专利名称：海洋微生物发酵生产低温纤维素酶的方法
技术领域：
本发明涉及微生物学、酶工程、发酵工程、生物化学等领域，具体涉及一种低温纤 维素酶海洋微生物发酵生产方法。该发明生产的低温纤维素酶主要应用于饲料行业、食品 加工、中草药提取、造纸与纺织、原油开采、印染与洗涤、以及其它纤维素酶应用领域。其可 以提高原料的利用率、转化率和生产率，降低生产成本，改善并提高产品质量。
背景技术：
纤维素酶是指能降解纤维素生成纤维二糖和葡萄糖等小分子物质的一组酶的总 称，是一种复合的诱导酶，包括多种水解酶(张启先，微生物学报，1974)。纤维素酶作为生 物制剂，已经广泛应用于饲料、食品加工，中草药提取，原油开采，造纸及纺织、印染等行业 中，但目前使用的纤维素酶主要为中温纤维素酶。虽然国内外对纤维素酶的研究有40余 年，但主要集中于中温纤维素酶；有关低温纤维素酶的研究仍处于起步阶段，主要研究菌 种选育、发酵条件优化、酶学性质以及相关基因克隆等(王玢等，山东教育学院学报和海 洋科学，2003 ；曾胤新等，高技术通讯，2005 ；游银伟，微生物学报，2005 ；侯运华，山东大学， 2006 ；吕明生等，食品科学，2007 ；刘秀华，山东大学，2007 ；张淑红，微生物学杂志，2009)。 低温纤维素酶产业化、规模化生产及应用还未见报道。低温纤维素酶与高温、中温纤维素 酶相比具有巨大应用优势。因为低温纤维素酶在低温下具有高酶活力及高催化效率，可减 少加工工艺，缩短加工过程的时间并省却昂贵的加热或冷却费用；在节能方面有相当大的 优势；经过温和的热处理即可使低温酶的活力丧失，而低温或适温处理不会影响产品的品 质(孙谧等，海洋水产研究，200 ，其上述特性将有助于其推广和应用。低温纤维素酶的 应用将对传统的农业、食品、医药、化工、能源和环保等领域产生深远的影响，利用海洋微生 物发酵生产的低温纤维素酶，按原料重量0. 01%。 0. 5%。的量添加于反刍动物纤维质粗饲 料、农产品深加工和中草药提取等领域中，在6 20°C处理0. 25 lh，可以提高原料的转 化率12. 8% 19.2%，降低了生产成本，改善并提高产品质量，从而在根本上省却中温、高 温酶的加热、冷却设备和工艺。低温纤维素酶将为人类摆脱生存和发展中所面临的诸如饥 饿、资源、能源危机以及环境污染等困境提供现实的机遇，其具有非常广阔的开发潜力和应 用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种海洋微生物发酵生产低温纤维素酶的方法。该方法主要 是微生物经过低温驯化后，在18 液体发酵生产低温纤维素酶。这种生产方法获得的 低温纤维素酶粗酶液活性达到200U/mL，如再经过分离和纯化，将得到不同浓度和纯度的酶 制剂。当该酶制剂活性为2000U/mL或2000U/g，以0. 01%。 0. 5%。的添加量应用于反刍动 物纤维质粗饲料、农产品深加工和中草药提取等领域中，在6 20°C处理0. 25 lh，可以 提高原料的转化率12. 8% 19.2%。该酶制剂应用操作简单、方便、快捷、成本低，而且可 以从根本上避免中温、高温酶的加热、冷却设备和工艺。
本发明所述的一种海洋微生物发酵生产低温纤维素酶的方法具体包括以下步 骤(1)将产生纤维素酶的微生物逐级低温驯化，驯化温度由高到低， 25 0C- 22 0C- 20 0C- 18 °C，使其在低温环境中生长良好；(2)按常规方法将低温驯化后的纤维素酶产生菌在18 逐级扩大培养，制备 成液体一级种子和二级种子；(3)将液体一级种子或二级种子，按发酵液体积的4 10%接种量接入产酶培养 基中，在18 培养72 13 时，即海洋微生物发酵生产低温纤维素酶结束；(4)将(3)的发酵液在4，000 8，OOOrpm离心收集液体，收集到的液体即为粗酶 液；(5)根据不同需要和使用对象不同，将(4)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化， 制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。本发明中使用的菌种来源于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (CGMCC)，初期活化和生长条件按菌种保藏单位提供的说明进行。纤维素酶产生菌(CGMCC 菌种编号3. 3002或3. 5455或3. 2754等)，菌株先活化，再经过逐级低温驯化，发酵生产低 温纤维素酶时按本发明方法进行培养。低温驯化后的菌株在4°C环境中可保存2个月，用 25 50%甘油制成的菌悬液在零下80°C条件下可以长期保藏。
具体实施例方式实施例一(1)、培养基制备①菌种活化培养基马铃薯200. 0g，葡萄糖20. 0g，琼脂20. 0g，蒸馏水1. 0L，pH值 自然，121°C高压蒸气灭菌30min。②菌种低温驯化培养基马铃薯50. 0 100. Og,新华滤纸粉5. 0 8. 0g，麸皮 2. 0 6. Og,琼脂20. Og,蒸馏水1. 0L，pH值自然，121°C高压蒸气灭菌30min。③液体种子培养基水稻秸秆粉3. 0 5. 0g，蛋白胨0. 5 1. 0g, Tween800. 1 0. 3g, (NH4)2SO4O. 8 1. 2g, KH2PO4L 2 1. 8g，尿素 0. 2 0. 4g, MgSO4O. 2 0. 3g, CaCl2O. 1 0. 2g, ZnSO4 ·7Η20 1. 2mg, MnSO4 · H2O 1. 6mg, CoCl2L 8mg,自来水 1. 0L，pH 值自 然，121°C高压蒸气灭菌30min。④产酶培养基水稻秸秆粉7. 0 12. 0g，麸皮1. 0 5. 0g, Tween800. 1 0. 4g， (NH4)2SO4L 0 1. 5g, KH2PO4L 4 2. 0g，尿素 0. 2 0. 6g, MgSO4O. 1 0. 4g, CaCl2O. 2 0. 3g, ZnSO4 · 7H20 2. 4mg, MnSO4 · H2O 3. 2mg, CoC123. 6mg,自来水 1. 0L, pH 值 6. 0，121 °C 高 压蒸气灭菌30min。(2)将产生纤维素酶的菌种，按中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (CGMCC)提供的菌株说明进行初始活化；(3)将(2)活化好的菌种逐级低温驯化，驯化温度由高到低， 25 0C- 22 0C- 20 0C- 18 °C，使其在低温环境中生长良好；(4)按常规方法将低温驯化后的纤维素酶产生菌在18 20°C培养48 72h，按 5%的接种量进行逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；
(5)将(4)制备的二级种子按发酵液体积4 6%的接种量接入IOL的产酶培养 基中，在18 20°C培养120 13 时，即海洋微生物发酵生产低温纤维素酶结束；(6)将(5)的发酵液在4，000 8，OOOrpm离心收集液体，收集到的液体即为粗酶 液；(7)根据不同需要和使用对象不同，将(6)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化， 制备成不同活性、纯度和剂型的低温纤维素酶制剂。实施例二 (1)、培养基制备①菌种活化培养基马铃薯200. 0g，葡萄糖20. 0g，琼脂20. 0g，蒸馏水1. 0L，pH值 自然，121°C高压蒸气灭菌30min。②菌种低温驯化培养基马铃薯50. 0 100. Og,新华滤纸粉5. 0 8. Og,麸皮 2. 0 6. Og,琼脂20. Og,蒸馏水1. 0L，pH值自然，121°C高压蒸气灭菌30min。③液体种子培养基水稻秸秆粉3. 0 5. 0g，蛋白胨0. 5 1. 0g, Tween800. 1 0. 3g, (NH4)2SO4O. 8 1. 2g, KH2PO4L 2 1. 8g，尿素 0. 2 0. 4g, MgSO4O. 2 0. 3g, CaCl2O. 1 0. 2g, ZnSO4 ·7Η20 1. 2mg, MnSO4 · H2O 1. 6mg, CoCl2L 8mg,自来水 1. 0L，pH 值自 然，121°C高压蒸气灭菌30min。④产酶培养基水稻秸秆粉7. 0 12. Og,麸皮1. 0 5. 0g, Tween800. 1 0. 4g， (NH4)2SO4L 0 1. 5g, KH2PO4L 4 2. Og,尿素 0. 2 0. 6g, MgSO4O. 1 0. 4g, CaCl2O. 2 0. 3g, ZnSO4 · 7H20 2. 4mg, MnSO4 · H2O 3. 2mg, CoC123. 6mg,自来水 1. 0L, pH 值 6. 0，121 °C 高 压蒸气灭菌30min。(2)将产生纤维素酶的菌种，按中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (CGMCC)提供的菌株说明进行初始活化；(3)将(2)活化好的菌种逐级低温驯化，驯化温度由高到低， 25 0C- 22 0C- 20 0C- 18 °C，使其在低温环境中生长良好；(4)按常规方法将低温驯化后的纤维素酶产生菌在20 22°C培养48 72h，按 5%的接种量进行逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；(5)将(4)制备的二级种子按发酵液体积6 8%的接种量接入50L的产酶培养 基中，在20 22°C培养96 120h时，即海洋微生物发酵生产低温纤维素酶结束；(6)将(5)的发酵液在4，000 8，OOOrpm离心收集液体，收集到的液体即为粗酶 液；(7)根据不同需要和使用对象不同，将(6)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化， 制备成不同活性、纯度和剂型的低温纤维素酶制剂。实施例三(1)、培养基制备①菌种活化培养基马铃薯200. 0g，葡萄糖20. 0g，琼脂20. 0g，蒸馏水1. 0L，pH值 自然，121°C高压蒸气灭菌30min。②菌种低温驯化培养基马铃薯50. 0 100. Og,新华滤纸粉5. 0 8. Og,麸皮 2. 0 6. Og,琼脂20. Og,蒸馏水1. 0L，pH值自然，121°C高压蒸气灭菌30min。③液体种子培养基水稻秸秆粉3. 0 5. 0g，蛋白胨0. 5 1. 0g, Tween800. 1 0. 3g, (NH4)2SO4O. 8 1. 2g, KH2PO4L 2 1. 8g，尿素 0. 2 0. 4g, MgSO4O. 2 0. 3g, CaCl2O. 1 0. 2g, ZnSO4 ·7Η20 1. 2mg, MnSO4 · H2O 1. 6mg, CoCl2L 8mg,自来水 1. 0L，pH 值自 然，121°C高压蒸气灭菌30min。④产酶培养基水稻秸秆粉7. 0 12. Og,麸皮1. 0 5. 0g, Tween800. 1 0. 4g， (NH4)2SO4L 0 1. 5g, KH2PO4L 4 2. Og,尿素 0. 2 0. 6g, MgSO4O. 1 0. 4g, CaCl2O. 2 0. 3g, ZnSO4 · 7H20 2. 4mg, MnSO4 · H2O 3. 2mg, CoC123. 6mg,自来水 1. 0L, pH 值 6. 0，121 °C 高 压蒸气灭菌30min。(2)将产生纤维素酶的菌种，按中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (CGMCC)提供的菌株说明进行初始活化；(3)将(2)活化好的菌种逐级低温驯化，驯化温度由高到低， 25 0C- 22 0C- 20 0C- 18 °C，使其在低温环境中生长良好；(4)按常规方法将低温驯化后的纤维素酶产生菌在22 培养48 72h，按 5%的接种量进行逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；(5)将(4)制备的二级种子按发酵液体积8 10%的接种量接入100L的产酶培 养基中，在22 培养72 96h时，即海洋微生物发酵生产低温纤维素酶结束；(6)将(5)的发酵液在4，000 8，OOOrpm离心收集液体，收集到的液体即为粗酶 液(7)根据不同需要和使用对象不同，将(6)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化， 制备成不同活性、纯度和剂型的低温纤维素酶制剂。实施例四按实施例一、二和三方法生产的低温纤维素酶制剂，平均酶活性为2000U/mL。将活 性为2000U/mL或2000U/g的低温纤维素酶制剂，按原料重量0. 01%。 0. 5%。的量添加于反 刍动物纤维质粗饲料、农产品深加工和中草药提取等领域中，在6 20°C处理0. 25 lh， 可以提高原料的利用率、转化率和生产率，降低生产成本，改善并提高产品质量。低温纤维 素酶应用部分实验结果见下表。
实验物料低温纤维素酶添加量(％。)处理时间(h)转化率(％ )处理温度(°C )丝化玉米秸秆0.2 — 0.51+ 16. 36—18丝化水稻秸秆0. 1 ~ 0.30. 5+ 17. 66—18大豆秸秆0. 1 ~ 0.30. 5+ 14. 66—18苹果汁加工0. 01 ~ 0. 10. 25+ 14. 114 ~ 18葡萄汁加工0. 01 ~ 0. 10. 25+ 12. 814 ~ 18橙汁加工0. 01 ~ 0. 10. 25+ 14. 314 ~ 18中草药提取0.3 — 0.51+ 19. 212 ~ 20 实验结果表明低温纤维素酶应用于反刍动物纤维质粗饲料、农产品深加工和中草药提取等领域中，可以提高原料的利用率、转化率和生产率，降低生产成本，改善并提高 产品质量；同时也说明低温纤维素酶在低温下具有高酶活力及高催化效率，可大大缩短处 理过程的时间并省却昂贵的加热或冷却费用；在节能方面有相当大的优势；该酶制剂应用 操作简单、方便、快捷、成本低；可以从根本上避免中温、高温酶的加热、冷却设备和工艺。
权利要求
1.一种海洋微生物发酵生产低温纤维素酶的方法，其包括以下步骤(1)将产生纤维素酶的海洋微生物逐级低温驯化，驯化温度由高到低， 25 0C- 22 0C- 20 0C- 18 °C，使其在低温环境中生长良好；(2)按常规方法将低温驯化后的纤维素酶产生菌在18 逐级扩大培养，制备成液 体一级种子和二级种子；(3)将液体一级种子或二级种子，按发酵液体积的3 9%接种量接入液体发酵培养基 中，在18 培养72 13 时，即微生物发酵生产低温纤维素酶结束；(4)将(3)的发酵液在4，000 8，OOOrpm离心收集液体，收集到的液体即为粗酶液；(5)根据不同需要和使用对象不同，将(4)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备 成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。
2.根据权利要求1所述的方法，其中菌种低温驯化培养基、液体种子培养基、产酶培养 基分别为(1)菌种低温驯化培养基马铃薯50.0 100. Og,新华滤纸粉5. 0 8. Og,麸皮2. 0 6. 0g，琼脂20. 0g，蒸馏水1. 0L，pH值自然，121°C高压蒸气灭菌30min。(2)液体种子培养基水稻秸秆粉3.0 5. 0g，蛋白胨0. 5 1. 0g, Tween80 0. 1 0. 3g, (NH4)2SO4 0. 8 1. 2g, KH2PO4 1. 2 1. 8g，尿素 0. 2 0. 4g, MgSO4 0. 2 0. 3g, CaCl2O. 1 0. 2g, ZnSO4 · 7H20 1. 2mg, MnSO4 · H2O 1. 6mg, CoCl2 1. 8mg,自来水 1. 0L, pH 值 自然，121°C高压蒸气灭菌30min。(3)产酶培养基水稻秸秆粉7.0 12. Og,麸皮1. 0 5. 0g, Tween80 0. 1 0. 4g， (NH4)2SO4 1. 0 1. 5g，KH2PO4 1. 4 2. 0g，尿素 0. 2 0. 6g，MgS04 0. 1 0. 4g，CaCl2O. 2 0. 3g, ZnSO4 · 7H20 2. 4mg, MnSO4 · H2O 3. 2mg, CoCl2 3. 6mg,自来水 1. 0L, pH 值 6. 0，121 °C 高 压蒸气灭菌30min。
全文摘要
本发明所述的一种海洋微生物发酵生产低温纤维素酶的方法是将产生纤维素酶的海洋微生物逐级低温驯化，使其在低温环境中生长良好；将低温驯化后的纤维素酶产生菌在18～24℃逐级扩大培养，按发酵液体积的4～10％接种量接入产酶培养基中，在18～24℃培养72～132h时，即微生物发酵生产低温纤维素酶结束；发酵液在4,000～8,000rpm离心收集液体，收集的液体即为粗酶液；根据不同需要和使用对象不同，将粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。
文档编号C12N9/42GK102093991SQ20101016265
公开日2011年6月15日 申请日期2010年4月9日 优先权日2009年12月11日
发明者张庆芳, 董硕, 迟乃玉 申请人:大连大学