植物调控元件及其使用方法
【专利说明】
[0001] W电子方式递交的序列表的引用
[0002] 创建于2013年8月26日、大小为4千字节的文件名为"4195邮？5?_36911611。6_ listing.txt"的序列表W计算机可读形式与本说明书同时提交。该序列表是本说明书的一 部分，并且全文W引用的方式并入本文。
技术领域
[0003] 本公开设及植物分子生物学领域，更具体地，设及植物中基因表达的调控。
【背景技术】
[0004] 异源DNA序列在植物宿主中的表达取决于该植物宿主中存在有功能的可操作地连 接的调控元件。选择的调控元件序列将决定异源DNA序列在生物体内表达的时间和位置。如 果期望在特定的组织或器官中表达，则可使用组织偏好的调控元件。如果期望基因响应刺 激而表达，则诱导型调控元件是首选调控元件。相比之下，如果期望在植物细胞中各处连续 表达，则采用组成型启动子。可W在转化载体的表达构建体中包含位于核屯、调控元件序列 上游和/或下游的附加调控序列，W便引起异源核巧酸序列在转基因植物中W不同水平表 达。
[0005] 本领域时常期望在植物中W组成型方式表达DNA序列。例如，可通过遗传操纵植物 基因组，使其包含可操作地连接至异源病原体抗性基因的组成型调控元件，使得所需的植 物组织中产生病原体抗性蛋白，从而使植物对±源和空气源病原体感染的抗性增强。
[0006] 另选地，可能需要抑制植物组织内天然DNA序列的表达W实现所需的表型。在运种 情况下，可采用下述方式实现运种抑制:转化植物，使其包含可操作地连接至反义核巧酸序 列的组成型启动子，使得反义序列表达，产生干扰天然DNA序列的mRNA翻译的RNA转录物。
[0007] 通过使用基因工程技术遗传地改变植物并且因此产生具有有用性状的植物，运要 求可获得多种启动子。在掌握大量启动子的基础上，研究人员可设计出能在细胞中期望的 位置W所需水平表达的重组DNA分子。因此，组成型启动子集合在一起，便可使新性状W所 需水平在期望的组织中表达。
[000引要实现运一点，需分离组成型调控元件并加W表征，用于对植物进行遗传操纵，其 中运些组成型调控元件可充当W实测组成型方式表达感兴趣的异源核巧酸序列的调控区。
【发明内容】
[0009]本公开提供了用于调控感兴趣的异源核巧酸序列在植物或植物细胞中表达的组 合物和方法。还提供了包含引发转录的调控元件的新型核巧酸序列的DNA分子。在一些实施 方案中，运种调控元件具有在植物细胞中引发转录的启动子活性。本公开的实施方案包括 下列序列：Wseq ID NO: USEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3示出的核酸序列或它们的互补序列； 包含SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3中至少20个连续核巧酸的核巧酸序列，其中 所述序列在植物细胞中引发转录；W及与WSEQ ID NO: USEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3示出 的序列具有至少85%序列同一性的核巧酸序列，其中所述序列在植物细胞中引发转录。
[0010] 本公开提供了一种用于在植物或植物细胞中表达异源核巧酸序列的方法。该方法 包括将表达盒引入植物或植物细胞，该表达盒包含可操作地连接至本公开的调控元件之一 的感兴趣的异源核巧酸序列。W此方式，调控元件序列可用于控制可操作地连接的异源核 巧酸序列的表达。在具体方法中，感兴趣的异源核巧酸序列W组成型方式表达。
[0011] 本公开还提供了一种在植物中W组成型方式表达感兴趣的核巧酸序列的方法。该 方法包括将表达盒引入植物细胞，该表达盒包含本公开的可操作地连接至感兴趣的异源核 巧酸序列的调控元件。
[0012] 感兴趣的核巧酸序列的表达可W提供对植物表型的修饰。运种修饰包括调节内源 产物的生成(数量、相对分布等方面)或者外源表达产物的生成，W在植物中提供新功能或 者产物。在特定的方法和组合物中，感兴趣的异源核巧酸序列包含的基因产物赋予除草剂 抗性、病原体抗性、昆虫抗性，和/或对盐、寒冷或干旱改变的耐受性。
[0013] 本公开还提供了表达盒，所述表达盒包含本公开的可操作地连接至感兴趣的异源 核巧酸序列的启动子序列。还另外提供了转化的植物细胞、植物组织、种子和植物。
【附图说明】
[0014] 图1示出了碧冬茄脉明病毒基因组中长基因间区域化IR)相对ORF 1的结构。只含 369个碱基对的调控区（TR)是含1049个碱基对的调控区(FL)的截短版。复制该截短调控元 件中含280个碱基对的一部分（W水平框示出），产生包含重复区段的序列（含649个碱基 对）。推定的TATA框W竖直框示出。
[0015] 图2示出了含369个碱基对的截短调控元件的核酸序列（SEQ ID N0:1)。该调控元 件中含280个碱基的那部分带下划线。推定的TATA框加阴影。
[0016] 图3示出了含1049个碱基对的调控元件的核酸序列（SEQ ID N0:2)。该调控元件中 含280个碱基的那部分带下划线。推定的TATA框加阴影。
[0017] 图4示出了含649个碱基对的重复调控元件的核酸序列（SEQ ID N0:3)。该调控元 件中第一个含280个碱基的部分带下划线。该调控元件中重复的第二个含280个碱基的部分 W斜体示出。推定的TATA框加阴影。
【具体实施方式】
[0018] 本公开设及针对植物启动子的组合物和方法W及它们的应用方法。本公开的组合 物包含碧冬茄脉明病毒(PVCV)调控区的核巧酸序列。本公开的组合物还包含DNA构建体，运 些DNA构建体包含的PVCV调控区的核巧酸序列可操作地连接至感兴趣的异源核巧酸序列。 具体地，本公开提供了分离的核酸分子，所述分离的核酸分子包含WSEQ ID NO: 1示出的核 巧酸序列及其片段、变体和互补序列。
[0019] 本公开的PVCV调控元件序列包括可W在植物中引发转录的核巧酸构建体。在特定 实施方案中，PVCV调控元件序列允许W组成型方式引发转录。本公开的运种构建体包括与 植物发育调控相关的受调控的转录起始区域。因此，本公开的组合物包含DNA构建体，运些 DNA构建体包含的感兴趣的核巧酸序列可操作地连接至PVCV调控元件序列。PVCV调控区序 列的一个来源WSEO ID NO: 1示出。
[0020] 本公开的组合物包含PVCV调控元件的核巧酸序列及其片段和变体。在特定实施方 案中，本公开的调控元件序列可用于W组成型方式表达感兴趣的序列。本公开的核巧酸序 列还可用于构建表达载体，运些表达载体后续用于在感兴趣的植物中表达异源核巧酸序 列，或用作探针，来分离其他PVCV样调控元件。
[0021] 调控元件
[0022] 调控元件是具有基因调控活性的核酸分子，也就是能够影响可操作地连接的可转 录多核巧酸分子的转录和/或翻译的核酸分子。因此，术语"基因调控活性"是指通过影响可 操作地连接的可转录多核巧酸分子的转录和/或翻译，而影响运种可操作地连接的可转录 多核巧酸分子表达的能力。基因调控活性可为阳性和/或阴性，并且所述影响可通过其下列 特性来表征：时间、空间、发育、组织、环境、生理、病理、细胞周期和/或化学响应等，还可通 过定量指示或定性指示来表征。
[0023] 调控元件(诸如启动子、前导序列、内含子和转录终止区）是具有基因调控活性的 核酸分子，也是活细胞基因整体表达不可缺少的一部分。术语"调控元件"是指具有基因调 控活性的核酸分子，也就是能够影响可操作地连接的可转录多核巧酸分子的转录和/或翻 译的核酸分子。因此，可通过基因工程方法，使用在植物中起作用的分离的调控元件(诸如 启动子和前导序列)来改变植物表型。
[0024] 调控元件可通过其表达模式来表征，即，被表征为组成型，并且/或者通过其下列 特性来表征:时间、空间、发育、组织、环境、生理、病理、细胞周期和/或化学响应表达模式W 及运些特性的任意组合，还可通过定量指示或定性指示来表征。启动子可用作调控元件，用 来调控可操作地连接的可转录多核巧酸分子的表达。
[0025] 如本文所用，"基因表达模式"为可操作地连接的核酸分子转录成转录的RNA分子 的任何模式。表达可通过其下列特性来表征:时间、空间、发育、组织、环境、生理、病理、细胞 周期和/或化学响应等，还可通过定量指示或定性指示来表征。转录的RNA分子可被翻译生 成蛋白质分子，或可形成反义RNA分子或其他调控RNA分子，诸如dsRNA、tRNA、rRNA、miRNA 等。
[0026] 如本文所用，术语"蛋白质表达"为转录的RNA分子翻译成蛋白质分子的任何模式。 蛋白质表达可通过其下列特性来表征：时间、空间、发育或形态等，还可通过定量指示或定 性指示来表征。
[0027] 如本文所用，术语"启动子"一般是指参与识别并结合RNA聚合酶II和其他蛋白质 (反式作用转录因子）W引发转录的核酸分子。启动子最初可从基因的基因组拷贝的5/非翻 译区（S^UTR)分离。另选地，启动子可为人工合成的DNA分子或受操纵DNA分子。启动子也可 为嵌合启动子，也就是通过融合两个或两个W上异源DNA分子而产生的启动子。
[0028] 在一个实施方案中，提供了本文所公开启动子序列的片段。启动子片段可表现启 动子活性，并且可单独用于、或与其他启动子和启动子片段结合用于(诸如)构建嵌合启动 子。在特定实施方案中，提供了启动子的多个片段，运些片段包含本文所公开的具有启动子 活性的多核巧酸分子中的至少约50、95、150、250、500或750个连续核巧酸。运些片段与参考 序列最佳比对时，可与参考序列具有至少约85%、约90%、约95%、约98%、约99%或更高的 同一'性。
[0029] 也可分析启动子或启动子片段中是否存在已知的启动子元件，也就是DNA序列特 性，诸如TATA-框和其他已知的转录因子结合位点基序。本领域技术人员可使用鉴定出的运 些已知的启动子元件，来设计与原始启动子具有相似表达模式的启动子变体。
[0030] 如本文所用，术语"增强子"或"增强子元件"是指顺式作用转录调控元件，亦称顺 式元件，其赋予整体表达模式的一个方面，但单靠其通常不足W驱动可操作地连接的多核 巧酸序列转录。增强子元件与启动子不同，通常不包含转录起始位点（TSS)和TATA框。天然 的启动子可包含一个或多个增强子元件，运些增强子元件影响可操作地连接的多核巧酸序 列转录。分离的增强子元件还可与启动子融合，W产生嵌合启动子顺式元件，该元件赋予整 体调控基因表达的一个方面。启动子或启动子片段可包含一个或多个增强子元件，运些增 强子元件影响可操作地连接的基因转录。据信，许多启动子增强子元件结合DNA结合蛋白 并/或影响DNA拓扑结构，从而产生局部构象，选择性地允许或限制RNA聚合酶接近DNA模板， 或有利于在转录起始位点处选择性打开双螺旋。增强子元件可结合调控转录的转录因子。 有些增强子元件不止结合一种转录因子，而且转录因子可W不同的亲和力与不止一个增强 子结构域相互作用。可采用多种技术鉴定增强子元件，包括:缺失分析，也就是从启动子5/ 端或内部缺失一个或多个核巧酸;使用D化sel足印法、甲基化干扰、电泳迁移率改变测定、 通过连接介导PCR执行的体内基因组足印法和其他常规测定进行DNA结合蛋白分析;或者使 用已知的顺式元件基序或增强子元件作为祀标序列或祀标基序，采用常规DNA序列比较方 法(诸如BLAST)进行DNA序列相似性分析。增强子结构域的精细结构可通过一个或多个核巧 酸的诱变(或置换)或通过其他常规方法进一步研究。增强子元件可通过化学合成获得，或 从包含运种元件的调控元件中分离获得;并且增强子元件可与另外的含有可用限制性酶切 位点的侧翼核巧酸一起合成，W便后续操纵。因此，本公开涵盖根据本文所公开的方法设 计、构建和使用增强子元件，用于调控可操作地连接的可转录多核巧酸分子的表达。
[0031] 如本文所用，术语"前导序列"是指从基因的基因组拷贝的5/非翻译区（S^UTR)分 离的DNA分子，并且通常被定义为位于转录起始位点(TSS)和蛋白质编码序列起始位点之间 的核巧酸区段。另选地，前导序列可为人工合成的DNA元件或受操纵DNA元件。前导序列可用 作5/调控元件，用来调控可操作地连接的可转录多核巧酸分子的表达。前导序列分子可与 异源启动子或其天然启动子一同使用。因此，本公开的启动子分子能够可操作地连接至其 天然前导序列，或能够可操作地连接至异源前导序列。如本文所用，术语"嵌合"是指通过将 第一个DNA分子与第二个DNA分子融合而生成的单个DNA分子，其中，第一个DNA分子和第二 个DNA分子通常都不会W该构型（也就是与另一个DNA分子融合的构型席在。因此，嵌合DNA 分子为通常原本不会天然存在的全新DNA分子。如本文所用，术语"嵌合启动子"是指将DNA 分子运样操纵而产生的启动子。嵌合启动子可结合两个或两个W上DNA片段;示例为由启动 子与增强子元件融合而成的嵌合启动子。因此，本公开涵盖根据本文所公开的方法设计、构 建和使用嵌合启动子，用于调控可操作地连接的可转录多核巧酸分子的表达。
[0032] 应理解，位于编码区序列的内含子内或编码区序列y的核巧酸序列也可有助于调 控感兴趣的编码区的表达。合适的内含子的示例包括但不限于玉蜀泰IVS6内含子，或玉蜀 泰肌动蛋白内含子。调控元件还可包括那些位于转录起始位点的下游(3/)的元件，或者位 于被转录的区域内的元件，或者同时W上两种情况。在本公开的上下文中，转录后调控元件 可包括在转录起始之后有活性的元件，例如翻译和转录增强子、翻译和转录阻遏子W及 mRNA稳定性决定子。
[0033] 可将本公开的调控元件或其变体或片段与异源调控元件或启动子可操作地关联， W便调控异源调控元件的活性。运种调控包括增强或抑制异源调控元件的转录活性、调控 转录后事件、或者增强或抑制异源调控元件的转录活性并调控转录后事件。例如，可将本公 开的一个或多个调控元件或其片段与组成型、诱导型或组织特异性启动子或其片段可操作 地关联，W调控运种启动子在植物细胞中的所需组织内的活性。
[0034] 本公开涵盖分离的或重组的核酸组合物。"分离的"或"重组的"核酸分子(或DNA) 在本文用来指不再处于其天然环境中，例如处于体外的或异源重组细菌或植物宿主细胞中 的核酸序列(或DNA)。分离的或重组的核酸分子或其生物活性部分，当通过重组技术产生时 基本上不含其他细胞材料或培养基，或者当用化学法合成时基本上不含化学前体或其他化 学物质。分离的或重组的核酸不含在衍生该核酸的生物体的基因组DNA中天然处于该核酸 旁侧的序列（也就是位于该核酸5/和y端的序列）（最典型地是蛋白质编码序列）。例如，在 多个实施方案中，分离的核酸分子可含有少于约化6、4此、3此、化6、化13、0.化6或0.1此的在 该核酸的来源细胞的基因组DNA中天然处于该核酸分子旁侧的核巧酸序列。本公开的PVCV 调控元件序列可从处于它们各自的转录起始位点旁侧的5/非翻译区分离。
[0035] 本公开还涵盖所公开的启动子核巧酸序列的片段和变体。具体地，可在本公开的 DNA构建体中使用沈Q ID NO: USEQ ID N0:2或沈Q ID N0:3所示PVCV调控元件序列的片段 和变体。如本文所用，术语"片段"是指核酸序列的一部分。PVCV调控元件序列的片段可保留 引发转录的生物活性，更具体地，W组成型方式驱动转录的生物活性。另选地，可用作杂交 探针的核巧酸序列片段可W不必保留生物活性。PVCV调控区核巧酸序列的片段范围可从至 少约20个核巧酸、约50个核巧酸、约100个核巧酸，最多至本公开的基因启动子区的全长核 巧酸序列。
[0036] PVCV调控元件的生物活性部分可通过分离本公开PVCV调控元件序列的一部分，随 后评估该部分的启动子活性来制备。作为PVCV调控元件核巧酸序列的片段的核酸分子，包 含至少约 16、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、800、900 或1000个核巧酸，或者最多至本文所公开全长PVCV调控元件序列中存在的核巧酸数(例如， 沈Q ID NO:2中的1049个核巧酸）。
[0037] 对于核巧酸