酶(ZP_03966816. 1)具有最高的一致性，为 55% ；与确证活性的feciB^s仰力ii/is来源外切菊粉酶(CAA^137. 1)的一致性为47%。本发明还提供了包含上述外切菊粉酶基因的重组载体，优选为 PEASY-El-^0作为本发明的一个最优选的实施方案，将本发明的外切菊粉酶基因插入到质粒pEASY-El上，得到重组大肠杆菌表达质粒pEASY-El-Z -5。本发明还提供了包含上述外切菊粉酶基因的重组菌株，优选所述菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌，优选为重组菌株见27( ;/ Z2-5。本发明制备外切菊粉酶Z2-5的方法按以下步骤进行
1)用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；
2)培养重组菌株，诱导重组外切菊粉酶表达；
3)回收并纯化所表达的外切菊粉酶Z2-5。其中，优选所述宿主细胞为大肠杆菌细胞，优选将重组大肠杆菌表达质粒转化大肠杆菌细胞BL21 (DE3)，得到重组菌株见力(DE3) / Z2-5。本发明的外切菊粉酶Z2-5的最适pH7. 0 ；经0. IM pH9. 0缓冲液在室温处理lh，仍能保持30%以上的活性；最适温度为40°C，在10°C和50°C下具有大约40%的酶活，在0°C下仍有大约10%的酶活；50°C处理Ih仍能保持30%以上的酶活；能水解蔗糖，果聚糖等底物， 属于果糖苷键水解的反应专一性。以上性质表明外切菊粉酶Z2-5在食品行业有较好的应用潜力。
图1 在大肠杆菌中表达的重组外切菊粉酶的SDS-PAGE分析，其中，M 低分子量蛋白质Marker ；1 纯化的重组外切菊粉酶。图2 重组外切菊粉酶的最适pH。图3 重组外切菊粉酶的pH稳定性。图4 重组外切菊粉酶的最适温度。图5 重组外切菊粉酶的热稳定性。图6 不同金属离子及化学试剂对Z2-5酶活的影响测定，表2 重组外切菊粉酶 Z2-5的底物专一性。
具体实施例方式试验材料和试剂
1、菌株及载体鞘氨醇杆菌如cteri sp.)同文献报道菌种性质，如中国普通微生物菌种保藏管理中心菌株CGMCC 1. 6855 ；菌株fecAericAia coli BL21(DE!3)购于 Novagen 公司。2、酶类及其它生化试剂DNA聚合酶及dNTP购自TaKafei公司；pEASY-El购自北京全式金生物技术有限公司；菊粉购自Sigma公司；其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。3、培养基LB 培养基=Peptone 10g, Yeast extract 5g, NaCl 10g，加蒸馏水至 1000ml，pH 自然 (约为7)。固体培养基在此基础上加2. 0% (w/v)琼脂。说明以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。实施例1 鞘氨醇杆菌外切菊粉酶的克隆
提取鞘氨醇单胞菌基因组DNA:将液体培养2d的菌液离心取菌体，加入ImL溶菌酶，37°C处理60min，再加入裂解液，70°C水浴裂解60min，每隔IOmin混勻一次，在4°C下 IOOOOrpm离心5min。取上清于酚/氯仿中抽提除去杂蛋白，再取上清加入等体积异丙醇， 于室温静置5min后，4°C下IOOOOrpm离心lOmin。弃上清，沉淀用70%的乙醇洗涤两次，真空干燥，加入适量TE溶解，置于_20°C备用。根据外切菊粉酶的保守氨基酸序列(H-N-W-M-N-D-P-N-G和R-D-P-K-V- F-W-H-E-Q-S )设计合成了简并引物Inu32F禾P Inu32R (表1)。以鞘氨醇单胞菌总DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应参数为94°C变性5min ； 然后94°C变性30sec，44°C退火30sec，72°C延伸30sec，30个循环后72°C保温IOmin。得到一约430bp片段，将该片段回收后与pMD 18-T载体相连，然后送北京六合华大基因科技股份有限公司广州分公司测序。根据测序得到的核甘酸序列，设计热不对称交错PCR(简称 TAIL-PCR)上游特异性引物4条，并将它们分别命名为uspl、usp2、usp3、usp4 ；另设计下游特异性引物2条，并将它们分别命名为dspl、dsp2 (表1)。特异性引物设计方向为需要扩增的未知区
表1.外切菊粉酶的克隆与表达引物
引物名称引物序列(5’ 一-3’ )引物长度(bp)Inu32FCCCACAACTGGATGAACganccnaaygg28Inu32RTCTGCTCGTGCCAGAACAcnttnggrtcnc30usplAACCTGCCGTGTTATCTTTATC22usp2GGTACMTGCGATCTTCTGCTC22usp3TGTCCTTCGCTATCCCGACAGAT23usp4TGTCCTTCGCTATCCCGACAGAT23dsplTCTCCGGTAGTGCTGTAATCG21dsp2TTTACCCATCACAATCATCAGG22Z2-5InuEFCAGACGGGACAGCATAAACAAG22Z2-5InuERTTATCTCTTAAATGCAGAAATA22
域方向，sp2的位置设计在spl的内侧，sp4的位置设计在sp3的内侧。每两个引物之间的距离没有严格规定，引物长度为21 -23nt，以uspl、卿2、dspl、dsp2为引物，退火温度为53°C ；以uspl、usp2为引物，退火温度分别为60°C和50°C。通过TAIL-PCR得到已知基因序列片段的侧翼序列，扩增产物送北京六合华大基因科技股份有限公司广州分公司测序。测序结果与已知基因序列片段相拼接，得到外切菊粉酶基因忍_5，该基因序列如SEQ ID NO. 2 所示。 实施例2 重组外切菊粉酶Z2-5的制备
以Z2-5InuEF和Z2-5InuER为引物对(表1 )，鞘氨醇杆菌基因组DNA为模板，进行PCR 扩增。PCR反应参数为94°C变性5min ；然后94°C变性30sec，45°C退火30sec，72°C延伸 2min, 40个循环后72°C保温5min，25°C保温3min。PCR结果得到外切菊粉酶基因ZSS^。将编码外切菊粉酶的基因忍-5与表达载体pEASY-El相连接，获得含有外切菊粉酶基因的重组质粒pEASY-El-Z -5并转化大肠杆菌BL21 (DE3)，获得重组大肠杆菌菌株见力(DE3)/ Z2-5。取含有重组质粒pEASY-El-Z -5的五coli BL21 (DE3)菌株和只含有pEASY -El空质粒的五coli BL21 (DE3)菌株，以0. 1%的接种量接种于LB(含5(^g/mL Amp)
培养液中，37°C快速振荡16h。然后将此活化的菌液以1%接种量接种到新鲜的LB(含50μβ/ mL Amp)培养液中，快速振荡培养约2 - 3h (OD600达到0.6-1.0)后，加入终浓度0. 7mM的 IPTG诱导，于20°C继续振荡培养约20h或振荡培养约他。12000rpm离心5min，收集菌体。用适量的PH7.0 Tris-Hcl缓冲液悬浮菌体后，于低温水浴下超声波破碎菌体。以上胞内浓缩的初酶液经12，OOOrpm离心IOmin后，吸取上清并用Nickel-NTA Agarose纯化目的蛋白。SDS-PAGE结果(图1)表明，重组外切菊粉酶在大肠杆菌中得到了表达，经Nickel-NTA Agarose纯化后为单一条带。实施例3 纯化的重组外切菊粉酶Z2-5的性质测定 1、重组外切菊粉酶Z2-5的活性分析
实施例2纯化的重组外切菊粉酶Z2-5的活性测定方法采用3，5 一二硝基水杨酸(DNS) 法将底物溶于0. IM缓冲液中，使其终浓度为0. 5% (w/v)；反应体系含100 μ L适量酶液， 900 μ L底物；底物在反应温度下预热5min后，加入酶液后再反应lOmin，然后加1. 5mL DNS 终止反应，沸水煮5min，冷却至室温后在540nm波长下测定OD值。1个酶活单位(U)定义为在给定的条件下每分钟分解底物产生1 μ mol还原糖所需的酶量。2、重组外切菊粉酶Z2-5的最适pH和pH稳定性的测定
酶的最适PH测定将外切菊粉酶Z2-5在37°C下和0. IM pH4. 0-9. 0的缓冲液中进行酶促反应。酶的PH稳定性测定将纯化的酶液置于0. IM pH4. 0-10. 0的缓冲液中，在室温下处理Ih以上，然后在pH7. 0及37°C下进行酶促反应，以未处理的酶液作为对照。缓冲液为0. IM ρΗ4· 0-5. 0的醋酸-醋酸钠缓冲液，0. IM ρΗ5· 0-8. 0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，0. IM pH8. 0-9. 0的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液。以菊粉为底物，反应lOmin，测定纯化的 Z2-5的酶学性质。结果表明Z2-5的最适pH为7. 0 (图2)；经pH5. 0-10. 0的缓冲液处理 Ih，酶活剩余约30% (图3)。3、重组外切菊粉酶Z2-5的最适温度及热稳定性测定
酶的最适温度测定在PH7. 0的缓冲液中，于0-60°C下进行酶促反应。酶的热稳定性测定将同样酶量的酶液置于设定的温度中(30°C，35°C，40°C，45°C，50°C，55°C )处理Ih后， 在pH7. 0及40°C下进行酶促反应，以未处理的酶液作为对照。以菊粉为底物，反应lOmin， 测定纯化的Z2-5的酶学性质。结果表明Z2-5的最适温度为40°C，在0°C下有约10%的酶活，在10°C和20°C下分别具有大约40%和60%的酶活(图4);45°C耐受Ih酶活剩余约80%， 50°C耐受Ih酶活剩余30%左右(图5)。4、重组外切菊粉酶Z2-5的动力学参数测定
酶的动力学参数一级反应时间测定在PH7. 0及40°C下，以0. 3%菊粉为底物，依次在酶促反应的l-15min内终止反应并测定酶活性，计算出酶活性与反应时间的比值，若在一定时间内该比值保持稳定，则此时间为一级反应时间。用0. 07-1. 25mM菊粉为底物，在pH7、 40°C和一级反应时间下，根据Lineweaver-Burk方法测定之、Fmax。经测定，在pH7及40°C下，Z2-5对菊粉的之、Vmas分别为1. 4 mM、138. 9 U/mg。5、不同金属离子及化学试剂对Z2-5酶活的影响测定
在酶促反应体系中加入IOmM的金属离子及化学试剂，研究其对酶活性的影响。在 40°C、pH7. 0条件下测定酶活性。结果(图6)表明，IOmM的Hg2+可完全抑制Z2-5 ；Fe3+，Pb2+， Cu2+对Z2-5的抑制较强；EDTA，K+，Na+对Z2-5的抑制较弱Je2+和Mn2+可使Z2-5的酶活分别提高大约1. 5倍和2倍。6、重组外切菊粉酶Z2-5的底物专一性
用0. IM pH7. 0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液配制0. 5% (w/v)菊粉、蔗糖、果聚糖及淀粉，在pH7. 0及40°C下测定酶活力，结果Z2-5对四种底物都有酶活，以菊粉为底物的酶活是以蔗糖为底物的0. 097倍，说明Z2-5属于果糖苷键水解的反应专一性(表2)。表 权利要求
1.一种具有低温活性的外切菊粉酶Z2-5，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1 所示。
2.一种编码权利要求1所述的具有低温活性外切菊粉酶Z2-5的外切菊粉酶基因忍-5，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
3.一种包含权利要求2所述的外切菊粉酶基因Z2-5的重组载体。
4.一种包含权利要求2所述的外切菊粉酶基因Z2-5的重组菌株。
全文摘要
本发明涉及一种具有低温活性的外切菊粉酶Z2-5及其基因。来源于鞘氨醇杆菌(Sphingobacteriumsp.)的外切菊粉酶Z2-5的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，且本发明提供了编码上述外切菊粉酶的基因Z2-5，外切菊粉酶基因Z2-5的重组载体和外切菊粉酶基因Z2-5的重组菌株。本发明的外切菊粉酶具有以下性质最适pH7；经0.1MpH9.0缓冲液在室温处理1h，仍能保持30%以上的活性；最适温度为40℃，在10℃和50℃下具有大约40%的酶活，在0℃下仍有大约10%的酶活；50℃处理1h仍能保持30%以上的酶活；能水解蔗糖及果聚糖等底物，属于果糖苷键水解的反应专一性。本发明的外切菊粉酶Z2-5可水解菊粉制备高果糖浆，用于食品行业中。
文档编号C12N15/56GK102559637SQ20121006242
公开日2012年7月11日 申请日期2012年3月12日 优先权日2012年3月12日
发明者周峻沛, 唐湘华, 彭沫溱, 李俊俊, 许波, 黄遵锡 申请人:云南师范大学