专利名称：：二醇聚合物-白介素-1受体拮抗剂偶联物及制备方法和用途的制作方法
技术领域：
：本发明属于蛋白质化学领域，涉及白介素-1受体拮抗剂的二醇聚合物修饰、制备方法以及作为长效药物的应用。
背景技术：
：白介素-l(Interleukin-l，IL-I)是一类重要的促炎症细胞因子，当生物体受到创伤或发炎时，发炎部位的单核吞噬细胞会产生大量的IL-l,与位于成纤维细胞和T细胞等细胞表面的受体结合，刺激信号传导和细胞活化。这种相互间的作用导致了多细胞间反应，如促进骨髓释放中性粒细胞，诱导单核细胞和多核粒细胞趋化浸润到炎症局部，在局部释放溶酶体酶。IL-1还引起嗜碱性粒细胞和肥大细胞脱颗粒，释放炎症介质。在类风湿关节炎的关节腔中，IL-1促使滑膜细胞和软骨细胞增殖并产生PGE2、胶原酶和磷脂酶A等，引起关节炎症。白介素-l受体拮抗剂(IL-lRa)是一种内源性的抗炎症细胞因子，它是促炎症细胞因子IL-lct和IL-1(3的天然特异性拮抗剂。IL-lRa特异性的与IL-l竞争结合细胞表面的受体，它与受体结合后，不刺激信号传导，因而不会引发一系列的细胞反应。通过阻断IL-1与受体结合而发挥其抗炎症的作用(D.Boraschi,P.Boss(i，G.Macchia,RRuggiero，A.Tagliabue.Frontiersinbioscience1，d270-308，1995;C.Dinarello.FASEBJ.8，1314-1325，1994;A.Kluczyk,M.Cebrat,R.Zbozieri-Pacamaj，M.Lisowski,P.Stefanowicz,Z.Wieczorek，I.Z.Siemion.ActaBiochimicaPolonica51，57-66，2004)。美国安进(Amgen)公司生产的阿那白滞素(Anakinra)，一种基因重组的IL-lRa，己经于2001年9月14日被美国国家药品食品管理局(FDA)批准用于改善中度及重度活动性类风湿性关节炎患者的症状和体征，减慢关节炎损害的进展。该药适用人群为年龄218岁、经一种或一种以上抗类风湿药物治疗无效的类风湿性关节炎患者。这种在大肠杆菌中表达的重组白介素-1受体拮抗剂有与天然的IL-lRa相同的生物学功能。与天然的IL-lRa相比最主要的区别在于(1)它是非糖基化蛋白；(2)它的氮末端比天然IL-lRa多一个甲硫氨酸(H.A.Schreuder，J.M.Rondeau,C.Tardif,A.Soffientini,E.Sarubbi,A.Akeson，T.L.Bowlin，S.Yanofsky,R.W.Barrett.Eur.J.Biochem.227，838-847，1995)。Anakinra的临床使用剂量为100mg/day，病人需每天注射一次，且有时会伴随注射位点反应。制备一种低(无)免疫原性，循环半寿期长，具有IL-lRa生物学活性的衍生物可以有效的减少注射的次数，且会减弱天然IL-lRa引起的免疫反应，因而，是一项很有意义的工作。二醇聚合物如聚乙二醇是一种生物相容性好，无毒、无抗原性和无免疫原性的惰性大分子，在体内表现为低蛋白质和低血小板吸附以及低细胞粘附性。将其和蛋白质、多肽类化合物、以及小分子共价偶联，可以赋予这些活性蛋白质、多肽类以及小分子化合物二醇聚合物的优秀性质，有效改善这些物质在生物体内的生物分布。这些性质使得二醇聚合物在生物医学领域应用十分广泛，己获FDA批准用于进入人体的添加剂。这种二醇聚合物如聚乙二醇已经被成功的应用于修饰循环半寿期短、免疫原性强的药用蛋白质上，如ot—干扰素，粒细胞集落刺激因子，精氨酸酶等(S.P.Monkarsh,Y.Ma，A.Aglione,P.Bailon,D.Ciolek，B.DeBarbieri,M.C.Graves,K.Hollfelder，H.Michel,A.Palleroni，J.E.Porter,E.Russomnan,S.Roy,andY,C.E.Pan.Anal.Biochem.247，434440，1997;R.Clark，K.Olson,G.Fuh，M.Marian,D.Mortensen,G.Teshima，S.Chang,H.Chu，V.Mukku，E.C.Davis,T.Somers,M.Cronin,M.Winkler,andJ.A.Wells.J.Biol.Chem.271，21969—21977，1996;Y.Ashihara，T.Kono，S.Yamazaki,Y.Inada.Biochem.Biophys.Res.Commun.83，385—391，1978)。白介素-1受体拮抗剂通过与白介素-1竞争结合细胞表面的白介素I型受体而发挥其抗炎症作用。其一级氨基酸序列中的W16、Q20、Y34、Q36和Y147被鉴定为白介素-1受体拮抗剂和白介素I型受体的结合位点(B.J.Stockman,T.A.Scahill,N.A.Strakalaitis，D.P.Branner,A.W.Yem，M.R.DeibelJr.FEBSLett.349'79-83，1994;R.J.Evans,J.Bray,J.D.Childs,G.P.A.Vigers，B.J.Brandhuber，J.J.Skalicky，R.C.Thompson,S.REisenberg.J.Biol.Chem.270，11477-11483，1995)。这五个重要的氨基酸残基围成了一个与白介素I型受体作用的结合区。所以，在考虑白介素-1受体拮抗剂的修饰时，选择的目标修饰位点应该远离这个结合区，这样对保持偶联物的生物学活性具有重要的意义。白介素-1受体拮抗剂有38个可修饰位点，其中包括氮末端、9个赖氨酸、4个游离的半胱氨酸、2个组氨酸、ll个丝氨酸、3个酪氨酸和8个苏氨酸。我们的修饰一般都是针对选择性较高的赖氨酸、氮末端、半胱氨酸和组氨酸进行。白介素-1受体拮抗剂的氮末端和组氨酸残基都远离其受体结合区，其第116和122位两个游离的半胱氨酸与其受体结合区也有一段适中的距离。都是比较理想的修饰位点。白介素-1受体拮抗剂的9个赖氨酸残基分布较分散，其中第21和145位的赖氨酸残基距离白介素-1受体拮抗剂的受体结合区距离很近，如果修饰发生在这两个位点，可能偶联物的生物学活性会受到较大的影响。而其它位置的赖氨酸残基，如第6、9、64、93、96、71都远离白介素-1受体拮抗剂的受体结合区。也属于比较理想的修饰位点。Thompson等用末端为马来酸亚胺活化的聚乙二醇对白介素-l受体拮抗剂进行过修饰研究(R.C.Thompson,C.H.H咖um,S.P.Eisenberg,W.P.Arend,F.G.Joslin,A.Sommer.USPatNo.6858409.2005)。经马来酸亚胺活化后的聚乙二醇特异性的连接在白介素-1受体拮抗剂的第116位游离巯基上，生成的这种聚乙二醇一白介素-1受体拮抗剂偶联物经皮下给药，与未修饰蛋白相比，其在大鼠体内的血浆驻留时间得到显著延长，如未修饰蛋白为2.7小时，而用平均分子量为5000道尔顿聚乙二醇修饰的偶联物其平均驻留时间延长为6.5小时，用平均分子量为12000道尔顿聚乙二醇修饰的偶联物其平均驻留时间延长为9.0小时。而静脉给药其血浆驻留时间由未修饰蛋白的0.25小时延长为0.37小时(聚乙二醇的平均分子量为5000)和0.76小时(聚乙二醇的平均分子量为12000)。Hakimi等也通过专利的形式保护了，-种结构为2(:，,碼擴阔^,隨联物Q.Hakimi，P.Kilian,P.Rosen.USPatNo.457057,1995)。如在其实施例6中用a-[(1，2-二羟基-2-氧-1-吡啶基)硫代羰基-单甲氧基聚乙二醇(平均分子量10000道尔顿)与白介素-1受体拮抗剂反应生成的偶联物皮下对C57BF/6小鼠给药24小时后，在小鼠的血浆里还能检测到白介素-1受体拮抗剂；而未修饰蛋白在给药的8小时后就己经被小鼠完全代谢。这些事例表明，二醇聚合物修饰能有效延长白介素-1受体拮抗剂在生物体内的循环半寿期，从而实现其作为长效活性化合物药物的目的。本发明提供了一类二醇聚合物一白介素-1受体拮抗剂偶联物及其制备方法。我们的发明与以上公开的专利或文献的不同之处在于二醇聚合物-白介素-1受体拮抗剂偶联物在连接位点上的差别和使用二醇聚合物的不同。选择白介素-1受体拮抗剂的氨基还是组氨酸的咪唑基依赖于二醇聚合物的活化方式及修饰条件的调整。当二醇聚合物的末端被活化为醛时，二醇聚合物会特异性的修饰在白介素-1受体拮抗剂的氮末端上。当二醇聚合物的末端被活化为N-羟基琥珀酰亚胺时，在偏酸性条件下二醇聚合物会修饰在白介素-1受体拮抗剂组氨酸的咪唑基和远离其受体结合区的赖氨酸氨基上。这些具有特定结构的偶联物通过液相色谱分离得到电泳纯的二醇聚合物一白介素-1受体拮抗剂偶联物。这种偶联物保留了未修饰蛋白45%-75%的生物学活性。动物实验表明其在生物体内的循环半衰期从未修饰蛋白的6小时提高到18小时。在牛胶原蛋白造型的类风湿性关节炎大鼠模型试验中，偶联物也显著(pO.05)地改善动物踝关节和后脚掌的病症，说明该偶联物可作为长效活性化合物药物有效地用于治疗类风湿关节炎。
发明内容本发明的目的在于克服现有技术中白介素-1受体拮抗剂在用于治疗类风湿性关节炎的过程中，其循环半寿期短(4-6小时)、给药次数频繁(每天给药)的不足，而提供一类长效的二醇聚合物一白介素-1受体拮抗剂偶联物及制备方法和用途；二醇聚合物共价连接在白介素一l受体拮抗剂的氨基或组氨酸的咪唑基上形成的偶联物，可在有效保持白介素-1受体拮抗剂生物活性的条件下(保留了未修饰蛋白45%-75%的生物学活性)，显著的延长了其在生物体内循环半衰期(从未修饰蛋白的6小时提高到18小时)。众所周知，这种显著延长的半寿期为在临床上减少用药次数提供了理论支持。更重要的是在牛胶原蛋白造型的类风湿性关节炎大鼠模型试验中，偶联物显著(pO.05)地改善动物踝关节和后脚掌的病症，表明了其在治疗类风湿性关节炎中的有效性。对二醇聚合物分子量的描述是指其平均分子量。白介素-1受体拮抗剂主要指分泌型人白介素-1受体拮抗剂和基因重组型人白介素-1受体拮抗剂。本发明的技术方案如下本发明提供的二醇聚合物一白介素-1受体拮抗剂偶联物，该偶联物为二醇聚合物共价连接于白介素-1受体拮抗剂的氨基或其组氨酸的咪唑基上的偶联物；所述二醇聚合物共价连接于白介素-1受体拮抗剂的氨基的偶联物的结构通式为.[R-(0-CH2-CH2-)n-(0-CH2-CH2-CH2-)m]k-W-IL-1Ra其中R为含16个碳原子的垸基；n和m为0900的整数，n+m不小于45，k为l4的整数，W为羟基、以酰胺键与二醇聚合物连接的氨基酸或16个碳原子的伯醇，IL-lRa为白介素-l受体拮抗剂；所述将二醇聚合物共价连接于白介素-1受体拮抗剂的组氨酸的咪唑基上的偶联物的结构通式为N[R-(0-CH2-CH2-)n-(0-CH2-CH2-CH2-)mk-W-NH2NiL-1RaO其中R为含16个碳原子的烷基；n和m为0900的整数，n+m不小于45，k为l4的整数，W为羟基、以酰胺键与二醇聚合物连接的氨基酸或16个碳原子的伯醇，IL-lRa为白介素-l受体拮抗剂；所述的二醇聚合物的平均分子量为200040000道尔顿。偶联物中二醇聚合物共价连接的白介素-1受体拮抗剂的氨基为白介素-1受体拮抗剂赖氨酸的氨基或氮末端的氨基。所述的白介素-1受体拮抗剂为天然分泌型人白介素-1受体拮抗剂或基因重组型人白介素-1受体拮抗剂；优选基因重组型人白介素—1受体拮抗剂(recombinanthumaninterleukin-lreceptorantagonist,RhIL-lRa)。本发明提供的二醇聚合物一白介素-1受体拮抗剂偶联物的制备方法，其步骤如下1)将二醇聚合物活化为末端具有醛基或N-羟基琥珀酰亚胺功能基的活性中间体；2)然后将步骤1)得到的活性中间体与白介素-1受体拮抗剂反应，制得二醇聚合物共价连接在白介素-1受体拮抗剂氨基或组氨酸的咪咪基的偶联物；所述二醇聚合物连接在白介素-1受体拮抗剂氨基的偶联物的结构通式如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>其中R为含16个碳原子的烷基；n和m为0900的整数，n+m不小于45，k为l4的整数，W为羟基、以酰胺键与二醇聚合物连接的氨基酸或16个碳原子的伯醇，IL-lRa为白介素-l受体拮抗剂；所述二醇聚合物共价连接在白介素-1受体拮抗剂组氨酸的偶联物的结构通式如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>其中R为含16个碳原子的烷基；n和m为0900的整数，n+m不小于45，k为l4的整数，W为羟基、以酰胺键与二醇聚合物连接的氨基酸或16个碳原子的伯醇，IL-lRa为白介素-l受体拮抗剂；所述的二醇聚合物的平均分子量为200040000道尔顿。偶联物中二醇聚合物共价连接的白介素-1受体拮抗剂的氨基为白介素-1受体拮抗剂赖氨酸的氨基或氮末端的氨基。所述的白介素-1受体拮抗剂为天然分泌型人白介素-1受体拮抗剂或基因重组型人白介素-1受体拮抗剂；优选基因重组型人白介素一l受体拮抗剂(recombinanthumaninterleukin-lreceptorantagonist,RhIL-lRa)。本发明提供的二醇聚合物一白介素-1受体拮抗剂偶联物的用途为在制备治疗类风湿性关节炎药物中的应用。本发明的优点在于通过选择不同的二醇聚合物的类型和其活化方式，使得二醇聚合物选择性的共价连接于白介素-1受体拮抗剂的氨基或组氨酸的咪唑基上。生成的这种二醇聚合物-白介素-1受体拮抗剂偶联物有效地保留了未修饰蛋白45%-75%的生物学活性；但其在生物体内的循环半衰期得到显著的提高，从未修饰蛋白的6小时提高到18小时。更重要的是在牛胶原蛋白造型的类风湿性关节炎大鼠模型试验中，偶联物显著(pO.05)地改善由于类风湿性关节炎引发的动物踝关节和后脚掌的肿胀。研究表明在本专利保护的二醇聚合物-白介素-1受体拮抗剂偶联物作为一种长效的白介素-1受体拮抗剂在治疗类风湿性关节炎中的有效性。图1为实施例2中末端丙醛活化的二醇聚合物修饰白介素-1受体拮抗剂的SDS-PAGE检测结果，其中A条带标准分子量蛋白；B条带未修饰的基因重组人IL-lRa;C条带纯化的N末端偶联二醇聚合物(平均分子量为5000道尔顿)的基因重组人IL-lRa;图2为实施例6中末端N-羟基琥珀酰亚胺活化的二醇聚合物修饰白介素-l受体拮抗剂的SDS-PAGE检测结果，其中A条带未修饰的基因重组人IL-lRa;B条带纯化的组氨酸末端偶联二醇聚合物(平均分子量为10000道尔顿〉的基因重组人IL-lRaC条带标准分子量蛋白；图3为实施例2中丙醛活化的单甲氧基乙二醇聚合物-白介素-1受体拮抗剂偶联物经胰蛋白酶酶切后的MALI)I-TOF谱；图4为盐酸羟氨法确定实施例6中白介素-1受体拮抗剂偶联物的偶联位点。4a为加入盐酸羟氨前，4b为加入盐酸羟氨后。具体实施方式实施例1制备具有丙醛末端的单甲氧基乙二醇聚合物的活性中间体称取单甲氧基乙二醇聚合物(平均分子量5000道尔顿)5克，溶于盛有20毫升干燥的l，4-二氧六环的圆底烧瓶中，搅拌溶解；向其内加入l毫升的3-氯丙酰二乙基醚和2克氢氧化钠，密闭系统，回流24小时；将反应液旋转浓縮至5毫升左右，冷乙醚沉淀。将经过滤、干燥的二醇聚合物用水30毫升水溶解，稀盐酸调节其pH值至2，在室温下水解4小时。用10X3的二氯甲烷萃取；合并萃取液、减压浓縮后冷乙醚沉淀、过滤、千燥。具有丙醛末端的单甲氧基乙二醇聚合物活性中间体的核磁共振氢谱如下3.24(3H，-OCH3),3.56(4nH，-0-CH2-CH2)，9.71(1H,-CHO)，2.57(2H,-CH2-CHO)，3,70(2H,-0-CH2-CH2-CHO)实施例2用实施例1制备的活性中间体制备二醇聚合物偶联在白介素-1受体拮抗剂N末端的偶联物将浓度为20mg/ml的基因重组型人IL-lRa(RhIL-lRa)用40mM的磷酸钠稀释至lmg/ml，调节其pH为5.0。将20倍蛋白质摩尔量的丙醛活化的单甲氧基乙二醇聚合物(分子量5000)加入到蛋白溶液中，加入氰基硼氢化钠至浓度为lmM，于4'C下孵育12小时。将反应的混和物用凝胶色谱分离。色谱条件Superdex75柱(l.OX30cm)，流动相为含0.15M氯化钠的50mM的磷酸钠(pH7.0)，流速0.5ml/min。接收修饰的蛋白质峰，SDS-PAGE电泳检测(图l)。生物活性检测结果表明该偶联物的生物活性保留了未修饰蛋白的75%。实施例3制备具有丙醛末端的单异丙基乙二醇和丙二醇共聚物的活性中间体称取单异丙基乙二醇和丙二醇聚合物(平均分子量40000道尔顿)10克，溶于盛有50毫升干燥的l，4-二氧六环的三孔圆底烧瓶中，搅拌溶解。向其内加入新鲜活化的二氧化锰(于250摄氏度下马福炉中放置4小时)20克，在通有氧气(0.2大气压)的条件下，搅拌反应过夜。用布氏漏斗移除二氧化锰粉末，将滤液减压浓縮，冷乙醚沉淀，得末端为丙醛活化的单异丙基乙二醇和丙二醇聚合物。其核磁共振氢谱如下U6(6H,(CH3)2-CH-)，3.19(1H,(CH3)2-CH-)，3.54(4nH，-0-CH2-CH2)，3.37(4mH,-0-CH2-CH2-CH2)，1.63(2mH,-0-CH2-CH2-CH2),3.70(2H，-0-CHrCH2-CHO)9.71(1H，-CHO)实施例4用实施例3制备的活性中间体制备二醇聚合物偶联在白介素-1受体拮抗剂N末端的偶联物将浓度为20mg/ml的分泌型人IL-lRa用40mM的乙酸一乙酸钠稀释至lmg/ml，调节其pH为6.0。将50倍蛋白质摩尔量的丙醛活化的单异丙基乙二醇和丙二醇聚合物(分子量40000)加入到蛋白溶液中，加入氰基硼氢化钠至浓度为10mM，于rC下孵育36小时。将反应的混和物用凝胶色谱分离。色谱条件Superdex75柱(l.OX30cm)，流动相为含0.15M氯化钠的50mM的磷酸钠(pH7.0)，流速0.5ml/min。接收修饰的蛋白质峰，SDS-PAGE电泳检测。生物活性检测结果表明该偶联物的生物活性保留了未修饰蛋白的61%。实施例5制备末端为N-羟基琥珀酰亚胺活化的丙酸基单甲氧基乙二醇聚合物称取单甲氧基乙二醇聚合物(平均分子量5000道尔顿)10克，溶于20毫升超纯水中，加入0.2克氢氧化钾，溶解后冰裕冷却溶液至O摄氏度。2.8克乙腈被分3次加入，冰浴下反应4小时。用0.5摩尔的磷酸氢二钠溶液调节其pH值为7。用二氯甲烷萃取、浓缩、冷乙醚沉淀(沉淀l)。向上述沉淀1中加入50毫升浓盐酸，室温下搅拌反应48小时后，用2升的超纯水稀释，二氯甲垸萃取、浓縮、冷乙醚沉淀(沉淀2)。将沉淀2溶于1升超纯水，加入68克的氢氧化钾，室温下搅拌过夜，二氯甲烷萃取、浓縮、冷乙醚沉淀(沉淀3)。取2克沉淀3,溶于10毫升的无水二氯甲烷中，加入100毫克的N-羟基琥珀酰亚胺和200毫克的二环己基碳二亚胺，密封反应系统，室温下反应24小时。滤去沉淀，滤液减压浓縮，冷乙醚沉淀、干燥得末端为N-羟基琥珀酰亚胺活化的丙酸基单甲氧基乙二醇聚合物，其核磁共振氢谱如下3.24(3H,-0-CH3),3.54(4nH，-0-CH2-CH2),3.65(2H，-0-CH2-CH2-CO)，2.35(2H，-0-CH2-CH2-CO),2.80(4H,琥珀酰亚氨上的4个H)实施例6用实施例5制备的活性中间体制备二醇聚合物偶联在白介素-1受体拮抗剂组氨酸的咪唑基的偶联物将20mg/ml的基因重组型人IL-lRa用40mM的柠檬酸一柠檬酸钠稀释至5mg/ml，调节其pH为5.5。将20倍蛋白质摩尔量的N-羟基琥珀酰亚胺活化的丙酸基单甲氧基乙二醇聚合物(SPA，分子量5000)加入到蛋白溶液中，于37。C下孵育24小时。将反应的混和物用凝胶色谱分离。色谱条件Superdex75柱(l.OX30cm)，流动相为含0.15M氯化钠的50mM的磷酸钠(pH7.0)，流速0.5ml/min。接收PEG修饰的蛋白质峰，SDS-PAGE电泳检测(附图2)。生物活性检测结果表明该偶联物的生物活性保留了未修饰蛋白的67%。实施例7制备末端为N-羟基琥珀酰亚胺活化的分枝型二醇聚合物称取单甲氧基乙二醇聚合物(平均分子量1000道尔顿)20克，溶于40毫升超纯水中，向其内加入8mg的2,2，6，6-四甲基-哌啶-l-氧基(TEMPO)和48mg溴化钾,冰水浴下搅拌溶解。用4NHC1调节次氯酸钠溶液(浓度为8%)其pH为10，于冰水浴下冷却，向反应体系内加入15毫升，用0.5摩尔的氢氧化钠调节，保持反应体系的pH在10左右。反应6小时后，加入l毫升乙醇终止反应。用二氯甲垸萃取水溶液、浓縮、冷乙醚沉淀。将沉淀溶于50毫升的无水二氯甲烷中，加入0.8克的赖氨酸乙酯盐酸盐和0.5毫升的三乙胺，回流反应72小时。过滤溶液，浓縮、干燥。得固体16.3克。将其溶于20毫升的无水二氯甲烷中，加入0.4克的N-羟基琥珀酰亚胺和0.8克的二环己基碳二亚胺，密封反应系统，室温下反应24小时。滤去沉淀，滤液减压浓縮，冷乙醚沉淀、干燥得末端为N-羟基琥珀酰亚胺活化的分枝型二醇聚合物固体,此聚合物拥有两条聚乙二醇链，其分子量为2000道尔顿。其核磁共振氢谱如下3.24(6H，-0-CH3),3.54(8nH,-0-CH2-CH2),4.26(4H，-O-CHrNH),8.05(2H，-CO-NH)，1.78(2H，赖氨酸的阔,1.55(2H，赖氨酸的YH),3.20(2H，赖氨酸的coH),2.80(4H,琥珀酰亚氨上的4个H)实施例8用实施例7制备的活性中间体制备二醇聚合物偶联在白介素-1受体拮抗剂组氨酸咪唑基的偶联物将20mg/ml的分泌型人IL-〗Ra(hIL-lRa)用40mM的柠檬酸一柠檬酸钠稀释至3mg/ml，调节其pH为5.5。将40倍蛋白质摩尔量的N-羟基琥珀酰亚胺活化的分枝型二醇聚合物(分子量2000)加入到蛋白溶液中，于室温下孵育15小时。将反应的混和物用凝胶色谱分离。色谱条件Superdex75柱(1.0X30cm)，流动相为含0.15M氯化钠的50mM的磷酸钠(pH7.0)，流速0.5ml/min。接收PEG修饰的蛋白质峰，SDS-PAGE电泳检测。生物活性检测结果表明该偶联物的生物活性保留了未修饰蛋白的45%。实施例9用实施例5制备的活性中间体制备二醇聚合物偶联在白介素-1受体拮抗剂赖氨酸的氨基的偶联物将20mg/ml的基因重组人IL-lRa用40mM的柠檬酸一柠檬酸钠稀释至5mg/ml，调节其pH为6.8。将12倍蛋白质摩尔量的N-羟基琥珀酰亚胺活化的丙酸基单甲氧基乙二醇聚合物(SPA，分子量5000)加入到蛋白溶液中，于37。C下孵育24小时。将反应的混和物用凝胶色谱分离。色谱条件Superdex75柱(l.OX30cm)，流动相为含0.15M氯化钠的50mM的磷酸钠(pH7.0)，流速0.5ml/min。接收PEG修饰的蛋白质峰，生物活性检测结果表明该偶联物的生物活性保留了未修饰蛋白的58%。实施例10二醇聚合物一白介素-1受体拮抗剂偶联物氮末端氨基修饰位点的确定将实施例2纯化的偶联物用含2.0摩尔脲的0.1摩尔的tris-Hd(pH8.0)缓冲液溶解，按照蛋白胰蛋白酶质量比为80:l的量加入胰蛋白酶，于37摄氏度下酶切20小时，MALDI-TOF谱检测。在5000道尔顿-15000道尔顿范围内扫描，只扫描到一个二醇聚合物修饰的多肽峰。峰呈钟形分布，为聚乙二醇的特征峰，峰尖分子量为6062.83kDa，为重组人白介素N末端MRPSGRKSS的(1041kDa)分子量加一条二醇聚合物的分子量(5036kDa)之和(见图3)。实施例11二醇聚合物一白介素-1受体拮抗剂偶联物组氨酸咪唑基修饰位点的确定二醇聚合物修饰在白介素—1受体拮抗剂的组氨酸时生成的偶联产物在盐酸羟氨存在的条件下不稳定，二醇聚合物会被盐酸羟氨氨解，释放游离的白介素-1受体拮抗剂。用此方法确定实施例6中的白介素-1受体拮抗剂偶联物的偶联位点。将2mg/ml浓度的纯偶联物加入到0.5摩尔的羟氨中(pH为7.0)，于37摄氏度下反应4小时后，对50mM的磷酸盐透析，Superdex75柱检测。色谱条件0.5ml/min，上样IOO微升，280nm检测。可以看到，经盐酸羟氨氨解后，蛋白在凝胶色谱上的出峰位置后移至未反应蛋白处。由此，可鉴定二醇聚合物修饰在白介素-1受体拮抗剂的组氨酸位点上(见图4a和4b)。实施例12二醇聚合物一白介素-1受体拮抗剂偶联物赖氨酸氨基修饰位点的确定将实施例9中纯化的偶联物用含2.0摩尔脲的0.1摩尔的tris-Hcl(pH8.0)缓冲液溶解，按照蛋白胰蛋白酶质量比为100:1的量加入胰蛋白酶，于37摄氏度下酶切18小时，MALDI-TOF谱检测。在5000道尔顿-15000道尔顿范围内扫描，扫描到4组具有聚乙二醇特征的多肽峰，峰呈钟形分布。分子量计算表明，二醇聚合物分别连接在白介素-l受体拮抗剂的93、6、71和64位上。实施例13修饰后各衍生物细胞活性的测定IL-lRa的活性测定则是在i:述EL-4/CTLL-2IL-1的测活体系基础上，加入不同量的IL-lRa样品，以其对IL-1活性的抑制作用为指标反映其细胞活性，结果见表1。实施例14修饰后各衍生物循环半寿期的测定Wistar大鼠36只，体重在200-220克，随机分为3组(未修饰蛋白组、RhlL-lRa的组氨酸二醇聚合物修饰组和RhIL-lRa的N末端二醇聚合物修饰组)。每组12只。每只鼠静脉给药，剂量3mg/kg。从大鼠尾部静脉取血,ELISA(R&DSystems提供的试剂盒)测定血浆中RhIL-lRa及其PEG化衍生物的浓度，决定其在体内血浆中的循环半寿期，结果见表2，实施例15二醇聚合物-白介素-1受体拮抗剂偶联物在治疗大鼠类风湿性关节炎中的效果Lewis大鼠40只，体重在180-220克。在正常饲养3天后，随机选30只大鼠对其进行类风湿性关节炎造型，剩余10只作为正常对照组(A组)。在第0和第7天，将II型牛胶原蛋白(2mg/ml，溶解在弗氏不完全佐剂中)经动物尾根部皮下给药250W。在第12天24只动物出现了类风湿性关节炎的病理特征，而在第14天所有动物都出现了类风湿性关节炎的病理特征，表明动物的类风湿性关节炎模型被成功造型。所有被造型动物的踝关节都发生了显著的肿胀。这些模型鼠被随机分为3组(B、C、D组)，每组10只。其中B组皮下给药重组的白介素-1受体拮抗剂，20mg/kg/day，连续给药7天。C组给药N末端修饰的白介素-1受体拮抗剂(制备过程见实施例2)，35mg/kg,分别在治疗开始的第0天和第3天两次皮下注射给药。D组给药组氨酸咪唑基修饰的白介素-1受体拮抗剂(制备过程见实施例6)，35mg/kg,分别在治疗开始的第0天和第3天两次皮下注射给药。在给药开始至结束，每天都对各组动物的体重、踝关节尺寸、后脚掌厚度进行测定。结果见表3表1白介素-1受体拮抗剂及其偶联物的细胞活性<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>表2白介素-1受体拮抗剂及其偶联物大鼠静脉给药的血浆半衰期<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>p<0.05，n=10权利要求1、一种二醇聚合物-白介素-1受体拮抗剂偶联物，其特征在于，该偶联物为二醇聚合物共价连接于白介素-1受体拮抗剂的氨基或其组氨酸的咪唑基上的偶联物；所述二醇聚合物共价连接于白介素-1受体拮抗剂的氨基的偶联物的结构通式为[R-(O-CH2-CH2-)n-(O-CH2-CH2-CH2-)m]k-W-IL-1Ra其中R为含1～6个碳原子的烷基；n和m为0～900的整数，n+m不小于45，k为1～4的整数，W为羟基、以酰胺键与二醇聚合物连接的氨基酸或1～6个碳原子的伯醇，IL-1Ra为白介素-1受体拮抗剂；所述二醇聚合物共价连接于白介素-1受体拮抗剂的组氨酸的咪唑基上的偶联物的结构通式为其中R为含1～6个碳原子的烷基；n和m为0～900的整数，n+m不小于45，k为1～4的整数，W为羟基、以酰胺键与二醇聚合物连接的氨基酸或1～6个碳原子的伯醇，IL-1Ra为白介素-1受体拮抗剂。2、按权利要求1所述的二醇聚合物—白介素-l受体拮抗剂偶联物，其特征在于，所述的二醇聚合物的平均分子量为200040000道尔顿。3、按权利要求1或2所述的二醇聚合物一白介素-l受体拮抗剂偶联物，其特征在于，偶联物中二醇聚合物共价连接的白介素-1受体拮抗剂的氨基为白介素-1受体拮抗剂赖氨酸的氨基或氮末端的氨基。4、按权利要求1或2所述的二醇聚合物一白介素-l受体拮抗剂偶联物，其特征在于，所述的白介素-l受体拮抗剂为天然分泌型人白介素-1受体拮抗剂或基因重组型人白介素-l受体拮抗剂。5、按权利要求3所述的二醇聚合物一白介素-l受体拮抗剂偶联物，其特征在于，所述的白介素-1受体拮抗剂为天然分泌型人白介素-1受体拮抗剂或基因重组型人白介素-1受体拮抗剂。6、一种权利要求1所述二醇聚合物一白介素-1受体拮抗剂偶联物的制备方法，其步骤如下-1)二醇聚合物活化为末端具有醛基或N-羟基琥珀酰亚胺功能基的活性中间体；2)然后将步骤l)得到的活性中间体与白介素-1受体拮抗剂反应，制得二醇聚合物共价连接在白介素-1受体拮抗剂氨基或组氨酸的咪唑基的偶联物；所述二醇聚合物连接在白介素-1受体拮抗剂氨基的偶联物的结构通式如下[R-(0-CH2-CH2-)n-(0-CH2-CH2-CH2-)m]k-W-IL^Ra其中R为含16个碳原子的烷基；n和m为0900的整数，n+m不小于45，k为l4的整数，W为羟基、以酰胺键与二醇聚合物连接的氨基酸或16个碳原子的伯醇，IL-lRa为白介素-l受体拮抗剂；所述二醇聚合物连接在白介素-1受体拮抗剂组氨酸的咪唑基的偶联物的结构通式如下N[R-(0-CH2-CH2-)n-(0-CH2-CH2-CH2-)m]k-W-NH2NIL-1Ra0其中R为含16个碳原子的烷基；n和m为0900的整数，n+m不小于45，k为l4的整数，W为羟基、以酰胺键与二醇聚合物连接的氨基酸或16个碳原子的伯醇，IL-lRa为白介素-l受体拮抗剂。7、按权利要求5所述的二醇聚合物一白介素-1受体拮抗剂偶联物的制备方法，其特征在于，所述的二醇聚合物的平均分子量为200040000道尔顿。8、按权利要求6或7所述的二醇聚合物一白介素-1受体拮抗剂偶联物的制备方法，其特征在于，偶联物中二醇聚合物共价连接的白介素-1受体拮抗剂的氨基为白介素-1受体拮抗剂赖氨酸的氨基或氮末端的氨基。9、按权利要求6或7所述的二醇聚合物一白介素-1受体拮抗剂偶联物的制备方法，其特征在于，所述的白介素-l受体拮抗剂为天然分泌型人白介素-l受体拮抗剂或基因重组型人白介素-1受体拮抗剂。10、按权利要求8所述的二醇聚合物—白介素-1受体拮抗剂偶联物的制备方法，其特征在于，所述的白介素-l受体拮抗剂为天然分泌型人白介素-l受体拮抗剂或基因重组型人白介素-1受体拮抗剂。11、一种权利要求1所述的二醇聚合物一白介素-1受体拮抗剂偶联物在制备治疗类风湿性关节炎药物中的应用。全文摘要本发明涉及二醇聚合物—白介素-1受体拮抗剂偶联物及制法和用途。该偶联物将二醇聚合物活化为末端具有醛基或N-羟基琥珀酰亚胺功能基的活性中间体，再与白介素-1受体拮抗剂反应；二醇聚合物分子根据活化方式的不同共价连接在白介素-1受体拮抗剂的氨基或其组氨酸的咪唑基上，产物通过液相色谱分离得电泳纯二醇聚合物—白介素-1受体拮抗剂偶联物；偶联物保留了未修饰蛋白45％-75％生物学活性。动物实验表明其在生物体内的循环半衰期从未修饰蛋白的6小时提高到18小时；在牛胶原蛋白造型的类风湿性关节炎大鼠模型试验中，能显著(p＜0.05)改善动物踝关节和后脚掌病症；说明可作长效活性化合物药物有效地用于治疗类风湿关节炎。文档编号A61P19/00GK101125206SQ200610089288公开日2008年2月20日申请日期2006年8月15日优先权日2006年8月15日发明者虹丁,于鹏展,刘永东,王云山,索晓燕,坚罗,苏志国,路秀玲,郑春杨,闭静秀申请人:中国科学院过程工程研究所