专利名称：含可溶性肿瘤坏死因子II型受体和白介素I受体拮抗剂IL1Ra的融合蛋白，其制备方法，及 ...的制作方法
技术领域：
本发明涉及含可溶性肿瘤坏死因子II型受体和白介素I受体拮抗剂IL1Ra的融合蛋白，其制备方法，及其药物组合物。
背景技术：
类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis，RA)是一种世界范围内的常见疾病，体现为四肢关节红、肿、疼痛，严重影响患者的生活质量，如不治疗，一般2年内就可以造成关节强直畸形等永久性后遗症。在美国该病的发病率为将近1％[1]。国内尚无可靠的发病率统计数字，估计与美国接近，是严重影响健康的疾病，对社会造成的损失是难以估计的。
目前临床治疗RA的方案很多，首选用大剂量非甾体抗炎药可控制症状，如无效，则临床首选氨甲蝶呤等免疫抑制药治疗。约四分之一的患者首次发病后经及时治疗可终生不再复发，约二分之一的患者经治疗后症状暂时得以缓解，但仍会反复发作，部分最终发展为关节功能障碍；约四分之一的患者对目前所有的常规治疗均无效。
与RA炎症相关的细胞因子有白细胞介素-1(IL-1)，肿瘤坏死因子(TNF)，白细胞介素6(IL-6)等。这些细胞因子中，IL-1是对炎症最有影响的起直接作用的物质，它能引起严重的发炎。许多由IL-1诱发的炎症，可由IL-1受体拮抗剂预防和消除，IL-1Ra能抑制IL-1的全部作用，用IL-1Ra(商品名为Antri)治疗败血性休克的I、II、III期的临床研究取得较好的疗效。给急性类风湿关节炎病人皮下注射可溶性人重组IL-1RI，每天125-1000ug/m2，连续28天，约有半数病人的症状和体症明显改善。促进IL-1释放的物质，如脂多糖和内毒素也能间接引起炎症，因此通过阻断IL-1的释放，抑制IL-1的生成或抑制IL-1重转化酶(ICE)也能防止或消除炎症。
对RA直接作用的药物包括IL-1受体抗体、天然多肽类IL-1受体拮抗剂、天然有机化合物，及有机合成小分子。IL-1受体拮抗剂细胞因子是复杂的天然产物，包括能产生发炎和抗炎作用的化合物，IL-1和IL-1受体拮抗剂的平衡是一个精确的调控机制，它控制体内的发炎反应。如果发炎过于严重，IL-1受体拮抗剂会适度释放以保证发炎作用不至毁坏机体。如果体内IL-1受体拮抗剂释放不足，可采用注射的方法来对抗IL-1的作用。许多天然有机化合物能够阻滞由内毒素引起的IL-1的释放，但仅有少数具有能够在受体部位对抗IL-1的作用。
对RA的发病机理进行研究发现，TNF在该疾病的病理进程中也起着十分关键的作用，患者或动物模型病变关节腔内的TNF水平异常升高[4-7]。TNF是机体内的一种多功能免疫调节分子，它可以和细胞膜上的受体结合发挥作用，往往引起靶细胞的死亡(它的名称即来源于此)或招引免疫效应细胞在局部的聚集。由于目前尚不十分清楚的原因，它在关节腔内的含量大量升高，一方面和关节滑膜细胞的受体结合造成该细胞直接损伤，另一方面，它可以召集免疫效应细胞聚集至此，分泌更多的细胞因子，产生更强更持久的自身免疫反应。
将抗体分子片段与其它蛋白融合可得到具有多种生物学功能的融合蛋白，可将其分为二大类，一类是将Fv段与其它生物活性蛋白结合，利用抗体的特异性识别功能将某些生物活性引导于特定部位，导向治疗是其主要应用领域。另一类是含Fc段的抗体融合蛋白。Fc段可赋予免疫粘附素以下功能(1)通过与抗Ig或蛋白A结合用于检测或纯化；(2)Fc段介导的抗体效应功能，如ADCC、固定补体及调理作用等；(3)增加该蛋白在血液中的半衰期。
国外有人借助基因工程手段构建了人可溶性肿瘤坏死因子II型受体(sTNF-RII，又称为p75)与人Ig抗体Fc片段的融合蛋白，研究发现该融合蛋白在离体条件下对TNFa有中和作用，因此有可能开发成功治疗类风湿关节炎的特效药物。
基于以上所述，为了提供治疗RA更有效，更稳定的融合蛋白类药物，本发明进行了进一步的改进，将p75基因与IL-1受体拮抗剂IL1Ra采用生物工程手段进行连接，将它们的融合基因在适当的载体中进行表达，制备出功能性的融合蛋白。
发明内容
1.发明目的本发的明目在于提供含可溶性肿瘤坏死因子II型受体(p75)和白介素I受体拮抗剂IL-1Ra的融合蛋白。
本发明目的还在于提供编码所述融合蛋白的核酸分子。
本发明目的还在于提供制备本发明融合蛋白的方法。
本发明目的还在于提供含有本发明融合蛋白的药物组合物。2.技术方案为了实现本发明的目的，本发明实施了以下技术方案。
本发明提供了一种融合蛋白，包含人可溶性肿瘤坏死因子II型受体，人免疫球蛋白Fc片段和白介素I受体拮抗剂IL1Ra，其氨基酸序列包含SEQ ID NO1。
该融合蛋白的成熟活性形式共含619个氨基酸，其中第1-235位是p75的氨基酸序列(GeneBank NM_001066)，第236-467位是人Fc片段的氨基酸序列，第468-619位是IL-1Ra的氨基酸序列(GeneBank X50125)。当然，也可以将p75连接于Fc片段的C端而将IL-1Ra连接于其N端，得到SEQ ID NO2所示的融合蛋白本发明还提供了另一种融合蛋白，包含人可溶性肿瘤坏死因子II型受体，连接序列和白介素I受体拮抗剂ILIRa，其氨基酸序列包含SEQ ID NO3。
该融合蛋白的成熟活性形式共含619个氨基酸，其中第1-152位是IL-1Ra的氨基酸序列(GeneBank X50125)，第153-167位是连接序列，第168-402位是p75的氨基酸序列(GeneBank NM_001066)。同理，也可以将IL-1Ra连接于连接序列的C端而将p75连接于连接序列的N端，得到SEQ ID NO4所示的融合蛋白。
当将两个基因或基因片段重组成一个编码区构成融合蛋白的编码序列时，两个目标片段之间往往需要加入一个连接序列。连接序列的长度对两蛋白的折叠和稳定性非常重要。如果连接序列太短，可能影响两蛋白高级结构的折叠，从而互相干扰，如果连接序列太长，又涉及免疫原性的问题。设计连接序列时应遵循的一般原则包括1)要使用其编码的多肽不能具有形成二级结构的能力；2)其编码的多肽不能由糖基化信号；3)不能有过多的疏水氨基酸。有鉴于此，本发明设计了具有较好的弹性和疏水性的连接序列(Gly4Ser)3(SEQ ID NO9)，将IL-1Ra和可溶性肿瘤坏死因子受体p75分别连接于其两端。获得的融合基因克隆到真核表达载体，使其在CHO细胞中获得高效表达。
根据以上所述的氨基酸序列，本技术领域人员可方便地用各种已知方法制得本发明的融合蛋白。这些方法例如但不限于重组DNA法，人工合成，等[参见Murray KM，Dahl SLAnn；Pharmacother 1997 Nov；31(11)1335-8]。此外，本发明提供了编码本发明的融合蛋白核酸分子之一，包含SEQ ID NO5或6所示的序列。本发明还提供了编码本发明另一融合蛋白的核酸分子，包含SEQ ID NO7或8所示的序列。
虽然以上给出了编码本发明融合蛋白的特定的DNA分子核苷酸序列，但是，本文所述的编码核酸包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)，还包括由核苷酸类似物形成的DNA或RNA的等效物、类似物，单链(有义链或反义链)和双链聚核苷酸。还包括以上所述序列的同源序列。
本发明还提供了一种表达载体，包含一段选自SEQ ID NO5或SEQ ID NO8的序列和与之操作性连接的表达调控序列。表达载体可采用市售的例如但不限于pDR(New England Biolabs产品)，pUC18等可用于真核细胞系统表达的载体。本领域技术人员不难根据宿主细胞来选择合适的表达载体。例如，当本发明选择CHO为宿主细胞时，即可确定pDR为其适合的表达载体之一。将本发明的编码核酸序列导入所选的空载体中即可得到本发明的表达载体。本发明实施方式之一是含有本发明融合蛋白编码序列SEQ ID NO3的质粒pDR-(p75Ig-IL1Ra)，其酶切特征见图2。
本发明还提供了表达本发明融合蛋白的宿主细胞，其中含有本发明的编码序列SEQ ID NO3或4。所述的宿主细胞为常用的真核细胞，例如但不限于CHO，COS细胞，293细胞，RSF细胞等。
本发明还提供一种用重组DNA制备本发明融合蛋白的方法，其步骤包括1)提供编码融合蛋白的核酸序列，所述序列选自SEQ ID NO5至SEQ IDNO8；2)构建合适的表达载体；3)将该表达载体导入合适的宿主细胞；4)在适合表达的条件下培养转化宿主细胞；5)收集上清液，并纯化融合蛋白产物。
根据本文所述的核苷酸序列，本技术领域人员可方便地用各种已知方法制得本发明的编码核酸。这些方法例如但不限于制备PCR，DNA合成(J.萨姆布鲁克，《分子克隆实验指南》)。
根据已知空载表达载体的酶切图谱，本领域技术人员可按照常规方法通过限制性酶剪切与拼接，将本发明的编码序列插入合适的限制性位点，制得本发明的表达载体，例如图2所示的pDR-(p75Ig-IL1Ra)和图3所示的pDR-(IL1Ra-连接序列-p75)。
实施方式之一中，可通过交叠PCR来构建本发明的编码核酸序列，参见图1。其中，基于已知序列的引物设计，制备，以及PCR反应参数的设定和控制可参考US6406863中所述的PCR反应。
将所述编码序列导入宿主细胞可采用本领域的多种已知技术，例如但不限于磷酸钙沉淀，原生质体融合，脂质体转染，电穿孔，微注射，反转录法，噬菌体转导法，碱金属离子法。
有关宿主细胞的培养和表达可参见Olander RM Dev Biol Stand 1996；86338。
可通过离心去除悬浮液中的细胞和残渣，收集清液。可通过电泳进行鉴定。
本发明还提供了含有本发明融合蛋白和药学上认可的载体的用于治疗RA的药物组合物。除作为有效成分的本发明融合蛋白之外，所述药物组合物中还可含有常规赋形剂，并可制成各种剂型。相关内容可参见《最新药物制剂技术及应用》安书麟、王宪洪等译。
通过以上所述并结合后文实施方式，本领域技术人员不难看出本发明的上述及其他特征和优点。
图1本发明构建的pDR-(p75Ig-IL1Ra)的酶切图。其中，HCMV-人细胞巨化病毒启动子，是主要瞬时早期启动子；BGH pA-牛生长激素多聚腺嘌呤信号；SV40 ori-猿病毒40早期启动子和复制起始位点；DHFR-二氢叶酸还原酶基因；pUC ori-质粒的复制起始位点；AmpR-β内酰胺酶基因。
图2本发明构建的pDR-(IL1Ra-连接序列-p75)的酶切图。
具体实施例方式
实施例1p75-Ig-IL1Ra融合蛋白的表达1.构建含编码核酸SEQ ID NO1的质粒pGEMT-(p75-Ig-IL1Ra)1.1pGEMT-p75Ig的制备根据p75序列设计5’端引物P1(SEQ ID NO11)5’CAGaagcttATGttgcccgcccaggtggcatttacaccctac其中，在5′端依次引入3个保护碱基CAG，一个HindIII酶切位点aagctt，和一个起始密码子ATG。
根据p75序列和Ig序列设计跨接p75的3′端和Ig Fc的5′端的引物P2(SEQ IDNO12)5’gtcgcaggacttgggctcgtcgccagtgctcccttc设计的多核苷酸片段委托上海生工生物工程有限公司代为合成并进行PAGE纯化，参照文献Chrisostomos Prodromou and Laurenee H，Pearl(1992)的方法进行片段的合成。
合成好的片段按照22μg/μl的浓度溶于灭菌的三蒸水中，以p75的序列(GeneBank NM_001066)为模板，以P1和P2作为引物，用市售PCR试剂盒按照以下方法进行PCR反应体系的组成成分数量(μl)10×PCR反应缓冲液 1025mM Mg2SO410Taq(5U/μl)2引物(2μg/μl) 各1μl模板(2ug/ml)灭菌三蒸水 100μl反应条件预变性94℃，2分钟；主循环94℃，1分钟；55℃，1分钟；72℃，3分钟；循环数20后延伸72℃，5分钟。
PCR过程在PROGENE Genium热循环仪上进行。
按照上述条件进行PCR。完毕后将产物在0.8％琼脂糖凝胶上电泳进行鉴定，发现有一条分子量在720bp左右的条带，用Promega公司的胶回收试剂盒回收该片段，操作按照厂家的说明书进行。
根据Ig片段的序列设计3′端引物P3(SEQ ID NO13)5’-cttgccgggggacagggac以Ig Fc片段的序列(GeneBank X52015)和以上制得的720bp DNA片段为模板，以p75的5′端引物P1和Ig Fc片段的3′端引物P3作为引物，用市售PCR试剂盒如前所述进行PCR。
完毕后将产物在0.8％琼脂糖凝胶电泳上进行鉴定，发现有一条分子量在1400bp左右的条带，用Promega公司的胶回收试剂盒回收该片段，操作按照厂家的说明书进行。
获得的DNA按照常规方法克隆到pGEMT载体上后转化大肠杆菌并进行蓝白斑筛选。通过酶切鉴定和测序确认了一个序列完全正确的克隆，即为pGEMT-(p75-Ig)。1.2pGEMT-IL1Ra的制备根据IL1Ra的序列设计引物上游引物(5’)P4(SEQ ID NO14)和下游引物(3’端)P5(SEQ ID NO15)P45’CAGcgaccctctgggagaaaatccagcaagP55’CAGgaattcctcgtcctcctggaagtag其中，cag为保护碱基，gaattc为EcoRI酶切位点引物委托上海生工生物工程有限公司代为合成并进行PAGE纯化。
以IL1Ra序列(GeneBank X50125)为模板，以P4和P5为引物，按前述方法和条件进行PCR。在琼脂糖凝胶上电泳，获得分子量约为460bp的条带，进行凝胶回收。
获得的DNA按照常规方法克隆到pGEMT载体上后转化大肠杆菌并进行蓝白斑筛选。通过酶切鉴定和测序确认序列完全正确的克隆，为pGEMT-IL1Ra。1.3pGEMT-(p75-Ig-IL1Ra)即(SEQ ID NO1)的获得根据IL1Ra和Ig的序列设计跨接IL1Ra的5′端和Ig的3′端的引物P6(SEQ IDNO16)5’gtccctgtcccccggcaagcgaccctctgggagaaaatc以前面制备的pGEMT-p75Ig和pGEMT-IL1Ra为模板，以IL1Ra的下游引物P5和跨接引物P6为引物，按照前面方法进行PCR。完毕后将产物在0.8％琼脂糖凝胶电泳上进行鉴定，回收分子量约在475bp的条带，纯化获得DNA片段。以该片段和pGEMT-p75Ig为模板，以P1和P5为引物进行PCR，然后产物进行琼脂糖电泳，发现有一条分子量在1857bp的条带，用Promega公司的胶回收试剂盒回收该片段，操作按照厂家的说明书进行。
获得的DNA按照常规方法克隆到pGEMT载体上，转化大肠杆菌并进行蓝白斑筛选。通过酶切鉴定和测序确认了一个序列完全正确的克隆，即为pGEMT-p75-Ig-IL1Ra(SEQ ID NO1)。2.表达载体pDR-(p75-Ig-IL1Ra)的构建用HindIII和EcoRI(Promega)双酶消化，将p75-Ig-IL1Ra基因片段从pGEMT-(p75Ig-IL1Ra)载体上切下，克隆到经同样双酶消化的pDR载体(NewEngland Biolabs产品)中，得到pDR-(p75-Ig-IL1Ra)。酶切鉴定构建的表达载体。3.CHO细胞的转染用脂质体转染法将表达载体pDR-(IL1Ra-连接序列-p75)导入CHO-dhfr-细胞(从Invitrogen或Gibco公司购买获得)。转染试剂盒购自Invitrogene公司，转染操作程序按照厂家的说明书进行。转染进行24小时后换选择培养基进行筛选，选择培养基为15％胎牛血清(Gibco)+RPM1640/DEME。于37℃，5％CO2培养箱中培养。待克隆形成后用二氢叶酸还原酶抑制剂氨甲喋呤(MTX)进行加压筛选，浓度从2×10-8mol/L到5×10-7mol/L梯度加压，用有限稀释法进行亚克隆。4.表达将筛选得到的高表达克隆用无血清培养基CHO-S-SFMII培养基(GiBco公司产品)扩大培养PH值为7.0-7.2；温度37±0.1℃；葡萄糖浓度1.0～1.5g/L。
产物蛋白为分泌型，用离心收集的方法去掉细胞和细胞残渣后，获得含有表达产物的上清。
rProtein A亲和层析柱分离纯化表达的融合蛋白。将纯化后融合蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳分析将经离子交换柱层析纯化后的蛋白上样10μg进行SDS-PAGE后以考马司亮蓝G250染色；相同纯化样品上样6μg行SDS-PAGE后以硝酸银染色，以BECKMAN DU650分光光度计分别对两种染色的着色带进行光谱分析，以确定最佳扫描波长(考马司亮蓝染色600nm；硝酸银染色490nm)，然后进行胶扫描(每毫米读数2次)，经仪器对扫描峰进行自动面积积分，得出目的蛋白峰的含量和纯度。实验结果显示，我们所得到的蛋白纯度不低于98％。
实施例2IL1Ra-连接序列-p75融合蛋白的表达1.pGEM-(IL1Ra-连接序列-p75)即编码核酸SEQ ID NO3的制备参见图1b，本发明通过交叠PCR构建编码IL1Ra-连接序列-p75融合蛋白的SEQID NO3序列。其中，实线表示IL1Ra基因，虚线表示p75Ig基因。箭头表示基因从5′-3′方向复制。PCR1反应使用引物a和b，以pGEMT-IL1Ra载体为模板生成ab产物(IL1Ra)。PCR2反应是另一个PCR反应，使用引物c和d，以pGEMT-p75载体为模板生成cd产物(p75)。Oligo-b的5′端与oligo-c的5′端互补。交叠PCR即在已经获得ab和cd片段的情况下，使用引物a和d，Oligo-b的5′端与oligo-c的5′端互补所成单链为模板继续PCR反应，得到完整的长链融合基因。
根据前面所述的IL1Ra和p75序列以及连接序列，设计如下引物跨接引物P7(SEQ ID NO17)aatgccacctgggcgggcaaGGAGCCGCCGCCGCCGAGCCGCCGCCGCCGAGCCGCCGCCGCCctcgtcctcctggaagtag该引物的5′端与p75的5′端重叠，中间大写划线部分为连接序列(45bp)，3′端与IL1Ra的3′端重叠。
IL1Ra的5′端引物P8(SEQ ID NO18)P85’CAGaagcttATGcgaccctctgggagaaaatccagcaag其中，在5′端依次引入保护碱基CAG，HindIII酶切位点aagctt和一个起始密码子ATG。
p75的3′端引物P9(SEQ ID NO19)P95’CAGgaattcgtcgccagtgctcccttcagc其中，在5′端依次引入保护碱基CAG和EcoRI酶切位点gaattc。
以实施例1制备的pGEMT-IL1Ra为模板，以P7和P8为引物，按前述方法和条件进行PCR。产物在琼脂糖凝胶上电泳，获得分子量约为500p的条带，进行凝胶回收获得所需的DNA片段。然后以该产物与前述pGEMT-(p75-Ig)为模板以P8和P9为引物，进行PCR，产物在琼脂糖凝胶上电泳，获得分子量约为1200bp的条带，进行凝胶回收获得所需的DNA片段IL1Ra-连接序列-p75，即SEQ IDNO3。
获得的DNA按照常规方法克隆到pGEMT载体上后转化大肠杆菌并进行蓝白斑筛选。
通过酶切鉴定和测序确认序列完全正确的克隆pGEM-(IL1Ra-连接序列-p75)。2.表达载体pDR-(IL1Ra-连接序列-p75)的构建用HindIII和EcoRI(Promega)双酶消化，将IL1Ra-连接序列-p75基因片段从pGEMT-(IL1Ra-连接序列-p75)载体上切下，克隆到经同样双酶消化的pDR载体(New England Biolabs产品)中，得到pDR-(IL1Ra-连接序列-p75)。酶切鉴定构建的表达载体。3.CHO细胞的转染用脂质体转染法将表达载体pDR-(IL1Ra-连接序列-p75)导入CHO-dhfr-细胞(从Invitrogen或Gibco公司购买获得)。转染试剂盒购自Invitrogene公司，转染操作程序按照厂家的说明书进行。转染进行24小时后换选择培养基进行筛选，选择培养基为15％胎牛血清(Gibco)+RPM1640/DEME。于37℃，5％CO2培养箱中培养。待克隆形成后用二氢叶酸还原酶抑制剂氨甲喋呤(MTX)进行加压筛选，浓度从2×10-8mol/L到5×10-7mol/L梯度加压，用有限稀释法进行亚克隆。4.表达将筛选得到的高表达克隆用无血清培养基CHO-S-SFMII培养基(GiBco公司产品)扩大培养。PH值为7.0-7.2；温度37±0.1℃；葡萄糖浓度1.0～1.5g/L。
产物蛋白为分泌型产物，用离心收集的方法去掉细胞和细胞残渣后，获得含有表达产物的上清。
rProtein A亲和层析柱分离纯化表达的融合蛋白。将纯化后融合蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳分析将经离子交换柱层析纯化后的蛋白上样10μg进行SDS-PAGE后以考马司亮蓝G250染色；相同纯化样品上样6μg行SDS-PAGE后以硝酸银染色，以BECKMAN DU650分光光度计分别对两种染色的着色带进行光谱分析，以确定最佳扫描波长(考马司亮蓝染色600nm；硝酸银染色490nm)，然后进行胶扫描(每毫米读数2次)，经仪器对扫描峰进行自动面积积分，得出目的蛋白峰的含量和纯度。实验结果显示，我们所得到的蛋白纯度不低于98％。
序列表<110>上海兰生上科创业投资有限公司<120>含可溶性肿瘤坏死因子II型受体和白介素I受体拮抗剂IL1Ra的融合蛋白，其制备方法，及其药物组合物<130>023430<160>19<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>619<212>PRT<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>p75-Ig-IL1Ra融合蛋白<400>1Leu Pro Ala Glu Val Ala Phe Thr Pro Tyr Ala Pro Glu Pro Gly Ser1 5 10 15Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gln Thr Ala Gln Met Cys Cys20 25 30Ser Lys Cys Ser Pro Gly Gln His Ala Lys Val Phe Cys Thr Lys Thr35 40 45Ser Asp Thr Val Cys Asp Ser Cys Glu Asp Ser Thr Tyr Thr Gln Leu50 55 60Trp Asn Trp Val Pro Glu Cys Leu Ser Cys Gly Ser Arg Cys Ser Ser65 70 75 80Asp Gln Val Glu Thr Gln Ala Cys Thr Arg Glu Gln Asn Arg Ile Cys85 90 95Thr Cys Arg Pro Gly Trp Tyr Cys Ala Leu Ser Lys Gln Glu Gly Cys100 105 110Arg Leu Cys Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe Gly Val Ala115 120 125Arg Pro Gly Thr Glu Thr Ser Asp Val Val Cys Lys Pro Cys Ala Pro130 135 140Gly Thr Phe Ser Asn Thr Thr Ser Ser Thr Asp Ile Cys Arg Pro His145 150 155 160Gln Ile Cys Asn Val Val Ala Ile Pro Gly Asn Ala Ser Met Asp Ala165 170 175Val Cys Thr Ser Thr Ser Pro Thr Arg Ser Met Ala Pro Gly Ala Val180 185 190His Leu Pro Gln Pro Val Ser Thr Arg Ser Gln His Thr Gln Pro Thr195 200 205Pro Glu Pro Ser Thr Ala Pro Ser Thr Ser Phe Leu Leu Pro Met Gly210 215 220Pro Ser Pro Pro Ala Glu Gly Ser Thr Gly Asp Glu Pro Lys Ser Cys225 230 235 240Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly245 250 255Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met260 265 270Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His275 280 285Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val290 295 300His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr305 310 315 320Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly325 330 335Lys Asp Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Met340 345 350Gln Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val355 360 365Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser370 375 380Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Arg His Ile Ala Val Glu385 390 395 400Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro405 410 415Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val420 425 430Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met435 440 445His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser450 455 460Pro Gly Lys Arg Pro Ser Gly Arg Lys Ser Ser Lys Met Gln Ala Phe465 470 475 480Arg Ile Trp Asp Val Asn Gln Lys Thr Phe Tyr Leu Arg Asn Asn Gln485 490 495Leu Val Ala Gly Tyr Leu Gln Gly Pro Asn Val Asn Leu Glu Glu Lys500 505 510Ile Asp Val Val Pro Ile Glu Pro His Ala Leu Phe Leu Gly Ile His515 520 525Gly Gly Lys Met Cys Leu Ser Cys Val Lys Ser Gly Asp Glu Thr Arg530 535 540Leu Gln Leu Glu Ala Val Asn Ile Thr Asp Leu Ser Glu Asn Arg Lys545 550 555 560Gln Asp Lys Arg Phe Ala Phe Ile Arg Ser Asp Ser Gly Pro Thr Thr565 570 575Ser Phe Glu Ser Ala Ala Cys Pro Gly Trp Phe Leu Cys Thr Ala Met580 585 590Glu Ala Asp Gln Pro Val Ser Leu Thr Asn Met Pro Asp Glu Gly Val595 600 605Met Val Thr Lys Phe Tyr Phe Gln Glu Asp Glu610 615<210>2<211>619<212>PRT<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>IL1Ra-Ig-p75融合蛋白<400>2Arg Pro Ser Gly Arg Lys Ser Ser Lys Met Gln Ala Phe Arg Ile Trp1 5 10 15Asp Val Asn Gln Lys Thr Phe Tyr Leu Arg Asn Asn Gln Leu Val Ala20 25 30Gly Tyr Leu Gln Gly Pro Asn Val Asn Leu Glu Glu Lys Ile Asp Val
35 40 45Val Pro Ile Glu Pro His Ala Leu Phe Leu Gly Ile His Gly Gly Lys50 55 60Met Cys Leu Ser Cys Val Lys Ser Gly Asp Glu Thr Arg Leu Gln Leu65 70 75 80Glu Ala Val Asn Ile Thr Asp Leu Ser Glu Asn Arg Lys Gln Asp Lys85 90 95Arg Phe Ala Phe Ile Arg Ser Asp Ser Gly Pro Thr Thr Ser Phe Glu100 105 110Ser Ala Ala Cys Pro Gly Trp Phe Leu Cys Thr Ala Met Glu Ala Asp115 120 125Gln Pro Val Ser Leu Thr Asn Met Pro Asp Glu Gly Val Met Val Thr130 135 140Lys Phe Tyr Phe Gln Glu Asp Glu Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr145 150 155 160His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser165 170 175Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg180 185 190Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro195 200 205Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala210 215 220Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val225 230 235 240Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Asp Tyr245 250 255Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Met Gln Lys Thr260 265 270Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu275 280 285Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys290 295 300Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Arg His Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser305 3l0 315 320Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp325 330 335Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser340 345 350Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
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gttcctgttc540ccccccaagc ccaaggacac cctgatgatc tcccgcaccc ccgaggtgac ctgcgtggtg600gtggacgtgt cccacgagga ccccgaggtg aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag660gtgcacaacg ccaagaccaa gccccgcgag gagcagtaca actccaccta ccgcgtggtg720tccgtgctga ccgtgctgca ccaggactgg ctgaacggca aggactacaa gtgcaaggtg780tccaacaagg ccctgcccgc ccccatgcag aagaccatct ccaaggccaa gggccagccc840cgcgagcccc aggtgtacac cctgcccccc tcccgcgacg agctgaccaa gaaccaggtg900tccctgacct gcctggtgaa gggcttctac ccccgccaca tcgccgtgga gtgggagtcc960aacggccagc ccgagaacaa ctacaagacc accccccccg tgctggactc cgacggctcc 1020ttcttcctgt actccaagct gaccgtggac aagtcccgct ggcagcaggg caacgtgttc 1080tcctgctccg tgatgcacga ggccctgcac aaccactaca cccagaagtc cctgtccctg 1140tcccccggca agttgcccgc ccaggtggca tttacaccct acgccccgga gcccgggagc 1200acatgccggc tcagagaata ctatgaccag acagctcaga tgtgctgcag caaatgctcg 1260ccgggccaac atgcaaaagt cttctgtacc aagacctcgg acaccgtgtg tgactcctgt 1320gaggacagca catacaccca gctctggaac tgggttcccg agtgcttgag ctgtggctcc 1380cgctgtagct ctgaccaggt 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tttgagtctg ccgcctgccc cggttggttc360ctctgcacag cgatggaagc tgaccagccc gtcagcctca ccaatatgcc tgacgaaggc420gtcatggtca ccaaattcta cttccaggag gacgagggcg gcggcggctc cggcggcggc480ggctccggcg gcggcggctc cttgcccgcc caggtggcat ttacacccta cgccccggag540cccgggagca catgccggct cagagaatac tatgaccaga cagctcagat gtgctgcagc600aaatgctcgc cgggccaaca tgcaaaagtc ttctgtacca agacctcgga caccgtgtgt660gactcctgtg aggacagcac atacacccag ctctggaact gggttcccga gtgcttgagc720tgtggctccc gctgtagctc tgaccaggtg gaaactcaag cctgcactcg ggaacagaac780cgcatctgca cctgcaggcc cggctggtac tgcgcgctga gcaagcagga ggggtgccgg840ctgtgcgcgc cgctgcgcaa gtgccgcccg ggcttcggcg tggccagacc aggaactgaa900acatcagacg tggtgtgcaa gccctgtgcc ccggggacgt tctccaacac gacttcatcc960acggatattt gcaggcccca ccagatctgt aacgtggtgg ccatccctgg gaatgcaagc 1020atggatgcag tctgcacgtc cacgtccccc acccggagta tggccccagg ggcagtacac 1080ttaccccagc cagtgtccac acgatcccaa cacacgcagc caactccaga acccagcact 1140gctccaagca cctccttcct gctcccaatg ggccccagcc ccccagctga agggagcact 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gaatctggga tgttaaccag aagaccttct atctgaggaa caaccaacta840gttgctggat acttgcaagg accaaatgtc aatttagaag aaaagataga tgtggtaccc900attgagcctc atgctctgtt cttgggaatc catggaggga agatgtgcct gtcctgtgtc960aagtctggtg atgagaccag actccagctg gaggcagtta acatcactga cctgagcgag 1020aacagaaagc aggacaagcg cttcgccttc atccgctcag acagtggccc caccaccagt 1080tttgagtctg ccgcctgccc cggttggttc ctctgcacag cgatggaagc tgaccagccc 1140gtcagcctca ccaatatgcc tgacgaaggc gtcatggtca ccaaattcta cttccaggag 1200gacgag 1206<210>9<211>15<212>PRT<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>连接序列<400>9Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser1 5 10 15<210>10<211>45<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>连接序列的编码序列<400>10ggcggcggcg gctccggcgg cggcggctcc ggcggcggcg gctcc 45<210>11<211>42<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物<400>11cagaagctta tgttgcccgc ccaggtggca tttacaccct ac 42<210>12<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物<400>12gtcgcaggac ttgggctcgt cgccagtgct 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权利要求
1.一种融合蛋白，包含人可溶性肿瘤坏死因子II型受体，人免疫球蛋白Fc片段和白介素I受体拮抗剂IL1Ra，其氨基酸序列包含SEQ ID NO1或SEQ IDNO2。
2.一种融合蛋白，包含人可溶性肿瘤坏死因子II型受体，连接序列和白介素I受体拮抗剂IL1Ra，其氨基酸序列包含SEQ ID NO3或SEQ ID NO4。
3.一种核酸分子，编码权利要求1所述的融合蛋白，包含SEQ ID NO5或SEQ ID NO6所示的序列。
4.一种核酸分子，编码权利要求2所述的融合蛋白，包含SEQ ID NO7或SEQ ID NO8所示的序列。
5.一种表达载体，包含任选自SEQ ID NO5至SEQ ID NO8，和与之操作性连接的表达调控序列。
6.一种宿主细胞，含有权利要求5所述的表达载体。
7.根据权利要求6所述的宿主细胞，它是CHO。
8.权利要求1或2所述融合蛋白的制备方法，其步骤包括1)提供编码融合蛋白的核酸序列，所述序列选自SEQ ID NO5至SEQ IDNO8；2)构建合适的表达载体；3)将该表达载体导入合适的宿主细胞；4)在适合表达的条件下培养转化宿主细胞；5)收集上清液，并纯化融合蛋白产物。
9.一种用于治疗类风湿性关节炎的药物组合物，其中包含权利要求1或2所述融合蛋白和药学上认可的载体。
全文摘要
本发明涉及含可溶性肿瘤坏死因子II型受体p75和白介素I受体拮抗剂IL1Ra的融合蛋白，编码所述融合蛋白的核酸分子，制备本发明融合蛋白的方法以及含有本发明融合蛋白的药物组合物。
文档编号A61P37/00GK1465597SQ02112338
公开日2004年1月7日 申请日期2002年7月1日 优先权日2002年7月1日
发明者马菁, 马 菁 申请人:上海兰生上科创业投资有限公司