专利名称：人类重组可溶性肿瘤坏死因子受体－Ⅱ的制备方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，具体地说涉及一种用大肠杆菌高效表达rTNFR-II分泌型重组蛋白——一种人类重组可溶性肿瘤坏死因子受体-II(recombinant tumor necrosisfactor receptor-II，rTNFR-II)的制备方法。
背景技术：
重组可溶性受体类药物的研发成功是近年来生物技术药物发展的一个重大突破，治疗的疾病包括癌症、心血管疾病及自身免疫性疾病等。目前类风湿关节炎药物治疗包括激素和免疫抑制剂等，效果不甚满意，而且药物副作用较大(高等医学院校内科学教材第五版，人民卫尘出版社，901-903)。上世纪八十年代初，在类风湿关节炎病人中，发现肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α，TNF)在血清中的含量远超过正常人。在后来的小鼠类风湿关节炎动物模型中，也表明血清肿瘤坏死因子水平明显增高。利用提取的TNFR-II中和体内过高TNF，治疗患有类风湿关节炎的小鼠，疗效明显。后来临床上也取得了令人满意的效果。肿瘤坏死因子的可溶性受体的主要优点是属于人体自身的成分，在治疗中不易引起免疫应答的发生，因而安全性较好；目前使用真核CHO细胞生产rTNFR-II，生产工艺复杂且成本高，病人的药费高达120,000元人民币/年，我国绝大多病人无法支付如此高昂的药费。大肠杆菌操作方便、遗传背景清晰、成本低廉，成为工业化生产重组蛋白类药物的理想工具。但使用常规的大肠杆菌表达技术表达rTNFR-II，以包涵体的形式表达而又无法体外复性。因此，如何能降低生产成本，生产出具用生物学活性的rTNFR-II是亟待解决的一个课题。
发明内容
本发明的目的是利用基因工程的原理，将TNFR-II胞外区的基因片段插入到分泌型表达载体pET-22b(+)中，利用pET系统分泌型高效表达技术，提供一种降低生产成本的人类重组可溶性肿瘤坏死因子受体-II的制备方法。
本发明的技术方案概述如下一种人类重组可溶性肿瘤坏死因子受体-II的制备方法，由如下步骤组成用SEQ ID No.1所述的核苷酸序列和SEQ ID No.2所述的氨基酸序列设计SEQ ID No.3、SEQ ID No.4所述的核苷酸序列作为PCR引物，进行PCR扩增，获得表达TNFR-II的基因片段；通过NcoI和XhoI双酶切位点，将表达TNFR-II的基因片段克隆到原核表达载体pET-22b(+)中，构建表达载体pET-TNFR-II；将重组载体pET-TNFR-II经转入大肠杆菌BL21(DE3)内获得工程菌；诱导后的工程菌，经低温离心，收集菌体，使用低温低渗缓冲液抽提，再次低温离心，取上清，经层析纯化后，获得一种人类重组可溶性肿瘤坏死因子受体-II。
所述抽提的方法为按100克菌体使用300ml的2mmol/L～20mmol/LpH为7.9Tris-HCl缓冲液，再加入1mmolEDTA，充分悬浮菌体，0℃～4℃放置30分钟～60分钟。
所述低温离心步骤是指0℃～4℃，12000g离心10分钟～30分钟。
所述层析纯化步骤使用镍离子螯和亲和柱。
所述人类重组可溶性肿瘤坏死因子受体-II可被抗TNFR-II多克隆抗体特异性识别。
所述人类重组可溶性肿瘤坏死因子受体-II能够抑制肿瘤坏死因子-α的细胞毒作用。
本发明的优点是大肠杆菌遗传特性清楚，易于分子遗传学操作，并且生长快。大肠杆菌BL21(DE3)表达TNFR-II量高，稳定，并且易于纯化。
本发明为分泌型，无需复性，不是以包涵体的形式表达，因此利用本发明的方法制备的人类重组可溶性肿瘤坏死因子受体-II具有生物学活性并且生产成本低。
图1为SEQ ID No.1的核苷酸序列；图2为SEQ ID No.2的氨基酸序列；图3PCR方法扩增rTNFR-II片段图；图4Nco I+Xho I双酶切PET-TNFR-II电泳图；图5rTNFR-II纯化SDS-PAGE图；图6rTNFR-II的免疫印迹图；图7rTNFR-II对TNR-α的抑制作用；图8为SEQ ID No.3的核苷酸序列；图9为SEQ ID No.4的核苷酸序列。
具体实施例方式
一种人类重组可溶性肿瘤坏死因子受体-II的制备方法的工艺流程为构建大肠杆菌分泌型表达载体pET22b-TNFR-II转化大肠杆菌BL21(DE3)→工程菌→LB培养基培养(500毫升)→离心收集菌体→胞周质蛋白抽提工艺→镍离子螯和亲和柱层析纯化→产品的鉴定。
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于下述实施例实施例1
PCR扩增TNFR-II基因以1μg胎盘cDNA为PCR反应模板，正向引物为5’-TAAAGCCATGGATT TGC CCG CCC AGGTGG CA-3’(SEQ ID No.3的核苷酸序列；(图8))，反向引物为5’-TAAAACTC GAGGTC GCCAGT GCT CCC TTCA AG-3’(SEQ ID No.4的核苷酸序列)，PCR反应在50μL总体积中进行，反应条件为在94℃变性5分钟后开始循环，然后94℃变性50秒，58℃退火1.5分钟，72℃延伸2分钟，共30个循环后，再于72℃延伸10分钟，扩增出一条与预计大小(730bp)相符的DNA片段(表达TNFR-II的基因片段)(图3)。
实施例2PET-TNFR-II表达质粒的构建凝胶回收的PCR产物和pET-22b(+)载体分别用NcoI和XhoI双酶切，并从1％的琼脂糖凝胶中通过凝胶回收试剂盒回收，然后进行连接(16℃，16h)，转化BL21感受态细胞，挑选阳性克隆，提取质粒后进行双酶切分析验证(图4)，并进行DNA测序鉴定，测序结果显示插入DNA片段序列与GenBank登记的TNFR-II基因序列完全相同，构建的表达载体被称为PET-TNFR-II。
实施例3rTNFR-II在大肠杆菌中的表达和纯化以测序验证的PET-TNFR-II表达质粒分别转化BL-21(DE3)感受态细胞；挑取单菌落接种于含50mg/ml氨卞青霉素的LB培养基中，37℃振荡培养至OD约为0.8时，加入终浓度为1mmol/L的IPTG，30℃诱导6小时。离心收集菌体。菌体重悬于含有20％蔗糖，1mM EDTA的20mM，pH7.9 Tris-HCl缓冲液中，0℃静置30分钟。离心收集菌体。菌体重悬于等体积的水中，0℃静置30分钟。离心收集上清。在含有0.5M NaCl，2mM咪唑的50mM，pH7.9 Tris-HCl缓冲液中透析上清。透析后样品进行镍离子螯和亲和柱层析纯化，洗脱缓冲液为0.5M NaCl，200mM咪唑的50mM，pH7.9 Tris-HCl，洗脱物在磷酸缓冲液中充分透析后浓缩。所得样品以SDS-PAGE进行分析(图5)。
实施例4rTNFR-II在大肠杆菌中的表达和纯化以测序验证的PET-TNFR-II表达质粒分别转化BL-21(DE3)感受态细胞；挑取单菌落接种于含50mg/ml氨卞青霉素的LB培养基中，37℃振荡培养至OD约为0.8时，加入终浓度为1mmol/L的IPTG，30℃诱导6小时。离心收集菌体。取100g菌体重悬于300ml含有20％蔗糖，1mM EDTA的2mM，pH7.9 Tris-HCl缓冲液中，4℃静置60分钟。离心收集菌体。菌体重悬于等体积的水中，4℃静置10分钟。离心收集上清。在含有0.5M NaCl，2mM咪唑的50mM，pH7.9 Tris-HCl缓冲液中透析上清。透析后样品进行镍离子螯和亲和柱层析纯化，洗脱缓冲液为0.5M NaCl，200mM咪唑的50mM，pH7.9Tris-HCl，洗脱物在磷酸缓冲液中充分透析后浓缩。
实施例5rTNFR-II的免疫印迹检测常规SDS-PAGE和免疫印迹方法，特异性抗可溶性肿瘤坏死因子受体-II的兔多克隆抗体作为第一抗体，第二抗体为辣根过氧化物酶标记的抗兔抗体。结果证明rTNFR-II可被特异性抗可溶性肿瘤坏死因子受体-II的兔多克隆抗体识别见(图6)。
实施例6rTNFR-II的活性测定竞争性结合法测定rTNFR-II活性。rTNFR-II与不同浓度的人肿瘤坏死因子-α(TNF-α)反应2小时后，检测游离的TNF-α对L929细胞的毒性作用。结果证明rTNFR-II能够结合TNF-α从而降低TNF-α对L929细胞的毒性作用(图7)。
权利要求
1.一种人类重组可溶性肿瘤坏死因子受体-II的制备方法，其特征是由如下步骤组成用SEQ ID No.1所述的核苷酸序列和SEQ ID No.2所述的氨基酸序列设计SEQ ID No.3、SEQID No.4所述的核苷酸序列作为PCR引物，进行PCR扩增，获得表达TNFR-II的基因片段；通过NcoI和XhoI双酶切位点，将表达TNFR-II的基因片段克隆到原核表达载体pET-22b(+)中，构建表达载体pET-TNFR-II；将重组载体pET-TNFR-II经转入大肠杆菌BL21(DE3)内获得工程菌；诱导后的工程菌，经低温离心，收集菌体，使用低温低渗缓冲液抽提，再次低温离心，取上清，经层析纯化后，获得一种人类重组可溶性肿瘤坏死因子受体-II。
2.根据权利要求1所述的一种人类重组可溶性肿瘤坏死因子受体-II的制备方法，其特征是所述抽提的方法为按100克菌体使用300ml的2mmol/L～20mmol/L pH为7.9Tris-HCl缓冲液，再加入1mmolEDTA，充分悬浮菌体，0℃～4℃放置30分钟～60分钟。
3.根据权利要求1所述的一种人类重组可溶性肿瘤坏死因子受体-II的制备方法，其特征是所述低温离心步骤是指0℃～4℃，12000g离心10分钟～30分钟。
4.根据权利要求1所述的一种人类重组可溶性肿瘤坏死因子受体-II的制备方法，其特征是所述层析纯化步骤使用镍离子螯和亲和柱。
5.根据权利要求1所述的一种人类重组可溶性肿瘤坏死因子受体-II的制备方法，其特征是所述人类重组可溶性肿瘤坏死因子受体-II可被抗TNFR-II多克隆抗体特异性识别。
6.根据权利要求1所述的一种人类重组可溶性肿瘤坏死因子受体-II的制备方法，其特征是所述人类重组可溶性肿瘤坏死因子受体-II能够抑制肿瘤坏死因子-α的细胞毒作用。
全文摘要
本发明公开了一种人类重组可溶性肿瘤坏死因子受体－II的制备方法，步骤为用SEQ IDNo.3、SEQ ID No.4所述的核苷酸序列作为PCR引物，进行扩增，获得表达TNFR－II的基因片段；通过NcoI和XhoI双酶切，将基因片段克隆到原核表达载体pET－22b(+)中，构建表达载体pET－TNFR－II；将重组载体转入大肠杆菌BL21(DE3)内获得工程菌；诱导后的工程菌经离心，收集，抽提，再次离心，取上清，经层析纯化后，获得一种人类重组可溶性肿瘤坏死因子受体－II，本发明的方法制备的人类重组可溶性肿瘤坏死因子受体－II，不是以包涵体的形式表达，因此具有生物学活性并且生产成本低。
文档编号C07K14/435GK1986790SQ20051012243
公开日2007年6月27日 申请日期2005年12月19日 优先权日2005年12月19日
发明者徐斌, 孟磊, 文峰, 任倩, 韩忠朝 申请人:中国医学科学院血液学研究所泰达生命科学技术研究中心