发酵中的海藻糖酶的制作方法
【专利说明】发酵中的海藻糖酶
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2013年10月28日提交的美国临时申请序列号61 /896，601的优先权权 益，该临时申请全文W引用的方式并入本文。
[圆]发明背景
[0004] 在燃料乙醇生产中，在发酵结束化OF)时，相当大百分比-约50 % -的"DP2峰"（DP-聚合度-等同于二糖)为海藻糖，海藻糖被认为是酵母为了同渗容摩稳定(例如，为了防止高 乙醇、高葡萄糖等的细胞环境的干燥)而内部合成。此外，运些海藻糖水平可随着发酵溫度 而增加，经过测量高达EOF DP2水平的60%-70%。因为海藻糖形成与葡萄糖利用处于直接 竞争关系，所W运种损失的碳将导致小于乙醇生产的理论收率。然而，为了增强的发酵有益 效果而除去海藻糖可导致负面的发酵性能，因为已知海藻糖防止应力。但是，有参考文献提 出，细胞外海藻糖的水解可用于直接的乙醇生产W及酵母生长（Basu等人，Biochem Boi地ys. Acta 1760,134-160(2006))。海藻糖降低EOF"残余糖"水平，同时增加乙醇收率的 潜在用途受到工业关注。
[0005] -分子海藻糖通过海藻糖酶水解成两分子葡萄糖。海藻糖酶(a, a-海藻糖-I-C-葡 萄糖水解酶，EC 3.2.1.28)已报告来自许多生物包括原核生物、植物和动物。虽然不知道海 藻糖存在于哺乳动物中，但是发现海藻糖酶存在于肾刷状缘膜和肠绒毛膜中。通过海藻糖 酶的海藻糖水解是各种生物的重要生理过程，诸如真菌抱子萌发、昆虫飞行和恢复静止细 胞的生长。已对至少两种类型的海藻糖酶进行表征，基于它们的最佳抑;酸性海藻糖酶和中 性海藻糖酶。还提出，中性海藻糖酶主要在胞质中，然而酸性海藻糖酶通常是细胞外分泌的 (Parrou 化等人，阳MS Yeast Res. (2005)5:503-11)。
[0006] 因此，在工业中存在对发展包括除了其它方面外改善乙醇收率、减少DP2峰且改善 发酵过程的海藻糖酶的方法和包含海藻糖酶的组合物的需要。
【发明内容】
[0007] 本发明提供提高从液化液生产乙醇的方法，该方法包括:用葡糖淀粉酶、发酵生物 和海藻糖酶发酵液化液；W及在发酵结束时除去乙醇和其它期望的发酵产物，其中经海藻 糖酶处理的发酵相比于未经海藻糖酶处理的发酵产生增加的乙醇。在另一方面中，本发明 提供降低发酵产物中DP2的最终浓度的方法，该方法包括：用葡糖淀粉酶、发酵生物和海藻 糖酶发酵液化液；W及在发酵结束时回收期望的发酵产物，其中DP2浓度相比于未经海藻糖 酶处理的发酵减少。在另一个方面中，葡糖淀粉酶为DISTILLASE SSF。在另一方面中，海藻 糖酶来自真核生物或丝状真菌诸如木霉属。在另一方面中，海藻糖酶是酸性海藻糖酶或中 性海藻糖酶。在另一方面中，海藻糖酶W约0.化g/g DS至约lOOOiig/g DS的液化液的浓度， 优选地W约〇.25iig/g DS至约10化g/g DS的液化液的浓度，更优选地W约0.化g/g DS至约 1化g/g DS的液化液的浓度添加。
[000引本发明还提供提高从液化液生产乙醇的方法，该方法包括:用葡糖淀粉酶、发酵生 物和发酵稳定的海藻糖酶发酵液化液；W及在发酵结束时除去乙醇和其它期望的发酵产 物，其中经海藻糖酶处理的发酵相比于未经海藻糖酶处理的发酵产生增加的乙醇。
[0009] 本发明还提供改善发酵反应的方法，该方法包括添加海藻糖酶，其中海藻糖酶提 供改善的特征，诸如发酵期间较健康的酵母细胞、改善的乙醇产率或延长的乙醇生产。海藻 糖酶可在发酵开始或发酵期间添加。
[0010] 本发明还提供改善发酵反应中乙醇生产的方法，该方法包括在整个发酵反应中保 持海藻糖水平低于阔值水平，其中阔值水平低于发酵开始时海藻糖浓度的两倍（％wt/v)。 本发明还提供改善发酵反应中乙醇生产的方法，该方法包括将海藻糖酶添加到发酵反应 中，从而在整个发酵反应中保持海藻糖水平低于阔值水平，其中阔值水平低于未将海藻糖 酶添加到过程中时在发酵期间将存在的海藻糖浓度的一半（％wt/v)。
[0011] 本发明还提供如上文所公开的方法，该方法还包括附加酶，该附加酶选自：酷基转 移酶、Q-淀粉酶、e-淀粉酶、Q-半乳糖巧酶、阿拉伯糖巧酶、芳基醋酶、e-半乳糖巧酶、卡拉胶 酶、过氧化氨酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、软骨素酶、角质酶、内切-e-1,4-葡聚糖酶、内 切-e-甘露聚糖酶、醋酶、外切-甘露聚糖酶、半乳聚糖酶、葡糖淀粉酶、半纤维素酶、透明质 酸酶、角蛋白酶、漆酶、乳糖酶、木质素酶、脂肪酶、脂氧合酶、甘露聚糖酶、氧化酶、果胶酸裂 解酶、果胶乙酷醋酶、果胶酶、戊聚糖酶、过氧化物酶、酪氧化酶、憐酸酶、憐脂酶、植酸酶、多 聚半乳糖醒酸酶、蛋白酶、普鲁兰酶、还原酶、鼠李-半乳糖醒酸酶、e-葡聚糖酶、较酸酶、转 谷氨酷胺酶、木聚糖乙酷醋酶、木聚糖酶、木葡聚糖酶和木糖巧酶。
[0012] 本发明还提供用于通过除去海藻糖来改善在包含液化液和回糟(backset)的发酵 反应中乙醇生产的方法，包括使用海藻糖酶，其中海藻糖水平低于发酵反应的0.01%w/v。 本发明还提供一种用于通过从包含回糟的液化中除去海藻糖来改善发酵反应中乙醇生产 的方法，包括通过用海藻糖酶处理来除去回糟中的海藻糖，其中海藻糖水平低于回糟的 0.05%w/v〇
[0013] 附图简述
[0014] 图1-3示出在发酵期间用于各种海藻糖酶浓度和对照的海藻糖的浓度。
[0015] 图4示出在36°C下具有和不具有海藻糖酶的海藻糖特征图。
[0016] 图5示出在36 °C下具有和不具有海藻糖酶的DP2特征图。
[0017] 图6示出在36°C下具有和不具有海藻糖酶的最终乙醇产生特征图。
[0018] 图7和图8示出具有或不具有海藻糖酶的各种发酵的乙醇产生特征图。
[0019] 图9示出后续发酵中海藻糖的水平。
[0020] 详细描述
[0021] 本发明描述了包含海藻糖酶的组合物和包括海藻糖酶的方法。本发明的海藻糖酶 可来自原核生物或真核生物，诸如来自真菌，具体地讲来自木霉真菌。海藻糖酶的示例性应 用是针对基于淀粉的糖化和发酵。糖化和发酵可同时进行(SSF)。下文详细地描述组合物和 方法的运些方面和其它方面。
[0022] 在描述本发明的组合物和方法的各种方面和实施方案之前，描述W下定义和缩 与。
[0023] 1.定义和缩写
[0024] 根据此详述，应用W下缩写和定义。除非上下文另外明确地规定，否则单数形式 "一个"、"一种"和"所述"包括多个指代物。因此，例如，提及"酶"包括多种此类酶，而提及 "剂量"包括提及一种或多种剂量W及本领域技术人员已知的它们的等同物，W此类推。
[0025] 本文件为了便于阅读而组织成多个节;但是，读者应理解在一节中做出的说明可 适用于其它节。运样，用于本公开的不同节的标题不应理解为限制性的。
[0026] 除非另外定义，否则本文所用的所有技术性和科学性术语具有与本领域的普通技 术人员常常所理解的相同含义。下文提供W下术语。
[0027] 1.1.缩写和首字母缩写
[0028] 如下缩写/首字母缩写具有如下含义，除非另外指明：
[0029] ABTS 2,2-连氮基-双-3-乙基苯并嚷挫嘟-6-横酸
[0030] AE或AEO 醇乙氧基化物
[0031] AES或AEOS 醇乙氧基硫酸盐
[0032] AkAA 白曲霉（spe;rgillus kawachii)a-淀粉酶
[0033] AnGA 黑曲霉(Aspergillus niger)葡糖淀粉酶
[0034] AOS a-締控横酸醋
[00对 AS 烷基硫酸盐
[0036] cDNA 互补 DNA
[0037] CMC 簇甲基纤维素
[003引 DE 右旋糖当量
[0039] DNA 脱氧核糖核酸
[0040] D化 具有n个子单元的糖类聚合度
[0041 ] ds或DS 干固体
[0042] DTMPA 二亚乙基S胺五乙酸
[0043] EC 酶学委员会
[0044] 邸TA 乙二胺四乙酸
[0045] EO 环氧乙烧(聚合物片段）
[0046] EOF 发酵结束
[0047] GA 葡糖淀粉酶
[0048] GAU/g ds 葡糖淀粉酶活性单位/克干固体
[0049] HFCS 高果糖玉米糖浆
[00加]HgGA 灰腐质霉(Humicola grisea)葡糖淀粉酶
[0051 ] IPTG 异丙基e-D-硫代半乳糖巧
[0化2] IRS 不溶性残余淀粉
[0053] kDa 千道尔顿
[0化4] LAS 直链烷基苯横酸盐
[0055] LAT,BLA 地衣芽抱杆菌(B. Iicheniformis)淀粉酶
[0056] MW 分子量
[0057] MWU 修改的伍格母(Wohlgemuth)单位；1.6 X l〇-5mg/MWU =活性单位
[0化引 NCBI 国家生物技术信息中屯、
[0059] NOBS 壬酷径苯横酸盐
[0060] NTA 次氮基乙酸
[0061 ] OxAm Puras化r HPAM 5000L(Danisco US公司）
[0062] PAHBAH 对径基苯甲酸酷阱
[0063] PEG 聚乙二醇
[0064] pi 等电点
[0065] PI 性能指数
[0066] ppm 百万分之一，例如，yg蛋白质/g干固体
[0067] PVA 聚化締醇）
[006引 PVP 聚（乙締化咯烧酬）
[0069] RCF 相对离屯、/向屯、力（即，X重力）
[0070] RNA 核糖核酸
[0071] SAS 链烧横酸醋
[0072] SDS-PAGE 十二烷基硫酸钢聚丙締酷胺凝胶电泳
[0073] SSF 同时糖化和发酵
[0074] SSU/g固体可溶性淀粉单位/克干固体
[0075] SP. 菌种
[0076] TAED 四乙酷基乙二胺
[0077] I'm 解链溫度
[0078] TrGA 里氏木霉(Trichoderma reesei)葡糖淀粉酶
[0079] w/v 重量/体积
[0080] w/w 重量/重量
[0081] v/v 体积/体积
[0082] Wt % 重量 ％
[008引 V 摄氏度
[0084] 出0 水
[0085] 地2〇或01 去离子水
[00化]dl出0 去离子水，Mi Ili-Q过滤
[0087] g 或 gm 克
[0088] yg 微克
[0089] mg 毫克
[0090] kg 千克
[0091] 化和iil 微升
[0092] mL 和 ml 毫升
[0093] mm 毫米
[0094] 皿 微米
[0095] M 摩尔
[0096] ml 毫摩尔
[0097] m 微摩尔
[009引 U 单位
[0099] sec 秒
[0100] min(s) 分钟
[0101] hr(s) 小时
[0102] DO 溶解氧
[0103] Ncm 牛顿厘米
[0104] ETOH 乙醇
[010引 eq. 当量
[0106] N 当量浓度
[0107] MWCO 分子量截留量
[0108] SSRL 斯坦福同步福射光源
[0109] PDB 蛋白质数据库
[0110] CA巧 碳水化合物活性酶数据库
[0111] Tris-HCl ^巧圣甲基)氨基甲烧盐酸盐
[0112] 肥阳S 4-(2-径乙基)-1-赃嗦乙烧横酸
[0113] mS/cm 毫西口子/厘米
[0114] CV 柱体积
[0115] DP2 二糖
[0116] HPLC 高效液相色谱法
[0117] HPAEC-PAD 具有脉冲安培检测的高效阴离子交换色谱法
[011引IC 离子色谱法
[0119] RID 示差折射率检测器
[0120] Da 道尔顿(分子量），当提及kDa为千道尔顿时
[0121] 1.2.定义
[0122] 术语"海藻糖酶"是指将一个海藻糖分子催化生成两个葡萄糖分子(a-D葡萄糖和 P-D葡萄糖)的酶。海藻糖酶(a，a-海藻糖-I-C-葡萄糖水解酶，EC 3.2.1.28)。
[0123] 术语"淀粉酶"或"淀粉分解酶"是指尤其能够催化降解淀粉的酶。a-淀粉酶是裂解 淀粉中a-D-(l一4)0-糖巧键的水解酶。一般来讲，a-淀粉酶化C 3.2.1.1;a-D-(l一4)-葡聚 糖葡聚糖水解酶)定义为W随机方式裂解淀粉分子内a-D-(1^4)0-糖巧键产生含有S个或 更多个（l-4)-a-连接的D-葡萄糖单元的多糖的内切-作用酶。相比之下，外切-作用淀粉分 解酶诸如e-淀粉酶化C 3.2.1.2;a-D-( 1^4)-葡聚糖麦芽糖水解酶)和一些特定产物淀粉 酶如产麦芽糖Q-淀粉酶化C 3.2.1.133)裂解底物的非还原端的多糖分子。0-淀粉酶、a-葡 糖巧酶化C 3.2.1.20; a-D-葡糖巧葡萄糖水解酶）、葡糖淀粉酶化C 3.2.1.3; a-D-(1 一4)-葡聚糖葡聚糖水解酶）和特定产物淀粉酶如麦芽糖四巧酶（maItotetraosidaseS ,EC 3.2.1.60)和麦芽糖六巧酶(maltohexaosidases，EC 3.2.1.98)可产生特定长度的麦芽糖-低聚糖或特定麦芽糖低聚糖的富集糖浆。优选的葡糖淀粉酶为W下氨基酸序列的化GA变 体：
[0124]
[0125] "酶单位"在本文中是指在指定的测定条件下每个时间形成的产物的量。例如，"葡 糖淀粉酶活性单位"（GAU)定义为在60°C、pH 4.2下每小时从可溶性淀粉底物(4%DS)产生 Ig葡萄糖的酶的量。"可溶性淀粉单元"（SSU)为在pH 4.5、5(TC下每分钟从可溶性淀粉底物 (4%DS)产生Img葡萄糖的酶的量。DS是指"干固体'。
[0126] 术语"淀粉"是指包括植物的复合多糖碳水化合物的任何物质，包括具有式 (C姐10