白介素-4受体结合融合蛋白及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及白介素-4受体结合融合蛋白。更具体地说，本发明部分地提供了包含 结合至促调亡Bd-2家族成员蛋白部分的白介素-4或者白介素-13蛋白部分的融合蛋白。
【背景技术】
[0002] 白介素-4(化-4)是由激活T细胞产生的多效性细胞因子，并且是所述IL-4受体 (IL-4R)的配体，其还可W结合至白介素-13(IL-13)。和很多细胞因子一样，白介素-4首先 接合至高度亲和性受体链(称为"a"),然后IL-4-a链复合物与第二低亲和力受体链(称为 "丫 C")结合。因此，比-4的初次结合链是比-4受体a(比-4Ra)，其W高亲和力(Kd =~10-1?) 结合。所述IL-Vlk4Ra复合物然后能够W相对较低的亲和力结合IL-4受体的第二组分，丫 c(I型受体）。另外，化-4/IL-4RQ复合物还能够结合白介素-13(化-13)受体al (化-13Ral) (II型受体）。
[0003] 不同的细胞类型表达不同量的I型和II型受体链。例如，比-4Ra存在于大多数细胞 上，而丫 C一般在造血细胞上表达，并且IL-13Ra 1 -般在非造血细胞上表达。因此，在T细胞、 自然杀伤(NK)细胞、嗜碱性细胞、肥大细胞W及大多数的小鼠 B细胞(大多数人类B细胞表达 丫 C和IL-13Ral两者）上见到的是丫 C而不是IL-13Ral。
[0004] -些骨髓源性细胞，包括巨隧细胞和树突状细胞，表达丫 C和IL-13Ral两者，并因 此响应IL-4和IL-13两者。在大多数非骨髓源性细胞包括平滑肌细胞和表皮细胞上见到IL-13Ral，但是几乎没有或者没有见到丫 C。
[0005] 已经提出过对I型和II型受体具有不同选择性的变体型IL-4分子（Junttila等 Na1:ure Qiemical Biology 8:990-998,2012.)。
[0006] 环状排列山：[1^111曰1'17 permuted)的分子是线性分子(例如配体）的末端已经直接 或者经由接头连接在一起从而产生环状分子的那些分子，此后所述环状分子在另一个位置 打开从而产生新的带有不同于原先分子的末端的末端的线性分子。化-4的环状排列变体已 经在例如于2000年1月4日授权给化Stan等的美国专利No. 6，Ol 1，002中有描述。
[0007] 程序化细胞死亡或者"调亡"是一种在动物细胞发育中常见的现象，并且受到主动 调节和被动调节运两者调节。除了其参与神经元和淋己样系统发育和整个细胞群稳态之 夕h调亡还在由调亡途径的异常调节引起的各种疾病和损伤中发挥重要的作用。例如，由调 亡引起的神经元细胞死亡的异常激活应参与了很多神经退行性疾病和症状，例如阿尔茨海 默氏症(Barinaga，Science 281:1303-1304)、亨廷顿氏舞蹈症、脊髓性肌肉萎缩症、中风过 程中导致的神经元破坏(在Rubin,化itish Med.Bulle. ,53(3):617-631,1997中有综述；W 及Barinaga,Science 281:1302-1303)、暂时性缺血性神经元损伤(例如，脊髓损伤)等。相 反，调亡的异常抑制能够导致细胞的过度增殖，从而导致癌症和其他类型的过度增殖性素 乱。
[000引调亡受到很多蛋白的调节，运些蛋白包含Bcl-2家族的成员。Bcl-2是被鉴定为调 节调亡的第一批蛋白之一（Cle ary 等，Cell 47:19-28，1986;Tsuji mo to 和 Croce, Proc.化tl .Acad. Sci .USA 83:5214-5218，1986)。由于它的发现，已经有若干个Bcl-2相关 蛋白（"8(：1-2家族蛋白"或者"8(31-2家族成员"）被鉴定为调亡的调节因子(胖11；[16,66]163 Dev. 10 :1-15，1996;化ng等，细胞80: 285-291，1995 ;Lomonosova，E.和G.化innadurai， Oncogene 27,82-819,2009)〇
[0009] 已经探索了用于治疗神经退行性疾病、癌症等的若干种治疗性试剂，但是运些治 疗性试剂表现出限制了它们在临床中的应用的多种局限性。例如，很多化学治疗性试剂通 过诱导正在增殖的寶生性细胞中的调亡来发挥作用，但是它们的治疗价值受到它们对正常 细胞具有毒性的程度的限制。使用标准调亡抑制性分子例如肤类半脫氨酸天冬氨酸蛋白酶 (caspases)抑制剂(例如DEVD类)进行的治疗已经证明由于运些抑制剂具有低的膜渗透性 而无法满意地用于临床工作。
[0010] 已经提出祀向免疫毒素(在有毒分子例如细菌毒素和通常衍生自抗体分子的祀向 域之间的遗传融合或者生物化学融合）W尝试选择性地消除癌症分子。例如，已经生成白喉 毒素(DT)变体并且测试了它们选择性地杀灭癌症细胞的能力(Tho巧e等，^^re 271:752-755，1978;Laske等，化Uire Medicine 3:1362-1368，1997)。类似地，已经研究了假单胞菌 (Pseudomonas)外毒素（PE)融合蛋白作为潜在的癌症疗法化reitman和化Stan,Blood 90: 252-259，1997; Shimamura等化ncer Res. 67:9903-9912; 2007)。
【发明内容】
[0011] 本发明设及白介素-4受体结合融合蛋白。更具体地说，本发明部分地提供了包含 结合至促调亡Bd-2家族成员蛋白部分的白介素-4受体结合融合蛋白部分的融合蛋白及其 应用。
[0012] 在一个方面，本发明提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白包含白介素-4(化-4)受 体结合蛋白和促调亡Bd-2家族多肤。在一些实施方式中，所述IL-4受体结合蛋白可W是环 状排列的（CP)。在一些实施方式中，所述Bcl-2家族多肤可W是包含B册域的促调亡Bd-2家 族多肤（例如8曰(1、814/抓4、81(1、81111/8〇(1、化4、8曰4或者8曰义）。所述肌3域可^进一步包含降 低憐酸化的突变。进一步包含降低憐酸化的突变的包含BH3域的所述促调亡Bd-2家族多肤 是Bad多肤。所述融合蛋白可能能够抑制细胞存活、抑制细胞增殖、或者促进表达IL-4R的祀 细胞的细胞死亡或者调亡。
[0013] 在一些实施方式中，所述IL-4受体结合蛋白可W是对与I型或II型IL-4受体（化-4R)的结合具有选择性的突变型IL-4或者IL-13。对与II型IL-4R的结合具有选择性的所述 突变型IL-4可W包括KFR变体或者KF变体。对与I型IL-4R的结合具有选择性的所述突变型 IL-4可W包括RGA变体。突变型IL-13可W是Al 1变体或者DN变体。
[0014] 在一些实施方式中，所述融合蛋白可W进一步包含接头。所述接头可W具有序列 GS或者是泛素或者泛素变体分子。所述融合蛋白可W包含在SEQ ID N0:24-27中给出的序 列。
[0015] 在一些方面，提供了编码本文所述的融合蛋白的核酸分子、或者包含所述核酸分 子的载体、或者包含所述载体的宿主细胞。在一些方面，提供了编码如在SEQ ID N0:24-27 中给出的融合蛋白的核酸分子或者包含SEQ ID N0:35-38的核酸分子。
[0016] 在一些方面，提供了包含本文所述的融合蛋白、编码所述融合蛋白的核酸分子、或 者包含所述核酸分子的载体、或者包含所述载体的宿主细胞的药物组合物。
[0017] 在一些方面，提供了一种诱导细胞死亡的方法，所述方法通过如下方式来进行：向 需要的受试者施用包含促调亡Bd-2家族多肤的融合蛋白、编码所述融合蛋白的核酸分子、 包含所述核酸分子的载体、或者包含所述载体的宿主细胞。
[0018] 在一些方面，提供了一种诱导细胞死亡的方法，所述方法通过如下方式来进行:使 表达IL-4R的祀细胞与包含促调亡Bd-2家族多肤的融合蛋白、编码所述融合蛋白的核酸分 子、或者包含所述核酸分子的载体接触。
[0019] 在一些方面，提供了一种治疗癌症的方法，所述方法通过如下方式来进行：向需要 的受试者施用包含促调亡Bcl-2家族多肤的融合蛋白、编码所述融合蛋白的核酸分子、包含 所述核酸分子的载体、或者包含所述载体的宿主细胞。
[0020] 在一些方面，提供了一种治疗癌症的方法，所述方法通过如下方式来进行:使表达 比-4R的寶生性细胞与包含促调亡Bd-2家族多肤的融合蛋白、编码所述融合蛋白的核酸分 子、或者包含所述核酸分子的载体接触。
[0021] 在一些方面，提供了一种治疗癌症的方法，所述方法通过如下方式来进行:使在需 要的受试者中的肿瘤微环境中表达IL-4R的非恶性细胞与包含促调亡Bcl-2家族多肤的融 合蛋白、编码所述融合蛋白的核酸分子、或者包含所述核酸分子的载体接触。在一些实施方 式中，所述非恶性细胞在所述受试者开始治疗之前进行接触。
[0022] 在一些方面，提供了一种治疗过度增生性疾病或者分化性疾病的方法，所述方法 通过如下方式来进行：向需要的受试者施用：包含促调亡Bcl-2家族多肤的融合蛋白、编码 所述融合蛋白的核酸分子、或者包含所述核酸分子的载体。所述过度增生性疾病或者分化 性疾病可W是纤维化症或增生症、炎性疾病或自身免疫疾病。所述纤维化症或增生症可W 是肺纤维化症或增生症(例如良性前列腺增生症）、屯、肌纤维化症、或者肝纤维化症;所述炎 性疾病可W是前列腺炎、春季型角膜结膜炎、动脉粥样硬化症或者特发性肺炎;或者所述自 身免疫疾病可W是格雷夫氏症。
[0023] 在一些方面，提供了包含促调亡Bcl-2家族多肤的融合蛋白、编码所述融合蛋白的 核酸分子、或者包含所述核酸分子的载体用于诱导需要的患者中的细胞死亡、或者治疗诱 导需要的患者中的过度增生性或者分化性疾病的应用。
[0024] 在另外可选的方面的各个实施方式中，所述受试者可W是人类。
[0025] 本
【发明内容】
部分不一定描述本发明的所有特征。
【附图说明】
[0026] 根据下文的其中参考附图的说明可W使本发明的运些和其他特征更加清楚，其 中：
[0027] 图1是祀T 24a表达载体中的cpIk4BAD(cp比-4g:s-BADaa)的展示图；
[002引图2是显示cpIL-4BAD(cpIL-4BADaa)对IL-4Ra阳性肿瘤细胞化251)生活力的影 响的曲线图；
[0029] 图3是显示邱比-4BAWcp比-4BADaa)(矩形）在过量比-4(S角形）存在的情况下对 IL-4Ra阳性肿瘤细胞化251)生活力的影响的曲线图；
[0030] 图4是显示cpIL-4BAD(cpIL-4BADaa)对IL-4Ra阳性肿瘤细胞(Daudi细胞）生活力 的影响的曲线图；
[0031] 图5是显示邱比-4BAWcp比-4BADaa) (S角形）在过量化-4(矩形）存在的情况下对 IL-4Ra阳性肿瘤细胞化Udi生活力的影响的曲线图；
[0032] 图6是显示cpIL-4BAD(cpIL-4BADaa)对IL-4Ra阳性肿瘤细胞化251)菌落数量的 影响的曲线图；
[0033] 图7是显示使用U251肿瘤细胞形成皮下神经胶质瘤肿瘤之后在无胸腺小鼠中肿瘤 内（矩形)和腹膜内角形)注射CPIL-4BAD的效果的曲线图（圆圈=对照）；
[0034] 图8是显示邱化-4BAD治疗小鼠（肿瘤内注射组二空白棱形，腹膜内注射组=立角 形，对照=实屯、棱形）；的存活的曲线图；
[0035] 图9显示了 pGW07大肠杆菌化.coli)表达载体的展示图；
[0036] 图 IOA-F 显示了 IL-4BAD(A-B)、cpIL-4BAD(C-D)和 CPS4-BAD 化-F)融合构建体的核 酸(SEQ ID NO:29、30和32)和氨基酸序列（SEQ ID NO: 18、19和21);
[0037] 图IlA-B显示了地FR4-B AD-H6融合构建体的核酸(A;SEQ ID N0:37)和氨基酸序 列（B;SEQ ID NO:26)。
【具体实施方式】
[0038] 本发明部分地提供了包含结合至促调亡Bcl-2家族蛋白的IL-4R结合蛋白的融合 蛋白及其应用。
[0039] 比-4R结合蛋白
[0040] 比-4R结合蛋白包括比-4和比-13。
[0041] IL-4蛋白或者IL-4"蛋白部分"包括天然的IL-4蛋白W及变体型IL-4蛋白。本文使 用的"天然的"或"野生型"比-4序列是指人类比-4序列，不管是从天然来源纯化还是使用重 组技术制得，并且包含如下氨基酸序列(在N末端带有额外的甲硫氨酸）：
[0042] MHKCDHL 犯 IIKTLN 化 Teqkiictcltvtdifaaskntte 邸 TFCRAATVLRQFYSH 肥邸 TR 化 GATAQQFHRH KQLIRFLKRLDRNLWGLAGLNSCPVKEANQSTLENFLERLKTIMREKYSKCSS(沈Q ID N0:1).
[0043] 另外可选的人类IL-4序列包含如下氨基酸序列(在N末端带有额外的甲硫氨酸）：
[0044] MHKCDHL 犯 IIKTLN 化 TEQKllCTCLTVTDIFAASiq^TTE 邸 TFCRAATVLRQFYSH 肥邸 TR 化 GATAQQFHRH KQLIRFLKRLDRNLWGLAGLNSCPVKEANQSTLENFLERLKTIMREKYSKCSS(沈Q ID N0:2).
[0045] 在一些实施方式中，可W在本公开内容的所述融合蛋白中使用的IL-4蛋白是变体 型IL-4蛋白，该变体型IL-4蛋白对丫 c(I型受体)具有比对IL-13Ral(II型受体）的选择性高 的选择性，或者反之亦然，例如在Junttila等（Nature化emical Biology 8:990-998， 2012)中所述。在一些实施方式中，对丫 c(I型受体)具有高的选择性的变体型IL-4蛋白是相 对于天然人类IL-4(例如SEQ ID N0:1)的序列或者另外可选的IL-4序列（例如，SEQ ID NO: 2)而言包含如下突变的IL-4蛋白（编号排除了在N末端的甲硫氨酸）：R121Q/Y124W/S125F ( (书GA"或者"supe;r-4"或者"S4"变体），如在例如Junttila等（化ture 化emical Biology 8:990-998,2012)中所述。
[0046] 在一些实施方式中，对IL-13Ral(II型受体)具有高的选择性的变体型IL-4蛋白是 相对于天然人类IL-4(例如，SEQ ID N0:1)或者另外可选的IL-4序列（例如，SEQ ID N0:2) 而言包含如下突变的IL-4蛋白（编号排除了在N末端的甲硫氨酸）：R12化/Y124F/S125R (乂邮'或者乂FR4"变体)或者R12化/Y124F (乂口'变体）。
[0047]在一些实施方式中，能够在本公开内容的融合蛋白中使用的IL-4蛋白是环状排列 的（circularly permuted,CP)，如在例如在2000年1月4日授予化Stan等的美国专利No.6, Oll，002中所述。在一些实施方式中，能够在本公开内容的融合蛋白中使用的cpIL-4蛋白包 括其中使用GGNGG接头和起始的甲硫氨酸残基将另外可选的IL-4序列（例如，SEQ ID N0:2) 或者天然人类IL-4(例如，SEQ ID NO: 1)的残基38-129结合至残基1-37的如下IL-4蛋白（编 号排除了在N末端的甲硫氨酸）：
[004引 M2TTEKETFCRAATVLRQFYSHHEKDTRCLGATAQQFHRHKQLIRFL邸LDRNLWGLAGLNSCPVKEANQSTLENFL 邸LKTIMREKYSKCSSGGNGG服CDIii犯IIKTLN化Teqolctcltvtdifaas(沈Q ID N0:3).
[0049]在一些另外可选的实施方式中，能够在本公开内容的融合蛋白中使用的cpIL-4蛋 白包括其中在"RGA"或者"super-4"或者"S4"变体的情况中使用GGNGG接头和起始的甲硫氨 酸残基将另外可选的IL-4序列（例如，SEQ ID N0:2)或者天然人类IL-4(例如，SEQ ID NO: 1)的残基38-129结合至残基1-37的如下IL-4蛋白（编号排除了在N末端的甲硫氨酸）：
[(K)加] M2TTEKETFCRAATVLRQFYSHHEKDTRCLGATAQQFHRHKQLIRFL邸LDRNLWGLAGLNSCPVKEANQSTLENFL 邸巧XIM巡K坚Kq^GGNGG服CDUL犯IIKTLN化Teqolctcltvtdifaas(沈Q ID NO:4).
[0051]在一些另外可选的实施方式中，能够在本公开内容的融合蛋白中使用的cpIL-4蛋 白包括其中在"KFR"变体的情况中使用GGNGG接头和起始的甲硫氨酸残基将另外可选的比-4序列（例如，SEQ ID N0:2)或者天然人类IL-4(例如，SEQ ID N0:1)的残基38-129结合至残 基1 -37的如下IL-4蛋白（编号排除了在N末端的甲硫氨酸）：
[0化2] M2TTEKETFCRAATVLRQFYSHHEKDTRCLGATAQQFHRHKQLIRFL邸LDRNLWGLAGLNSCPVKEANQSTLENFL 邸LKTiMj^EK些KCSSGGNGG服CDUL犯IIKTLN化Teqolctcltvtdifaas(沈Q ID N〇:5).
[0053]在一些另外可选的实施方式中，能够在本公开内容的融合蛋白中使用的cpIL-4蛋 白包括其中在"Kr变体的情况下使用GGNGG接头和起始的甲硫氨酸残基将另外可选的IL-4 序列（例如，SEQ ID N0:2)或者天然人类IL-4(例如，SEQ ID NO: 1)的残基38-129结合至残 基1 -37的如下IL-4蛋白