一种人工诱导细胞发生程序性坏死的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种人工诱导细胞发生程序性坏死的方法。
【背景技术】
[0002] 程序性细胞坏死是一种细胞程序性死亡的方式\发生程序性坏死的细胞，在形态 上，主要表现为细胞肿胀和细胞膜破裂^程序性细胞坏死是一种宿主抵御病原体侵染的机 制，但是过度激活的程序性细胞坏死也会导致的组织炎症等病理过程、
[0003] 程序性细胞坏死可由许多不同的细胞外刺激所诱导，包括肿瘤坏死因子（TNF)。 TNF在细胞膜表面结合肿瘤坏死因子受体I (TNFRl)，触发受体分子三聚化进而诱导受体 分子的膜内蛋白结构域募集接头受体相互作用蛋白激酶1(RIP1)，TNFR1相关的死亡蛋白 (TRADD)等，形成细胞膜上的信号复合体（称为复合体-1)。在接头受体相互作用蛋白激酶 3 (RIP3)存在的细胞里，从复合体-I解离下来进入细胞浆的RIPl可以和RIP3结合，形成坏 死小体，进而通过磷酸化下游的激活混合谱系激酶结构域样蛋白（MLKL)，被激活的MLKL最 终导致细胞膜破裂引起细胞死亡。
[0004] 最近的研宄显示，介导程序性细胞坏死的坏死小体是一个具有淀粉样特征的纤维 状的超极分子复合物 7。其核心是，RIPl和RIP3通过他们各自的RIP同型相互作用结构域 (RHM)介导的纤维状多聚化相互作用。通过此相互作用，带有RHM结构域的RIPl和RIP3 蛋白片段可以自发的相互聚集，形成显微镜下可见的纤维状结构。在细胞内，RIP1/RIP3异 源多聚体复合物被认为是起到构架蛋白作用，具有信号传递的功能。但是，目前还不清楚这 种纤维状的异源聚合体是如何进行信号传递的。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种人工诱导细胞发生程序性坏死的方法，为了研宄在上 述异源多聚体中RIP3-RIP3二聚化/多聚化相互作用在坏死信号传递过程中的功能。
[0006] 本发明的具体技术方案如下：
[0007] 一种人工诱导细胞发生程序性坏死的方法，包括如下步骤：
[0008] (1)构建带有可诱导二聚化/多聚化的接头的RIP3融合蛋白基因序列；
[0009] (2)将步骤（1)制备的上述RIP3融合蛋白基因序列在真核细胞内表达形成RIP3 融合蛋白；
[0010] (3)添加诱导物，使得上述真核细胞内表达的RIP3融合蛋白发生二聚化/多聚化， 进而引起细胞发生程序性坏死。
[0011] 在本发明的一个优选实施方案中，所述可诱导的二聚化/多聚化接头为基于雌激 素受体蛋白（ER)的激素结合结构域（HBD)的同源二聚化/多聚化接头，可以通过雌激素介 导的相互作用，形成HBD同源二聚体。
[0012] 在本发明的一个优选实施方案中，所述可诱导的二聚化/多聚化接头为基于 FK506结合蛋白（FKBP12,也称FKBP)和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR)的FRB结构域的 异源二聚化/多聚化接头，可以通过雷帕霉素（rapamycin)介导的相互作用，形成FKBP-FRB 异源二聚体。
[0013] 在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤（1)为：通过LIC方法将可诱导的二聚 化/多聚化的接头基因序列于RIP3蛋白基因序列相连，形成带有可诱导二聚化/多聚化的 接头的RIP3融合蛋白基因序列。
[0014] 在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤（2)为：将步骤（1)制备的上述RIP3 融合蛋白基因序列通过真核细胞慢病毒表达载体在真核细胞内表达形成RIP3融合蛋白。
[0015] 进一步优选的，所属真核细胞慢病毒表达载体为pBOBI。
[0016] 本发明的有益效果是：本发明的方法通过聚化诱导物小分子的加入可以特异性的 诱导RIP3发生二聚化/多聚化相互作用，进而特异性激活程序性细胞坏死信号通路，可用 于针对程序性坏死的特异性抑制剂的筛选。
【附图说明】
[0017] 图1为本发明实施例中融合蛋白的构建图。
[0018] 图2为本发明实施例中的RIP3KHIM mut突变蛋白与野生型RIP3蛋白相互作用图。
[0019] 图3 :本发明实施例中利用4-OHT刺激HBD*-RIP3khim mut融合蛋白二聚化诱导小鼠 成纤维细胞（L929)细胞程序性坏死图。
[0020] 图4为本发明实施例中利用AP21976刺激FKBP和FRB接头的RIP3KHIM _融合蛋 白二聚化诱导小鼠胚胎成纤维细胞（MEF)程序性坏死图。
[0021] 图5为本发明实施例中利用AP21976刺激FKBP和FRB接头的RIP3KHIM _融合蛋 白二聚化诱导小鼠胚胎成纤维细胞（L929)程序性坏死图。
[0022] 图6为本发明实施例中利用AP20187刺激FV-FV接头的hRIP3KHIM _融合蛋白二 聚化诱导人宫颈癌细胞Hela程序性坏死图。
【具体实施方式】
[0023] 以下通过【具体实施方式】结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。 [0024] 实施例1
[0025] 1)设计并优化聚合系统。
[0026] 由于本发明使用的二聚化/多聚化接头是细胞内源性表达的蛋白，为了避免内源 性干扰，本发明根据如下文献进行了优化修改：
[0027] Littlewood TD，Hancock DC，Danielian PS，Parker MG, Evan GI. A modified oestrogen receptor ligand-binding domain as an improved switch for the regulation of heterologous proteins. Nucleic Acids Res 1995,23 (10) :1686-1690.
[0028] Pollock Rj Giel M，Linher K，Clackson T. Regulation of endogenous gene expression with a small-molecule dimerizer. Nat Biotechnol 2002,20 (7) :729-733.
[0029] Clackson TjYang WjRozamus LWjHatada MjAmara JFjRollins CTj et al. Redesigning an FKBP-ligand interface to generate chemical dimerizers with novel specificity. Proc Natl Acad Sci U S A 1998,95(18) :10437-10442.
[0030] 具体包括四个部分：
[0031] a.针对HBD同源二聚化接头系统：雌激素受体蛋白（ER)的激素结合结构域 (HBD)，可以通过雌激素介导的相互作用，形成HBD同源二聚体。为了避免细胞内源性表达 的雌激素和雌激素受体对实验的干扰，本实施例根据文献对系统进行了优化修改S用雌激 素类似物4-OHT代替雌激素，用HBD的G521R突变体HBD*代替野生型，构建了融合蛋白表 达载体HBD*-RIP3 mM _ (如图1所示）。其中，RIP3mM _是一个RIP3的突变体，对于人源 的RIP3,此突变为VQVG458-461AAAA ;对于鼠源的RIP3,此突变为QIG449-451AAA ;此突变 阻断RIP3之间的相互作用（如图2所示），避免了 RIP3在加入诱导物之前相互作用形成二 聚体或多聚体。
[0032] b.针对FKBP和FRB介导的二聚化系统：为了避免内源性FKBP和FRB蛋白对实验 的干扰，本实施例根据文献对系统进行了优化修改 2:用雷帕霉素类似物AP21976代替雷帕 霉素，用FRB的T2098L突变体FRB*代替野生型，构建了融合蛋白表达载体FKBP-RIP3 khim mut 和FRB*-RIP3KHIM mut(如图1所示）。其中为了避免RIP3在加入诱导物之前相互作用，本实 施例也突变了 RIP3的相互作用区域（RIP3KHIM mut)。
[0033] c.基于FKBP和FRB*的多聚化系统：由于RIP3的RHM结构域具有潜在的多聚化 能力，本实施例通过保留其RHIM结构域，可以获得多聚体。这个系统由：FKBP-RIP3 mM mut和 FRB*-RIP3WT组成（如图1所示）。
[0034] d.为了获得更强的二聚化/多聚化效果，根据文献报道3本实施例针对FKBP进行 改造，获得了 FKBP (F36V)，文中简称为FV，此突变体可以在小分子AP20187的作用下发生强 烈的二聚化作用。通过将两个FV进行串联融合，本实施例获得更强的二聚化/多聚化效果， 即 RIP3KHIM mut - FV-FV(如图 1 所示）。
[0035] 2)构建表达带有聚化接头融合蛋白的质粒载体。
[0036] RIP3及其突变体全部构建在pBOB载体上。本实施例所使用的pBOB载体上有以下 公共的多克隆位点，一般PBOB载体用BamHI和XhoI双酶切，目的基因片段在此插入。
[0037]
【主权项】
1. 一种人工诱导细胞发生程序性坏死的方法，其特征在于：包括如下步骤： (1) 构建带有可诱导二聚化/多聚化的接头的RIP3融合蛋白基因序列； (2) 将步骤（1)制备的上述RIP3融合蛋白基因序列在真核细胞内表达形成RIP3融合 蛋白； (3) 添加诱导物，使得上述真核细胞内表达的RIP3融合蛋白发生二聚化/多聚化，进而 引起细胞发生程序性坏死。
2. 如权利要求1所述的一种人工诱导细胞发生程序性坏死的方法，其特征在于：所述 可诱导的二聚化/多聚化接头为基于雌激素受体蛋白的激素结合结构域的同源二聚化/多 聚化接头。
3. 如权利要求1所述的一种人工诱导细胞发生程序性坏死的方法，其特征在于：所述 可诱导的二聚化/多聚化接头为基于FK506结合蛋白和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白的FRB结 构域的异源二聚化/多聚化接头。
4. 如权利要求1至3中任一权利要求所述的一种人工诱导细胞发生程序性坏死的方 法，其特征在于：所述步骤（1)为：通过LIC方法将可诱导的二聚化/多聚化的接头基因序 列于RIP3蛋白基因序列相连，形成带有可诱导二聚化/多聚化的接头的RIP3融合蛋白基 因序列。
5. 如权利要求1至3中任一权利要求所述的一种人工诱导细胞发生程序性坏死的方 法，其特征在于：所述步骤（2)为：将步骤（1)制备的上述RIP3融合蛋白基因序列通过真核 细胞慢病毒表达载体在真核细胞内表达形成RIP3融合蛋白。
6. 如权利要求5所述的一种人工诱导细胞发生程序性坏死的方法，其特征在于：所属 真核细胞慢病毒表达载体为PBOBI。
【专利摘要】本发明公开了一种人工诱导细胞发生程序性坏死的方法，包括如下步骤：(1)构建带有可诱导二聚化/多聚化的接头的RIP3融合蛋白基因序列；(2)将步骤(1)制备的上述RIP3融合蛋白基因序列在真核细胞内表达形成RIP3融合蛋白；(3)添加诱导物，使得上述真核细胞内表达的RIP3融合蛋白发生二聚化/多聚化，进而引起细胞发生程序性坏死。本发明的方法通过聚化诱导物小分子的加入可以特异性的诱导RIP3发生二聚化/多聚化相互作用，进而特异性激活程序性细胞坏死信号通路，可用于针对程序性坏死的特异性抑制剂的筛选。
【IPC分类】C12N15-62, C12N15-867
【公开号】CN104726499
【申请号】CN201510165638
【发明人】韩家淮, 吴晓男, 黄哲, 李渊越, 汪雪坤, 杨章华
【申请人】厦门大学
【公开日】2015年6月24日
【申请日】2015年4月9日
【公告号】CN104073515A