专利名称：人肿瘤生成及转移促进受体分子及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及肿瘤生成及转移促进受体分子及其编码基因与应用，特别是来源于人的肿瘤生成及转移促进受体分子及其编码基因与应用。
背景技术：
蛋白酪氨酸激酶受体(PTKR)在各种细胞调控水平及肌体不同发育阶段中起着重要作用，比如参与细胞的增殖、分化及抗凋亡等过程。典型的PTKR结构表现为细胞脂质双分子层上的单跨膜蛋白，分为胞外区、跨膜区及胞内区。胞外区具有相应配体的特异性识别位点，在结合配体过程中起重要作用。胞内区含有酪氨酸激酶功能域，参与胞内的信号转导及受体、衔接蛋白的磷酸化过程，特别是有丝分裂原的信号转导。PTKR在细胞内的异常表达常会导致遗传疾病及肿瘤。因此，PTKR蛋白的表达在肌体内受到严格调控。目前为止，至少有18种PTKR与肿瘤转化有关，可作为癌基因。重要的实例包括成纤维生长因子受体(FGFR)、表皮生长因子受体(EGFR)、血小板来源的生长因子受体(PDGFR)、胰岛素受体(InsR)和肝细胞生长因子受体(Met)等。
研究显示部分PTKR异常剪接变异体与肿瘤的发生相关。比如从人骨肉瘤及乳腺癌细胞可分离到缺少全部跨膜区的可溶性FGFR3分子。而在胃癌细胞中，一种符合蛋白编码的49氨基酸的缺失可导致Ron酪氨酸受体的组成性激活。最近从脑垂体肿瘤中人们分离到一种新型FGFR4剪接变异体，被称做ptd-FGFR4。这种剪接变异体缺少几乎全部的FGFR4受体胞外区，并且不包含信号肽，导致该成熟蛋白仅在胞浆表达。过量表达ptd-FGFR4可导致细胞转化。通过转基因方式在小鼠体内进行组织特异性表达可形成垂体瘤。另外，利用N端和C端特异性抗体，人们发现部分恶性肌骨骼瘤临床病人样品中也有N端缺失的Met受体表达。
发明内容
本发明的目的是提供一种人的肿瘤生成及转移促进受体分子及其编码基因。
本发明所提供的人肿瘤生成及转移促进受体名称为TMIR-H，它是序列表中SEQID №2的氨基酸残基序列或将SEQ ID №2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID №2相同活性的由SEQ ID №2衍生的蛋白质。
序列表中SEQ ID №2的蛋白质由422个氨基酸残基组成，是一个N端缺失异常剪接变异体，几乎所有胞外区全部缺失。
人成纤维生长因子受体样分子TMIR-H的编码基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID №1；2)编码序列表中SEQ ID №2蛋白质序列的多核苷酸；3)与序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
序列表中的SEQ ID №1由1269个碱基组成。具有癌基因功能。
人源TMIR-H位于12号染色体上，基因组分析有至少11个外显子，其中第3外显子到第11外显子剪接成1269bp的cDNA编码TMIR-H蛋白分子。蛋白的氮端有保守的跨膜信号及一个150氨基酸的典型胞内酪氨酸激酶功能域。氨基酸序列比较发现，TMIR-H与FGFR家族同源性最高，有29-32％一致性，与PDGFR家族有23％一致性，如图1所示，进化树分析发现，TMIR-H与其他FGFR家族蛋白在进化的早期阶段分离，说明TMIR-H有可能是一类新型的与FGFR相关性的受体。
本发明的TMIR-H可以转化NIH3T3及BaF3细胞，在裸鼠中成瘤，并有恶性转化特点，TMIR-H可引发肿瘤侵入以及多脏器转移，提示TMIR-H可作为一个新的癌基因在癌症发生中发挥作用。因此，TMIR-H转化的NIH3T3和BaF3细胞，以及成瘤的裸鼠动物模型可作为筛选其他MAPK及PI3K通路抑制剂和抗肿瘤药物的技术平台，是潜在的抗肿瘤药物筛选体系，还可作为与肿瘤发生相关的信号通路的研究工具，TMIR-H的SiRNA的质粒表达系统及反转录表达系统可作为研究TMIR-H与临床肿瘤关系的工具，利用现代生物工程技术手段，特异性阻断靶基因的表达，进而达到预防和治疗癌症的目的。
图1为本发明TMIR-H与FGFR及PDGFR家族成员的进化树比较。
图2为人组织Northern杂交分析结果。
图3为RT-PCR检测结果。
图4为[3H]掺入实验显示稳定BaF3(TMIR)及BaF3(EPOR/TMIR)细胞系在没有血清及生长因子条件下的增殖情况。
图5为[3H]掺入实验显示EPO取代条件培养液的增殖效应。
图6为不同BaF3细胞在没有IL-3的半固体培养基中的集落生长情况。
图7为PI3K和MAPK信号通路阻断后的细胞集落生成。
图8为小鼠成瘤比较。
图9为BaF3(TMIR)细胞在肝脏成侵润性生长图10为苏木精-伊红染色肿瘤细胞在各脏器的转移侵润情况图11为肿瘤细胞在注射部位的侵润图12为TMIR-H蛋白在细胞内的定位。
具体实施例方式
实施例1、TMIR-H cDNA的克隆及其表达质粒、稳定细胞系的构建TMIR-H全长cDNA从人扁桃体肿瘤总RNA中经RT-PCR获得。用于扩增人TMIR-H的引物序列为5′-GCTTATGGGCATGATGACACGGATGCT-3′和5′-TATAGCGGCCGCTCAAAGCATGCTATAGTTGTA-3′。反应条件按照一步法RT-PCR的使用说明进行(Takara或Clontech)，PCR产物先亚克隆到T载体，酶切鉴定有插入片段后再进行测序。
将测序过的RT-PCR产物经HindIII和XhoI双酶切后亚克隆到pcDNA3上，构成pcDNA3(TMIR-H)表达质粒。用引物5′-TATAGCGATATCATGGACAAACTCAGGGTGCC-3′和5′-TATAGCGCGGCCGCGAGAGGGTCCAGGTCGCTA-3′扩增鼠红细胞生成素受体(EPOR)胞外区，并将该片段亚克隆到pcDNA3的EcoR V和Not I位点，构成质粒pcDNA3(EPOR)。以引物5′-TATAGCGGCCGCAGTGATTATCGTCCCAACTTT-3′和5′-TATACCAGTGTGCTGGTCACTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCAAGCATGCTATAGTTGTAGA-3′扩增人TMIR-H跨膜区及胞内区，并将其亚克隆到pcDNA3(EPOR)的Not I和BstX I，构成完整的融合基因表达载体pcDNA3(EPOR/TMIR-H)，该融合基因C末端携带FLAG标签，可被鼠M2抗体识别。
为使BaF3细胞(小鼠前B细胞)稳定表达TMIR-H或EPOR/TMIR-H融合基因，将质粒pcDNA3(TMIR-H)及pcDNA3(EPOR/TMIR-H)分别转染到BaF3，在药物如G418的筛选下获得稳定外源基因的表达。离心收取1×106BaF3细胞，重悬于0.5ml无血清RPMI-1640培养液。将3μg pcDNA3(TMIR-H)或pcDNA3(EPOR/TMIR-H)与BaF3细胞混合，冰浴10分钟后，用ECM399(BTX公司)电转仪进行电转。电转条件为200-230 V，电流为25-35毫秒。电转后的细胞在RPMI-1640全培养基中生长。由于质粒pcDNA3携带新酶素抗性基因，稳定细胞可在500μg/ml G418下进行筛选。每三天换一次液，连续培养三周后，在100mm培养皿中进行扩增。
实施例2、TMIR-H基因的表达及组织特异性分析以TMIR-H为模板合成随机引物探针，Northern杂交分析显示TMIR-H相关基因在各脏器组织中有限制性表达。如图2所示，TMIR-H在人前列腺mRNA的表达量最高，在直肠、脑、胎盘及骨骼肌中表达量较低，图2中，S，Th，Pr，Te，U，Si，C，PL，H，B，Pc，Lu，Li，Sm，K，Pa分别代表脾，胸腺，前列腺，睾丸，子宫，小肠，直肠，外周血，心脏，脑，胎盘，肺，肝，骨骼肌，肾及脾脏。利用RT-PCR检测TMIR-H在各种转化和肿瘤细胞中的表达，显示其在卵巢癌、宫径癌、肝癌转化的人胚肾及髓性白血病等细胞中有表达，而在皮肤癌及单核吞噬细胞肿瘤中没有表达，结果如图3所示，图中L02，U937，Cosl，Cos7，293T，A431，Ana-1，HeLa，HL-60，Ho8910，K562分别为人肝细胞、人成单核细胞瘤样细胞、SV40病毒T抗原转化的非洲绿猴肾细胞1型、SV40病毒T抗原转化的非洲绿猴肾细胞7型、SV40病毒T抗原转化的人胚肾细胞、人表皮样癌细胞、人巨噬细胞、含HPV-18序列的人腺癌细胞、急性早幼粒白血病细胞、卵巢癌细胞、慢性粒细胞白血病细胞。为了确定TMIR-H蛋白在细胞内的定位，用质粒pEFBos(EGFP)和pEFBos(EGFP/TMIR-H)分别瞬时转染NIH3T3细胞，48小时后，细胞在尼康显微镜下以紫外光激发，拍照，结果如图12所示。
实施例3、细胞增殖实验稳定细胞在半固体培养基中的生长是检测细胞转化特性的依据之一。将实施例1中得到的表达TMIR-H(BaF3-TMIR-H)及表达EPOR/TMIR-H融合基因(BaF3-EPOR/TMIR-H)的细胞以1×105的浓度悬浮在60mm培养皿盛装的0.4％琼脂糖培养基中，铺在0.8％的琼脂糖培养基之上。琼脂糖培养基用RPMI-1640培养液制备，其中含有5％FBS及400μg/ml G418。以野生型BaF3为阴性对照，除野生型BaF3及空载体转染的稳定细胞可加10％WEHI-3B上清外，其他稳定细胞均在没有外源生长因子的培养基中生长。三周后，可用0.25mg/ml的iodonitrotetrazonium染液染色两天。然后，用倒置显微镜计算直径大于0.1mm的细胞克隆数。结果如表1所示，代表三次平行实验的平均值±标准差，6E和D8分别代表最初从96孔板相应位置上得到的阳性克隆。数据表明，在没有条件培养液情况下，稳定表达TMIR-H或EPOR/TMIR-H均可刺激BaF3增殖。
表1、用BaF3稳定细胞系检测细胞转化BaF3细胞系 细胞数 集落数(标准差)野生型 1×1050(0)EPOR/TMIR-H(6E) 1×105102(10)TMIR-H(D8) 1×105206(18)为检测稳定细胞系的增殖效应，进行了[3H]掺入实验，细胞首先在没有WEHI-3B条件上清的RPMI-1640中饥饿20小时，此时可在低血清培养液(含1％FBS)中培养。20小时后细胞记数，将每孔1×105的细胞铺在96孔板上，每一个检测点重复三次。在检测培养时间效应时，分为0，1，2，3，和4天进行检测。在每个时间点收取细胞前6小时，每孔内加入1微居的[3H]标记的胸腺嘧啶(thymidine)进行刺激。在检测不同浓度EPO的效应时，BaF3(EPOR/TMIR-H)细胞在上述饥饿条件中加入不同浓度的EPO，如0.001，0.01，0.1，1，5，和10单位/ml，培养两天，在收取细胞前6小时，每孔内也要加入1微居的[3H]标记的胸腺嘧啶(thymidine)进行刺激。刺激6小时后，收集细胞，用1×PBS清洗一便，重悬于150μl的5％三氯乙酸(trichloroacetic acid)中。再次离心，细胞沉淀溶于150μl的0.5N NaOH/0.5％SDS中，用96孔闪烁板记数。结果表明，BaF3-TMIR-H和BaF3-EPOR/TMIR-H在饥饿条件下较野生型BaF3细胞有明显的增殖能力。另外，如图5所示，用EPO取代条件培养液刺激BaF3-EPOR/TMIR-H可使细胞具有明显的增殖效应。
实施例4、细胞转化实验对TMIR-H功能域分析发现其胞内区含有一个保守的酪氨酸激酶功能域，该激酶功能域在很多生长因子受体蛋白均存在，并可发挥细胞转化及促进癌症发生的作用。正常细胞一般不具备锚钉非依赖性生长(anchorage-independent growth)能力，但癌基因转化过的细胞可以在半固体琼脂胶培养基中呈集落性生长。正常的BaF3细胞增殖具有生长因子依赖性的特点，需要外界补充IL-3。用实施例1的pcDNA3.0空载体或表达TMIR-H的pcDNA3.0(TMIR-H)瞬式转染NIH3T3细胞。将转染的细胞铺在软琼脂糖中，在400μg/ml G418下筛选。三周后计算直径大于0.1mm的细胞克隆。结果如表2及图6所示，表中的数据代表三次平行实验的平均值±标准差。可以看出，与野生型相比，稳定表达TMIR-H的BaF3细胞有明显的集落生成，并且可以在没有生长因子的条件中增殖。
表2、通过瞬式转染NIH3T3细胞检测TMIR-H的细胞转化能力载体 细胞数 集落数(标准差)pcDNA3.0 4.2×1050(0)pcDNA3.0(TMIR-H) 4.2×10512(2)说明1)TMIR-H具有癌基因最基本的特性，即有转化正常细胞的作用；2)TMIR-H具有自主激发增殖信号的能力，即TMIR-H在胞内处于持续活化状态。激活PI3K及MAPK信号通路常与肿瘤转化直接相关。为验证TMIR-H转化的BaF3细胞内这两条信号通路在细胞转化过程中起着重要作用，用PD98059和LY294002分别特异性阻断MAPK及PI3K通路，结果如图7所示(图中6E即BaF3(EPOR/TMIR-H)；LY代表LY294002；PD代表PD98059)，显示半固体琼脂胶集落生成受到明显抑制，且单一抑制任何一条通路均可导致增殖信号受阻。说明PI3K及MAPK信号通路协同激活在TMIR-H引发的细胞转化过程中是一个既充分又必要的条件。
实施例5、TMIR-H转化细胞的致瘤性及恶性转化能力实验体内成瘤实验的具体步骤是，将3×106到2×107实施例1得到的稳定细胞系皮下注射到4-6周去胸腺Balb-c裸鼠，注射部位是前臂腋下皮肤。每一种细胞注射三只小鼠，并以野生型BaF3为阴性对照。每一实验组包括两只雌鼠(F1和F2)及一只雄鼠(M)。两种不同剂量分两次注射，第一次注射到右腋(r)，第二次注射到左腋(l)。两周后可见明显肿瘤形成，图8为接种后三周对照组与试验组成瘤情况，其中a为皮下接种wtBaF3，没有肿瘤；b为皮下接种BaF3(TMIR-H)，具有明显的肿瘤。一个月后小鼠全身出现衰竭，行动迟缓，接种后35-40天死亡。33天病检BaF3(TMIR-H)接种裸鼠可见肝脾明显肿大(如图9所示)。瘤块呈无胞膜侵润性生长，在注射部位侵入骨骼肌肌纤维间隙，情况如表3及图11a所示，肿瘤切片经苏木精-伊红染色后，可见肿瘤细胞在注射部位(前腋皮下)成侵润性生长。箭头显示肿瘤细胞侵入皮下骨骼肌。肝脏转移的肿瘤细胞增生活跃成不典型性核分裂象，情况如图11b所示。苏木精-伊红染色肝、脾、肺、肾和骨骼肌有明显肿瘤细胞浸润，及大量转移灶生成(如图10所示)。说明该基因的异位表达可导致恶性肿瘤的发生。
表3、肿块的生长情况
序列表<160>2<210>1<211>1269<212>DNA<213>人属人(Homosapiens)<400>1atgggcatga cacggatgct cctggaatgc agtctcagtg acaagttgtg tgtcatccag 60gagaagcagt atgaagtgat tatcgtccca actttgttgg ttactatctt cctcatcctt 120cttggggtca tcctgtggct ttttatcaga gaacaaagaa ctcaacagca gcgttctgga 180cctcaaggca ttgcccctgt tcctccacct agggacctaa gctgggaagc aggacatgga 240ggaaatgtgg ctttgccact taaggagaca tccgtggaaa actttctggg agctaccaca 300cctgccctgg ctaagctgca ggtgccgcgg gagcaactct ctgaagttct ggagcagatt 360tgcagcggta gctgtgggcc catctttcga gccaatatga acactgggga cccttctaag 420cccaagagtg ttattctcaa ggctttaaaa gaaccagctg ggctccatga ggtacaagat 480ttcttagggc gaatccaatt ccatcaatac ctggggaaac acaaaaacct ggtgcagctg 540gaaggctgct gcactgaaaa gctgccactc tatgtggtgt tggaggatgt ggcccagggg 600gacctgctta gctttctctg gacctgtcgg cgggatgtga tgactatgga tggtcttctc 660tatgatctca cagaaaaaca agtatatcac atcggaaagc aggtcctttt ggcgctggaa 720ttcctgcagg agaagcattt gttccatggg gatgtggcag ccaggaatat tctgatgcaa 780agtgatctca ctgctaagct ctgtggatta ggcctggctt atgaagttta cacccgaggg 840gccatctcct ctactcaaac catacctctc aagtggcttg ccccagaacg gcttctcctg 900agacctgctc gcatcagagc agatgtctgg tcttttggga tcctgctcta tgagatggtg 960actctaggag caccaccgta tcctgaagtc cctcctacca gcatcctaga gcatctccaa1020agaaggaaaa tcatgaagag acccagtagc tgcacacata ccatgtacag tatcatgaag1080tcctgctggc gctggcgtga ggctgaccgc ccctcaccta gagagctgcg cttgcgccta1140gaagctgcca ttaaaactgc agatgacgag gctgtgttac aagtaccaga gttggtggta1200cctgaactgt atgcagctgt ggccggcatc agagtggaga gcctcttcta caactatagc1260atgctttga1269<210>2<211>422
<212>PRT<213>人属人(Homosapiens)<400>2Met Gly Met Thr Arg Met Leu Leu Glu Cys Ser Leu Ser Asp Lys1 5 10 15Leu Cys Val Ile Gln Glu Lys Gln Tyr Glu Val Ile Ile Val Pro20 25 30Thr Leu Leu Val Thr Ile Phe Leu Ile Leu Leu Gly Val Ile Leu35 40 45Trp Leu Phe Ile Arg Glu Gln Arg Thr Gln Gln Gln Arg Ser Gly50 55 60Pro Gln Gly Ile Ala Pro Val Pro Pro Pro Arg Asp Leu Ser Trp65 70 75Glu Ala Gly His Gly Gly Asn Val Ala Leu Pro Leu Lys Glu Thr80 85 90Ser Val Glu Asn Phe Leu Gly Ala Thr Thr Pro Ala Leu Ala Lys95 100 105Leu Gln Val Pro Arg Glu Gln Leu Ser Glu Val Leu Glu Gln Ile110 115 120Cys Ser Gly Ser Cys Gly Pro Ile Phe Arg Ala Asn Met Asn Thr125 130 135Gly Asp Pro Ser Lys Pro Lys Ser Val Ile Leu Lys Ala Leu Lys140 145 150Glu Pro Ala Gly Leu His Glu Val Gln Asp Phe Leu Gly Arg Ile155 160 165Gln Phe His Gln Tyr Leu Gly Lys His Lys Asn Leu Val Gln Leu170 175 180Glu Gly Cys Cys Thr Glu Lys Leu Pro Leu Tyr Val Val Leu Glu185 190 195Asp Val Ala Gln Gly Asp Leu Leu Ser Phe Leu Trp Thr Cys Arg200 205 210Arg Asp Val Met Thr Met Asp Gly Leu Leu Tyr Asp Leu Thr Glu215 220 225Lys Gln Val Tyr His Ile Gly Lys Gln Val Leu Leu Ala Leu Glu
230 235 240Phe Leu Gln Glu Lys His Leu Phe His Gly Asp Val Ala Ala Arg245 250 255Asn Ile Leu Met Gln Ser Asp Leu Thr Ala Lys Leu Cys Gly Leu260 265 270Gly Leu Ala Tyr Glu Val Tyr Thr Arg Gly Ala Ile Ser Ser Thr275 280 285Gln Thr Ile Pro Leu Lys Trp Leu Ala Pro Glu Arg Leu Leu Leu290 295 300Arg Pro Ala Arg Ile Arg Ala Asp Val Trp Ser Phe Gly Ile Leu305 310 315Leu Tyr Glu Met Val Thr Leu Gly Ala Pro Pro Tyr Pro Glu Val320 325 330Pro Pro Thr Ser Ile Leu Glu His Leu Gln Arg Arg Lys Ile Met335 340 345Lys Arg Pro Ser Ser Cys Thr His Thr Met Tyr Ser Ile Met Lys350 355 360Ser Cys Trp Arg Trp Arg Glu Ala Asp Arg Pro Ser Pro Arg Glu365 370 375Leu Arg Leu Arg Leu Glu Ala Ala Ile Lys Thr Ala Asp Asp Glu380 385 390Ala Val Leu Gln Val Pro Glu Leu Val Val Pro Glu Leu Tyr Ala395 400 405Ala Val Ala Gly Ile Arg Val Glu Ser Leu Phe Tyr Asn Tyr Ser410 415 420Met Leu42权利要求
1.人肿瘤生成及转移促进受体分子TMIR-H，它是序列表中SEQ ID №2的氨基酸残基序列或将SEQ ID №2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID №2相同活性的由SEQ ID №2衍生的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的人肿瘤生成及转移促进受体分子TMIR-H，其特征在于它具有序列表中SEQ ID №2的氨基酸残基序列。
3.人肿瘤生成及转移促进受体分子TMIR-H的编码基因，它是下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID №1；2)编码序列表中SEQ ID №2蛋白质序列的多核苷酸；3)与序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于所述人肿瘤生成及转移促进受体分子TMIR-H的编码基因是序列表中的SEQ ID №1。
5.含有权利要求4所述基因的表达载体。
6.含有权利要求4所述基因的细胞系。
7.权利要求4所述基因在构建抗肿瘤药物筛选模型中的应用。
8.权利要求4所述基因在制备治疗癌症的药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了人肿瘤生成及转移促进受体分子及其编码基因与应用，本发明所提供的人肿瘤生成及转移促进受体分子名称为TMIR－H，它是序列表中SEQ ID №2的氨基酸残基序列或将SEQ ID№2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID №2相同活性的由SEQ ID №2衍生的蛋白质。人成纤维生长因子受体样分子TMIR－M的编码基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID №1；2)编码序列表中SEQ ID №2蛋白质序列的多核苷酸；3)与序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。TMIR－H具有癌基因功能。
文档编号C07K14/435GK1526728SQ03105109
公开日2004年9月8日 申请日期2003年3月3日 优先权日2003年3月3日
发明者刘力, 傅新元, 常智杰, 李铁石, 李颖华, 宋连霞, 余欣孜, 陈培拉, 刘 力 申请人:清华大学