质 粒CPIL-4BAD转导化21(DE3)pLysS细菌进行制备。将新鲜转换的细菌铺板在含有卡那霉素 的LB上。挑取菌落并且将其转移到1升的富含葡萄糖、MgCb和卡那霉素的超级肉汤中，并且 使用ImM IPTG诱导细胞。监测细胞生长6小时。将IL-4-BAD融合蛋白重新折叠并且使用 HiTrap柱纯化，然后经过两个循环的MonoS柱，此后通过SDS-PAGE电泳评价cpIL-4-BAD级 分。运个策略在pH为6.5时获得了约0.980mg/L的cpIk4BAD，并且在pH为6.8时获得了约 2.930mg/L的 CP ]X-4BAD。
[0214]将比-4Ra阳性肿瘤细胞化251细胞和Daudi细胞)按一式四份铺板在6孔陪替氏培 养皿的完全培养基中过夜。添加0.1至lOOOng/mL的CP化-4BAD，并且将平板在C〇2培养箱中 于37°C培养5天。在第5天，使用IXPBS洗涂平板，并且采用膜蛋白酶处理使细胞分离。经过膜 蛋白酶失活后，使用台吩蓝排阻技术（trypan blue exclusion technique)对活细胞进行 计数。
[0215]结果表明，cpIk4BAD融合蛋白在体外W浓度依赖方式杀死了U 251细胞，ICso值为 约0.611邑/1111^图2)。100倍过量的化-4阻断了邱化-4840杀死1]251细胞的能力，表明。口化-4BAD活性具有特异性（图3)。而且，在5天的细胞活力分析中，ICso值从约0. ：3ng/mL增加至〉 lOOOng/mLo
[0216] CP比-4BAD融合蛋白在体外W浓度依赖方式杀死了Daudi细胞IC日日值为约0.1 ng/mL (图4)。100倍过量的化-4也阻断了。口化-4840杀死0曰11山细胞的能力，表明。口比-4840活性具 有特异性（图5)。在5天的细胞活性分析中，ICso值从约0.化g/mL增加至〉10(K)ng/mL。
[0217] 在菌落形成分析中还发现，CP化-4BAD融合蛋白降低了 IL-4Ra阳性肿瘤细胞的菌 落数量。更具体地说，5000U 251的细胞被铺板在IOcm培养板(总共6板)上，添加CPIL-4BAD 并将细胞培养10天。使用水晶蓝(灯ystalBlue)对菌落进行染色并计数。结果表明，cplX-4BAD在体外W浓度依赖方式降低了U 251菌落数量，且ICso值为约5ng/mL(图6)。
[0218] 在使用U 251肿瘤细胞形成皮下神经胶质瘤肿瘤之后，在无胸腺小鼠中评价了 CPIL-4BAD融合蛋白的有效性。更具体地说，WlO化g/kg肿瘤内（IT)注射(注射6次)和WlOO yg/kg腹膜内（IP)注射(注射6次)CPIk4BAD。使用0.2%HAS/PBS作为媒介物对照。所评价的 端点是肿瘤尺寸和存活。结果表明，6次注射后，IT施用CPIL-4BAD与安慰剂对照处理动物相 比显著地使肿瘤生长减退。IP施用与IT处理小鼠相比强烈地使肿瘤减退。两组小鼠的肿瘤 都超过40天才复发，出于道德原因而对对照组的小鼠实施安乐死，因为肿瘤在36天时具有 2000mm 3(图7)dCpIL-4BAD-处理小鼠的存活也长于安慰剂处理小鼠（图8)。
[0219] 实施例3
[0220] 在相同的实验条件下测试了 6个另外的IL-4Ra阳性细胞系对CPIL-4BAD融合蛋白 和CPIL-4PE的敏感性。通过使用台吩蓝排阻技术对细胞进行计数来确定ICso值。
[0扣。表3.a-4Ra阳性细胞系的IC日0值。
[0222]
[0223] 实施例4
[0224] 表达并纯化IL-4BAD，cpIL-4BAD和CPS4-BAD融合蛋白。更具体地说，通过PCR将IL-4BAD，CP比-4BAD和CPS4-BAD的cDNA克隆至ljpGW07大肠杆菌表达载体的BamFII AhoI位点（图 9)。通过DNA测序证实所得的载体(图10A-D)。
[02巧]在大肠杆菌细胞中进行蛋白表达。将IL-4BAD，cpIL-4BAD和CPS4-BAD蛋白W非溶 性形式表达在IL培养物中，使用IMAC在变性条件下对它们进行纯化，然后进行"快速稀释" 蛋白重新折叠。通过"快速稀释"进行重新折叠产生没有凝聚物的完整蛋白，如通过非还原 性SDS-PAGE所确定的那样。最终的样品量和浓度如下：a-4BAD为约3.5mL，0.24mg/血，根据 UV280nm(UV280nm Abs，Img/ml = 1.14)测定；cp化-4BAD为约3.5mL，0.23mg/mL，根据 UV280nm(UV280nm Abs，Img/mL = 1.13)测定；并且cpS4-BAD为约3.5mL，0.23mg/mL，根据 UV280nm化V280nm Abs，Img/ml = 1.25)测定。将蛋白保存在如下保存缓冲组合物中：500nM Na化，10mMNa-憐酸盐，pH7.0，l%甘油，化M邸TA，0.01%吐溫20(Tween20)。
[0226] BL21(DE3)pLysS-RARE2 细胞使用 IL-4BAD、cpIk4BAD 和 cpS4-BAD 蛋白表达构建体 进行转化，并且将它们铺板在补充有10化g/mL的Amp的LB板上并在37°C过夜。第二天，从培 养板刮下菌落并且将它们重新悬浮在含有10化g/mL的Amp的液体LB培养基中。然后让培养 物在37°C生长并通风，并且在细胞培养物的ODsqq达到约0.5时使用ImM IPTG诱导蛋白表达。 诱导在30°C持续约4小时。然后收集细胞沉淀并且保存在-20°C。通过在95°C在50化的还原 性蛋白上样缓冲液中煮沸10分钟将IOyl的非诱导和诱导的培养物样品裂解，并在SDS-PAGE 凝胶上进行电泳。来自诱导后4小时时收集的ImL样品的细胞在低渗缓冲液中裂解，超声处 理并在13,000rpm离屯、10分钟。在还原性蛋白上样缓冲液中煮沸来自可溶性和非溶性级分 的等分试样并在SDS-PAGE凝胶上对它们进行分析。所估测的IL-4BAD、CPIL-4BAD蛋白的表 达水平为大于50mg/L粗制材料。所估测的CPS4-BAD的表达水平为大于50mg/L。发现IL-4BAD 几乎是完全不可溶的，带有一些可能可溶形式（小于5% ) "cpS4-BAD主要在不可溶性级分 中。
[0227] 在室溫裂解来自诱导培养物的细胞沉淀，并且收集内涵体级分（inclusion bodies fraction)并使用PBS-T洗涂。将不可溶性物质溶解在8M尿素中并结合至3mL儀载树 脂(Ni-Charged resin)。所述树脂使用15CV的洗涂缓冲液洗涂，并且将所结合的蛋白在洗 涂缓冲液中的8CV步梯度咪挫洗脱液中进行洗脱。将7.化1的各个级分在SDS-PAGE凝胶上进 行分析。将含有最大量的化-4BAD (约6mg)和CPIL-4BAD (约Smg)的级分合并并进行重新折 叠。剩下的级分在-20°C保存。
[0228] 合并IL-4BAD和CPIL-4BAD级分，通过添加ImM DTT进行还原，并且在保存缓冲液 (150mM NaCiaomM HEPES(pH 7.4)、0.01%Tween 20)中进行缓慢的逐步透析，且在每次改 变透析缓冲液时补充浓度逐渐减小的尿素。在每次透析步骤之后通过紫外光分光光度计测 量蛋白浓度：比-4BAD为约0. Smg，而CP比-4BAD为约0.45mg。然后将样品在SDS-PAGE凝胶上 进行分析。
[0229] 将25化的每种蛋白（约0.6mg/mL、20OmM咪挫级分）稀释在1 ml的如下缓冲液中： 20mM 肥阳S(抑 7.4)、1%甘油、IOiiM EDTA、0.01%Tween(缓冲液Na-憐酸盐(pH 7.0)、l%甘油、l化M抓TA、0.01%Tween(缓冲液2);和PBS(抑7.2)(缓冲液3)。将样品在 室溫保存过夜。第二天，将样品在13，OOOrpm旋转10分钟，观测到每个样品中沉淀的存在并 记录在表2中：（+++)表示丰富的沉淀；（-)表示没有可见沉淀。
[0230] 表2:在缓冲液1、2、和3中的IL-4BAD和CPIL-4BAD沉淀。
[0231]
[0233] 还在非还原性SDS-PAGE凝胶上分析样品。使用Amicon IOkDa MWCO将重新折叠的 样品浓缩至10化L，旋转沉降，并且将每个样品的7.化L的等分试样在SDS-PAGE凝胶上电泳。 [0234] 使用快速稀释折叠重复纯化过程。将含有IL-4BAD、cpIL-4BAD或者CPS4-BAD的4ml 的200mM咪挫级分快速稀释在200mL的重新折叠缓冲液（500mM化Cl、10mMNa-憐酸盐(pH 7.0或者6.0或者7.8)、l%甘油、10i^MEDTA、0.01%Tween)中，在室溫诱导过夜，在4， 00化pm在4°C旋转沉降20分钟，使用Amicon IOkDa MWCO浓缩至3mL，并且使用DG-IO柱缓冲 交换至保存缓冲液(500mM NaCUlOmM化-憐酸盐(pH 7.0或者6.0或者7.8)、1%甘油、化M EDTA、0 . Ol %Tween)中。最终的样品浓度如下：3.5mL的IL-4BAD，约0.24mg/mL 3.5mL的 CPIL-4BAD，约0.23mg/mL。将最终的样品在SDS-PAGE凝胶上电泳。
[02；3日]CPS4-BAD的最终浓度为约3.5mL，约0.23mg/mL。将最终的样品在SDS-PAGE凝胶上 电泳。
[0236] 实施例5
[0237] PKFR4-BAD-H6融合蛋白（图11A-B)制备如下：通过PCR将的地FR4-BAD-册的cDNA克 隆到祀T-21a( + )载体的NdelAhol位点。然后将所述载体转化到HMS174(DE3)细胞中并使用 0.1 mM IPTG诱导3小时。在诱导之前和诱导之后将样品在SDS-PAGE凝胶上电泳。使细胞沉淀 并且通过在含有20mM化is-HCl、300mM化ClJOmM咪挫(pH 8.0)的缓冲液中进行超声处理 来裂解，并将样品在SDS-PAGE凝胶上电泳。
[0238] 将内涵体（Inclusion bodies)溶解在溶解缓冲液(20mM Tris-肥l、300mM化CU 20mM咪挫、2OmM0-ME、7M Gua肥1、抑8.0)中。然后利用Ni2+亲和色谱法对上清液进行纯化。 在还原和非还原条件下使用20mM Tris-HCl、300mM化Cl、300mM咪挫、8M尿素 (pH 8.0)对 地FR4-BAD-册进行洗脱。在整个纯化过程中获取样品。
[0239] 纯化之后，将PKFR4-B AD-H6按如下方式在透析缓冲液中进行透析：0.1%TFA、 30 %乙腊，在还原性条件和非还原性条件下，获得约2.67mg/mL的浓度。
[0240] 实施例6
[0241] 为了评价融合蛋白对表达IL-4R的细胞系的效力，将表达I型IL-4R的HH悬浮细胞 培养在含有l〇%FBS(来自Life Technologies)、2mM ^谷氨酷胺（来自Gibco)和IOmM 肥阳S(来自Gibco)的RPMI1640(来自Gibco)中。添加 CPS4-BAD到细胞悬浮液中。W约IX IO4 细胞/孔的量将所述细胞悬浮液倒入到96孔分离板中。将所述细胞悬浮液在5%C02培养箱 在37 °C培养48小时。在48小时培养结束之前，制备在完全培养基中的10化Ci/mL的[3H]-胸 腺喀晚，并且将10化添加至每个孔的培养基中。使用巧]-胸腺喀晚培养6小时之后，将50化 的50%S氯乙酸缓慢添加至每个孔中并且在4°C培养2小时。然后使用去离子水(地2〇)将孔 板洗涂5次并进行空气干燥。将10化L的闪烁液添加到每个孔中并将孔板于室溫放置过夜。 第二天，在MicroBeta化iIux上读取放射活性。收集数据并且使用来自对照孔（只有细胞） 的读数进行标准化。从所有孔的读数减去背景读数性白）并计算抑制作用(抑制％ )ncpS4-BAD 的 ICsq为约 126.：3ng/mL，比用作参比的MDNA55kpIL4-PE;362.4ng/mL)的效力大约 3倍。
[0242] 在此通过参引方式将所有引用文献并入本文。
[0243] 已经就一个或者多个实施方式对本发明进行了说明。但是，本领域技术人员应当 理解的是，可W进行很多变化和改进而没有脱离根据权利要求书所限定的范围。
【主权项】
1. 一种融合蛋白，所述融合蛋白包含白介素-4(IL-4)受体结合蛋白和促凋亡Bcl-2家 族多肽。2. 根据权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述IL-4受体结合蛋白是环状排列的(cp)。3. 根据权利要求1或2所述的融合蛋白，其中，所述促凋亡Bcl-2家族多肽包含BH3域。4. 根据权利要求3所述的融合蛋白，其中，包含BH3域的所述促凋亡Bcl-2家族多肽是 Bad、Bik/Nbk、Bid、Bim/Bod、Hrk、Bak 或者 Bax。5. 根据权利要求3或4所述的融合蛋白，其中，包含BH3域的所述促凋亡Bcl-2家族多肽 进一步包含降低磷酸化的突变。6. 根据权利要求5所述的融合蛋白，其中，进一步包含降低磷酸化的突变的包含BH3域 的所述促凋亡Bcl-2家族多肽是Bad多肽。7. 根据权利要求1至6中任一项所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白能够促进表达IL-4受体(IL-4R)的靶细胞的细胞死亡或者凋亡、抑制细胞存活、或者抑制细胞增殖。8. 根据权利要求1至7中任一项所述的融合蛋白，其中，所述IL-4受体结合蛋白是对与I 型或II型IL-4R的结合具有选择性的突变型IL-4或者IL-13。9. 根据权利要求8所述的融合蛋白，其中，对与II型IL-4R的结合具有选择性的所述突 变型IL-4包含KFR变体或者KF变体，或者对与I型IL-4R的结合具有选择性的所述突变型IL-4包含RGA变体。10. 根据权利要求8所述的融合蛋白，其中，所述突变型IL-13包含All变体或者DN变体。11. 根据权利要求1至10中任一项所述的融合蛋白，所述融合蛋白进一步包含接头。12. 根据权利要求11所述的融合蛋白，其中，所述接头具有序列GS或者是泛素或者泛素 变体分子。13. 根据权利要求1或2所述的融合蛋白，所述融合蛋白包含SEQ ID NO:24至27中任一 个的氨基酸序列。14. 一种核酸分子，所述核酸分子编码权利要求1至13中任一项所述的融合蛋白。15. -种核酸分子，所述核酸分子包含SEQ ID NO:35至38中任一个的核酸序列。16. -种载体，所述载体包含权利要求14或15所述的核酸分子。17. -种宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求16所述的载体。18. -种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1至13中任一项所述的融合蛋白、 权利要求14或15所述的核酸分子、权利要求16所述的载体、或者权利要求17所述的宿主细 胞。19. 一种诱导细胞死亡的方法，所述方法包括向需要的受试者施用：权利要求1至13中 任一项所述的融合蛋白、权利要求14或15所述的核酸分子、权利要求16所述的载体、或者权 利要求17所述的宿主细胞。20. -种诱导细胞死亡的方法，所述方法包括使表达IL-4R的靶细胞与权利要求1至13 中任一项所述的融合蛋白、权利要求14或15所述的核酸分子、或者权利要求16所述的载体 接触。21. -种治疗癌症的方法，所述方法包括向需要的受试者施用：权利要求1至13中任一 项所述的融合蛋白、权利要求14或15所述的核酸分子、权利要求16所述的载体、或者权利要 求17所述的宿主细胞。22. -种治疗癌症的方法，所述方法包括使表达IL-4R的赘生性细胞与权利要求1至13 中任一项所述的融合蛋白、权利要求14或15所述的核酸分子、或者权利要求16所述的载体 接触。23. -种治疗癌症的方法，所述方法包括使在需要的受试者中的肿瘤微环境中表达IL-4R的非恶性细胞与权利要求1至13中任一项所述的融合蛋白、权利要求14或15所述的核酸 分子、权利要求16所述的载体、或者权利要求17所述的宿主细胞接触。24. 根据权利要求23所述的方法，其中，所述非恶性细胞在所述受试者开始治疗之前接 触。25. -种治疗过度增生性或者分化性紊乱的方法，所述方法包括向需要的受试者施用： 权利要求1至13中任一项所述的融合蛋白、权利要求14或15所述的核酸分子、权利要求16所 述的载体、或者权利要求17所述的宿主细胞。26. 根据权利要求25所述的方法，其中，所述过度增生性或者分化性紊乱是纤维化症或 增生症、炎性疾病或自身免疫疾病。27. 根据权利要求26所述的方法，其中，所述纤维化症或增生症是肺纤维化症或增生症 (例如良性前列腺增生症）、心肌纤维化症、或者肝纤维化症;所述炎性疾病是前列腺炎、春 季型角膜结膜炎、动脉粥样硬化症或特发性肺炎;所述自身免疫疾病是格雷夫氏症。28. 权利要求1至13中任一项所述的融合蛋白、权利要求14或15所述的核酸分子、权利 要求16所述的载体、或者权利要求17所述的宿主细胞用于在需要的患者中诱导细胞死亡、 或者治疗癌症、或者治疗过度增生性或者分化性紊乱的应用。29. 根据权利要求19、21、23至27所述的方法或者权利要求28所述的应用，其中，所述受 试者是人类。
【专利摘要】本发明涉及白介素-4受体结合融合蛋白。更具体地说，本发明部分地提供了包含结合至促凋亡Bcl-2家族成员蛋白部分的白介素-4受体结合融合蛋白部分的融合蛋白。
【IPC分类】C07K19/00, A61K47/48, A61P19/04, A61P35/00, C12N15/62, C12N15/24, C07K14/82, C07K14/715, C07K14/54
【公开号】CN105722982
【申请号】CN201480062147
【发明人】法赫尔·麦钱特
【申请人】梅迪塞纳医疗股份有限公司
【公开日】2016年6月29日
【申请日】2014年9月24日
【公告号】CA2925417A1, CN105764926A, WO2015042705A1, WO2015042706A1