一种发酵产低温脂肪酶的方法
【专利摘要】本发明提供了一种发酵产低温脂肪酶的方法，是以自己筛选的野生菌株为出发菌种，采用优化的种子培养基、产酶培养基及发酵生产技术方法来制备低温脂肪酶的，发酵液最高酶活可达6000U/L以上，所产低温脂肪酶最适温度为30℃，在0℃仍具有65％的相对酶活，可广泛应用于洗涤剂、食品工业、造纸、医药、皮革、环境保护等领域，属于生物【技术领域】。
【专利说明】ー种发酵产低温脂肪酶的方法
【技术领域】
[0001]本发明提供的ー种发酵产低温脂肪酶的方法，是以自己筛选的野生菌株为出发菌种，采用优化的种子培养基、产酶培养基及发酵生产技术方法来制备低温脂肪酶的，发酵制备的低温脂肪酶最高酶活可达6000U/L以上，所产低温脂肪酶最适温度为30°C，在(TC仍具有65%的相对酶活，可广泛应用于洗涤剂、食品エ业、造纸、医药、皮革、环境修复等领域，属于生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]脂肪酶(lipase, EC3.1.1.3)又称甘油三酰酯甘油水解酶(triacylglycerolacylhyrolase),能在油-水界面上催化其水不溶性的天然底物甘油三酰酯水解为脂肪酸和甘油[I]。在微水环境下，脂肪酶具有独特的性能，其催化反应具有可逆性，包括甘油酯及水不溶性酯类的水解、醇解、酸解以及酯化等反应。除了能分解脂肪外，脂肪酶还可催化其它酯水解的能力，因此，脂肪酶是生物技术中应用酶类的重要组成部分，是继蛋白酶、糖化酶的第三大商业用酶，已被广泛应用于洗涤剂、食品エ业、造纸、医药、皮革等方面。
[0003]脂肪酶按其作用pH的不同，可以分为酸性、中性、碱性脂肪酶；而按其作用温度的高低则可以分为低温脂肪酶(cold-active lipase)、中温脂肪酶和高温脂肪酶，低温脂肪酶多为低温微生物产生，此类菌生长条件相对苛刻，严重制约了低温脂肪酶的发展，因而开发和研究的时间较短，但由于低温脂肪酶在低温环境下具有高催化活性而其活化能和反应最适温度较低，有利于节约能源和防止产物结构破坏，对于环境保护和修复也有极大的意义，因为环境温度多数在40°C以下，在某些领域中应用低温脂肪酶有着中高温脂肪酶不可比拟的优越性，低温脂肪酶的研究开发及生产制备技术开始受到世界各国的重视，我们就是在这样的形势和思想指导下，研究出一种有效的制备低温脂肪酶的方法。
【发明内容】
`[0004]本发明提供了ー种发酵产低温脂肪酶的方法，一种优化的种子培养基配方和产酶培养基配方及发酵生产制备中的參数，所制备的低温脂肪酶可广泛应用于洗涤剂、食品エ业、造纸、医药、皮革、环境保护等领域。
[0005]本发明的技术方案:ー种发酵产低温脂肪酶的方法，用我们自己筛选的野生菌株为出发菌种，经种子培养和产酶培养发酵制备低温脂肪酶，エ艺为:
[0006](I)种子培养
[0007]种子培养基:蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，酵母浸出汁5g/L，pH 7.0 ；
[0008]取250ml的三角瓶若干个，每个装种子培养基50ml，121°C灭菌30分钟，冷却；
[0009]在姆个装种子培养基50ml的三角瓶中挑取一环菌接入，置于摇床培养，培养条件--温度30°C，转速200r/min，培养8小时即为发酵种子液；
[0010]⑵产酶培养
[0011]产酶培养基:牛肉膏40g/L，橄榄油 10ml/L, Triton X_1005ml/L，初始 PH = 7.0，泡敌3ml/L ；
[0012]取产酶培养基4.5升加入到7升发酵罐中，121°C灭菌40分钟，冷却；
[0013]按10%的接种量，将450ml发酵种子液加入到含产酶培养基的发酵罐中，
[0014]设定发酵參数，，温度30°C，pH 7.0，转速 3501'/1^11，通气量1.5，17111111/1，发酵35小时；
[0015](3)脂肪酶液制备
[0016]将发酵液用高速冷冻离心机在4°C 10，800g离心15min的条件下离心，上清液即为脂肪酶粗酶液；
[0017](4)酶活力的测定
[0018]以对硝基苯丁酸酯p-NPB为底物，将pH 9.0的3.7mL 0.lmol/L Tris-HCl缓冲液和0.2mL IOmmoI/L p-NPB组成的反应体系，30°C保温15min后加入0.1mL酶液，在405nm下测吸光值，以Imin内催化产生I y mo I的对硝基酚(e = 1.86 X IO4CnT1 XiT1)所需的酶量为I个酶活力単位。
[0019]本发明的有益效果:
[0020]首先提供了ー种发酵产低温脂肪酶的方法。鉴于低温脂肪酶多为低温微生物产生，此类菌生长条件相对苛刻，发酵生产制备低温脂肪酶的方法较少，严重制约了低温脂肪酶的发展，在世界各国开发和研究的时间也较短，但低温脂肪酶在低温环境下具有高催化活性而其活化能和反应最适温度较低，有利于节约能源和防止产物结构破坏，对于环境保护和修复也有极大的意义，因为环境温度多数在40°C以下，在某些领域中应用低温脂肪酶有着中高温脂肪酶不可比拟的优越性。本发明ー种发酵产低温脂肪酶的方法与其它制备低温脂肪酶的方法相比较，具有酶活力高、发酵时间短、操作简单、成本低的特点，且所生产出来的低温脂肪酶可广泛使用于洗涤剂、食品エ业、造纸、医药、皮革、环境修复等领域，因此本发明ー种发酵产低温脂肪酶的方法有广泛的エ业使用价值和较显著的经济效益前景。
【具体实施方式】
[0021]实施例1
[0022]1、从斜面上挑取单菌落，划线于LB平板培养基(蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，酵母浸出汁5g/L，琼脂20g/L，pH 7.2)中，将平板置于30°C培养箱培养24h。
[0023]2、从平板上括取I环菌种接种到含50ml种子培养基(蛋白胨10g/L，氯化钠IOg/し酵母浸出汁5g/L，pH 7.0)的250ml的三角瓶中，共接种10瓶，置于摇床培养，培养条件:温度30°C，转速200r/min，培养8小时即为发酵种子液。
[0024]3、按10%的接种量，将发酵种子液450ml加入到含4.5升产酶培养基(牛肉膏40g/L，橄榄油 10ml/L, Triton X_1005ml/L，初始 PH = 7.0，泡敌 3ml/L)的 7 升发酵罐中，设定发酵參数，，温度30°C，pH 7.0，转速350r/min，通气量1.5L/min/L，发酵35小时取出；
[0025]4、脂肪酶液制备
[0026]将发酵液用高速冷冻离心机在4°C 10，800g离心15min的条件下离心，上清液即为脂肪酶粗酶液；
[0027]5、酶活力的测定
[0028]以对硝基苯丁酸酯p-NPB为底物，将pH 9.0的3.7mL 0.lmol/L Tris-HCl缓冲液和0.2mL I Ommol/L p-NPB组成的反应体系，30°C保温15min后加入0.1mL酶液，在405nm下测吸光值，以Imin内催化产生I y mo I的对硝基酚(e = 1.86 X IO4CnT1 XiT1)所需的酶量为I个酶活力単位，测的 酶活力为6200U/L。
【权利要求】
1.ー种发酵产低温脂肪酶的方法，是以自己筛选的野生菌株为出发菌种，采用改进的种子培养基和产酶培养基及方法发酵制备低温脂肪酶，エ艺为: (1)种子培养 种子培养基:蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，酵母浸出汁5g/L，pH 7.0 ； 取250ml的三角瓶若干个，每个装种子培养基50ml，121°C灭菌30分钟，冷却； 在姆个装种子培养基50ml的三角瓶中挑取一环菌接入,置于摇床培养,培养条件:温度30°C，转速200r/min，培养8小时即为发酵种子液； (2)产酶培养 产酶培养基:牛肉膏40g/L，橄榄油10ml/L, Triton X_1005ml/L，初始PH = 7.0，泡敌3ml/L ； 取产酶培养基4.5升加入到7升发酵罐中，121°C灭菌40分钟，冷却； 按10%的接种量，将450ml发酵种子液加入到含产酶培养基的发酵罐中，设定发酵參数，，温度 30°C，pH 7.0，转速 350r/min，通气量 1.5，L/min/L，发酵 35 小时； (3)脂肪酶液制备 将发酵液用高速冷冻离心机在4°C 10，800g离心15min的条件下离心，上清液即为脂肪酶粗酶液； (4)酶活力的测定 以对硝基苯丁酸酯p-NPB为底物，将pH 9.0的3.7mL 0.lmol/L Tris-HCl缓冲液和.0.2mL IOmmoI/L p_NPB组成的反应体系，30°C保温15min后加入0.1mL酶液，在405nm下测吸光值，以Imin内催化产生I u mo I的对硝基酚，系数e = 1.86 X IO4CnT1 X M—1，所需的酶量为I个酶活力単位。
【文档编号】C12N9/20GK103571808SQ201210278064
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2012年8月7日 优先权日:2012年8月7日
【发明者】李洪兵, 张峰, 张明 申请人:湖南鸿鹰生物科技有限公司