专利名称：一种蛋白质交联剂及其交联方法
技术领域：
本发明属于蛋白质修饰研究领域，尤其涉及药用蛋白质修饰研究领域。
背景技术：
多肽、蛋白质作为药物，已广泛地用于疾病的治疗。蛋白质是天然抗原，异源蛋白进入人体内会引起抗体产生。通过抗原抗体反应，异源蛋白因被清除而不能有效发挥其治疗功能，有时异源蛋白甚至会产生过敏反应。有些有治疗前景的多肽、蛋白质由于在机体内的循环半寿期太短而达不到治疗效果。对蛋白质(多肽)进行化学修饰可有效地解决上述问题。蛋白质的化学修饰是指用化学方法在分子水平上对蛋白质分子进行改造，即在体外将蛋白质的侧链基团通过人工方法与一些化学基团进行共价连接，或者改变蛋白质分子的主链结构，从而改变蛋白质的性质。用于对蛋白质(多肽)进行化学修饰的试剂很多，如葡聚糖、淀粉、聚乙二醇(PEG)、血清白蛋白等。充分利用修饰剂所具有的各类化学基团的特性，直接或经过一定的活化过程与蛋白质分子上的某种氨基酸残基产生化学反应。由于化学修饰剂专一性的提高，化学修饰过程的分析技术和计算方法的完善以及结构生物学的发展，化学修饰的应用领域不断得到拓宽。
早期用蛋白质对蛋白质进行化学修饰可追溯于制备酶-抗体偶联物，用于酶联免疫吸附分析(ELISA)。后来发展为用惰性蛋白来修饰不稳定的药用蛋白，如用牛血清白蛋白修饰脲激酶，以及同种蛋白质自身化学交联形成二聚体或多聚体。用蛋白质对蛋白质进行化学修饰即交联蛋白质，可增强蛋白质结构的稳定性，增大蛋白质分子量，延长蛋白质在体内的循环半衰期，减少肾毒性，提高蛋白质药物的生物安全性。
将血红蛋白交联聚合使其避免在体内解聚是血液代用品研究领域的一个热点。长期以来，研究人员一直在致力于血红蛋白交联剂的寻找。戊二醛是此领域研究最多的一种交联剂，但其本身在溶液中存在的形式复杂，聚合反应程度很难控制。在血红蛋白浓度较高，交联剂浓度较大，反应时间较长时，极易形成超高分子量的聚合血红蛋白，反应体系凝胶化，在体内也会产生强烈的毒性，使其应用受到限制(见G.Hughes，et al.Hematologic effects of a novel hemoglobin-basedoxygen carrier in normal male and female subjects，J.Lab.Clin.Med.1995，126441-451)。Baxter公司的双阿斯匹林，是目前应用于血红蛋白交联的最成功的交联剂(见R.Chatterjee，et al.Isolation andcharacterization of a new hemoglobin derivative cross-linkedbetweenαchains(Lysine 99α1-Lysine 99α2)，J.Biol.Chem.1986，2619929-9937)。但其只能形成分子内交，虽然不从肾小球滤过，但其血浆半寿期只为4h，不能实现向机体组织持续供养。如何做到既提高血红蛋白分子量(500kD)，又使聚合反应可控，是此领域人们努力急待解决的问题。将血红蛋白与其它药用蛋白交联起来，既可起到增大血红蛋白分子量的作用，又可发挥药用蛋白的特性。这也正成为人们研究的一个重要方向。
用蛋白质对蛋白质进行化学修饰需用到双功能交联剂，双功能试剂是具有两个反应功能基团，能与一个蛋白质的两个基团相互作用，形成分子内交联，或与两个不同蛋白质的某一基团相互作用，形成分子间偶联的化合物，常被用于蛋白质的化学修饰。双功能交联剂分为同型和异型两种。戊二醛是研究最多的一种同型双功能交联剂，它的两个醛基可以分别与两个相同或不同分子上的伯氨基形成Schiff氏碱，将两分子连接起来。但其本身在溶液中存在的形式复杂，且醛基的活性太高，与交联组分的反应缺乏选择性，易形成不均一的多种复合物，聚合反应程度很难控制(见陶慰孙，李惟.蛋白质分子基础.北京高等教育出版社，1995，287-313)。为了克服同型双功能交联试剂的缺陷，人们发展了异型双功能交联试剂，如N-羟基琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶基二硫)-丙酸脂(SPDP)(见1.Bradshaw T P，Dunlap R B.Characteization of anovel form of thymidylate synthasea heterodimer isolated afterspecific chemical modification of the immobilized native enzyme.Biochemistry，1993，32(47)12774-12781.2.谢琪璇，李莉.SPDP蛋白偶联技术在抗原构建中的应用.暨南大学学报(自然科学与医学版)，1998，19(增刊)36-40)，以实现控制交联，提高交联反应的选择性和交联产物的均一性。该试剂两端不同的反应基团能很好地控制反应，使得蛋白顺序连接反应成为可能，可以避免不必要的蛋白交联反应。异型双功能交联试剂的应用，基本上实现了交联反应的可控制性，减少或避免了蛋白的自身聚合和交叉聚合，保证了交联产物的有效性。但从目前来看，异型双功能交联剂价格昂贵，还不适合大规模制备蛋白质的交联物。
理想的交联剂应该是交联效率高，而且交联产物的组成较为均一，能最大限度地保持生物活性，操作方便，纯化容易；在同样条件下，重复性好。然而，目前还没有一种交联剂能够同时满足上述要求。因此，必须研究发展新的交联剂适应这种需求。
发明内容
本发明的化合物涉及的交联剂，较多的用作环氧树脂的改性剂、纤维整理剂、合成氯化物的稳定剂、胺类固化剂改性剂(见梁平辉.脂肪族缩水甘油醚的合成与应用.辽宁化工，1995(3)15-21)、琼脂糖壳聚糖等凝胶的交联剂(见曲荣君.天然高分子吸附剂研究.乙二醇双缩水甘油醚交联壳聚糖的制备及其对Cu2+、Ni2+的吸附性能.应用化学，1996，13(2)22-25)、亲和色谱凝胶与蛋白的交联剂等(见李湛勇.双缩水甘油醚活化法制备免疫吸附剂及其对乙型肝炎表面抗原的吸附.离子交换与吸附，2001，17(3)242-247)，但其用作蛋白质的双功能交联剂方面未发现报道。本发明利用此交联剂将血红蛋白、血清白蛋白、卵清蛋白、干扰素、集落刺激因子、胰岛素等蛋白质、多肽自身及相互之间进行交联。
本发明的化合物为带有环氧基团的同型双功能交联剂，环氧基团与各种不同基团反应具有一些特殊的性质，在pH7.5-8.5之间，其主要是与巯基发生反应，在pH9以上，其主要是与氨基反应，在pH11以上，其主要是与其羟基反应。利用此性质，可转换pH值，提高蛋白质交联的可控性。
这些化合物优选为各种二醇二缩水甘油醚，包括乙二醇二缩水甘油醚、1，4-丁二醇二缩水甘油醚、1，6-己二醇二缩水甘油醚、二甘醇二缩水甘油醚、聚乙二醇二缩水甘油醚等。
本发明的化合物作为交联剂交联蛋白质，包括用此化合物与蛋白质(多肽)反应。
本发明的化合物交联蛋白质(多肽)的方法，包括一步交联法和两步交联法。
一步交联方法将蛋白质溶于pH6-12，优选为pH7.5-9.5的磷酸、HEPES、硼酸、硼砂-氢氧化钠或碳酸钠缓冲溶液中，蛋白质浓度为1-150mg/ml，优选蛋白质浓度为10-100mg/ml，加入交联剂，交联剂与蛋白质的配比为5∶1-600∶1，优选为25∶1-500∶1，控制反应温度4-55℃，优选为25-37℃，反应时间1-48小时，优选为2-24小时。
两步交联方法先活化一种蛋白质，将一种蛋白质溶于pH6-12，优选为pH7.5-9.5的磷酸、HEPES、硼酸、硼砂-氢氧化钠或碳酸钠缓冲溶液中，蛋白质浓度为1-150mg/ml，优选蛋白质浓度为5-100mg/ml，控制反应温度4-55℃之间，优选为25-37℃，加入交联剂，交联剂与蛋白质的配比为5∶1-600∶1，优选为25∶1-500∶1，反应时间1-48小时，优选为2-24小时。交联剂与一种蛋白质的活性基团反应(该活性基团可以为巯基或氨基)后，过Sephadex G-25脱盐柱或低温透析脱修饰剂，同时调节缓冲液pH值，使pH与第一步反应pH相同或不同，但其pH范围仍为6～12，优选为7.5-9.5，再等量加入另一种蛋白，使交联剂与其活性基团(该活性基团可以为巯基或氨基)再继续反应1-48小时。
本发明通过以下具体实施例来描述本发明化合物在蛋白质与蛋白质及蛋白质与多肽交联方面的应用。
图1为乙二醇二缩水甘油醚制备的分子内交血红蛋白经SDS-PAGE电泳检测图谱第1泳道为标准分子量蛋白第2泳道为血红蛋白空白对照第3泳道为乙二醇二缩水甘油醚分子内交血红蛋白图2为乙二醇二缩水甘油醚制备的分子内交血红蛋白经Superdex 200凝胶过滤图谱实线为乙二醇二缩水甘油醚制备的分子内交血红蛋白虚线为血红蛋白空白对照图3为乙二醇二缩水甘油醚制备的分子内交血红蛋白的氧平衡曲线图4为乙二醇二缩水甘油醚制备的聚合血红蛋白经SDS-PAGE电泳检测图谱第1泳道为为标准分子量蛋白第2泳道为血红蛋白空白对照第3泳道为乙二醇二缩水甘油醚制备的聚合血红蛋白图5为乙二醇二缩水甘油醚制备的聚合血红蛋白经Superdex 200凝胶过滤图谱实线为血红蛋白空白对照虚线为乙二醇二缩水甘油醚制备的聚合血红蛋白具体实施方法实施例1乙二醇二缩水甘油醚(EGDE)制备分子内交血红蛋白血红蛋白浓度20mg/ml，溶液体系为pH7.5的50mM磷酸缓冲液，溶液总体系为5ml，乙二醇二缩水甘油醚与血红蛋白摩尔比为25∶1，37℃水浴摇床反应1小时。交联产物经SDS-PAGE电泳检测，结果显示有较深的32KD左右条带，说明有两亚基的交联(图1)。同时取样经Superdex 200凝胶过滤柱，其出峰时间与天然血红蛋白相同，说明其分子量为64KD。说明生成了分子内交的血红蛋白(图2)。交联后的血红蛋白较好地保持了生物活性，P50为23.2，Hill系数为2.42(图3)。
实施例2乙二醇二缩水甘油醚(EGDE)制备聚合血红蛋白血红蛋白浓度100mg/ml，溶液体系为pH9.5的50mM硼砂-氢氧化钠缓冲液、溶液总体系为5ml，乙二醇二缩水甘油醚与血红蛋白摩尔比为500∶1，37℃水浴摇床反应12小时。交联产物经SDS-PAGE电泳检测，结果显示蛋白亚基条带主要集中在32kD至96kD之间，说明形成了两个到六个亚基的交联物(图4)。同时取样经Superdex 200凝胶过滤柱，其出峰时间比血红蛋白标样提前，交联率高达98％。聚合血红蛋白分子量约为128KD，其峰面积约占总蛋白峰面积的80％，说明生成的血红蛋白二聚体占交联蛋白总量的80％。也有部分三聚及多聚血红蛋白生成，但从出峰时间来看，其分子量也小于300KD(图5)。交联后的血红蛋白较好地保持了生物活性，P50为22.5，Hill系数为2.23实施例3乙二醇二缩水甘油醚一步交联血红蛋白与血清白蛋白血红蛋白浓度2mg/ml，白蛋白浓度2.092mg/ml，溶液体系为pH8.7的50mM硼酸缓冲液、溶液总体系为5ml，乙二醇二缩水甘油醚与血红蛋白摩尔比为100∶1，25℃水浴摇床反应24小时。交联产物经SDS-PAGE电泳检测，结果显示有83kD和97kD条带生成。血红蛋白单亚基分子量约为16kD，白蛋白分子量为67kD，83kD为单个血红蛋白亚基与血清白蛋白的交联物，97kD为交联的两个血红蛋白亚基与一个血清白蛋白的偶联物，说明生成了血红蛋白与血清白蛋白的偶联物。
实施例4两步交联血红蛋白与血清白蛋白血红蛋白浓度10mg/ml，溶液体系为pH7.5的50mM的HEPES缓冲液、溶液总体系为5ml，乙二醇二缩水甘油醚与血红蛋白摩尔比为100∶1，37℃水浴摇床反应4小时，通过Sephadex G-25凝胶过滤除修饰剂，换缓冲液为pH9.5的50mM的硼砂-氢氧化钠缓冲液，按血红蛋白∶白蛋白＝1∶1加入白蛋白，按修饰剂与总蛋白比为10∶1补加另一种修饰剂聚乙二醇二缩水甘油醚，37℃水浴摇床反应48小时。交联产物经SDS-PAGE电泳检测，结果显示有83kD和97kD条带生成。血红蛋白单亚基分子量约为16kD，白蛋白分子量为67kD，83kD为单个血红蛋白亚基与血清白蛋白的交联物，97kD为交联的两个血红蛋白亚基与一个血清白蛋白的偶联物。说明生成了血红蛋白与血清白蛋白的偶联物。
实施例51，6-己二醇二缩水甘油醚一步交联血红蛋白与卵清蛋白血红蛋白浓度20mg/ml，卵清蛋白浓度14mg/ml，溶液体系为pH8.7的50mM硼酸缓冲液、溶液总体系为5ml，1，6-己二醇二缩水甘油醚与血红蛋白摩尔比为100∶1，37℃水浴摇床反应6小时。交联产物经SDS-PAGE电泳检测，结果显示有61kD和77kD条带生成。血红蛋白单亚基分子量约为16kD，卵清蛋白分子量为45kD，61kD为单个血红蛋白亚基与卵清蛋白的交联物，77kD为交联的两个血红蛋白亚基与一个卵清蛋白的偶联物，说明生成了血红蛋白与卵清蛋白的偶联物。
实施例6两步交联血红蛋白与卵清蛋白血红蛋白浓度10mg/ml，溶液体系为pH7.5的50mM硼酸缓冲液、溶液总体系为5ml，乙二醇二缩水甘油醚与血红蛋白摩尔比为100∶1，37℃水浴摇床反应4小时，通过Sephadex G-25凝胶过滤除修饰剂，换缓冲液为pH9.5的50mM的硼砂-氢氧化钠缓冲液，补加另一种修饰剂1，6-己二醇二缩水甘油醚，按血红蛋白∶卵清蛋白＝1∶1加入卵清蛋白，37℃水浴摇床反应6小时。交联产物经SDS-PAGE电泳检测，结果显示有61Kd和77kD条带生成。血红蛋白单亚基分子量约为16kD，卵清蛋白分子量为45kD，61kD为单个血红蛋白亚基与卵清蛋白的交联物，77kD为交联的两个血红蛋白亚基与一个卵清蛋白的偶联物，说明生成了血红蛋白与卵清蛋白的偶联物。
实施例71，4-丁二醇二缩水甘油醚一步交联血清白蛋白与干扰素血清白蛋白浓度20mg/ml，干扰素浓度与血清白蛋白浓度比为1∶5，溶液体系为pH8.7的50mM硼酸缓冲液，溶液总体系为5ml，摩尔比为1，4-丁二醇二缩水甘油醚与血清白蛋白摩尔比为100∶1，37℃水浴摇床反应6小时。交联产物经SDS-PAGE电泳检测，结果显示有86kD条带生成。干扰素分子量为19kD，白蛋白分子量为67kD，86kD为干扰素与血清白蛋白的交联物的分子量，说明生成了血清白蛋白与干扰素的偶联物。
实施例8二甘醇二缩水甘油醚两步交联血清白蛋白与干扰素血清白蛋白浓度10mg/ml，溶液体系为pH7.5的50mMHEPES缓冲液，溶液总体系为5ml，摩尔比为二甘醇二缩水甘油醚与血清白蛋白摩尔比为100∶1，37℃水浴摇床反应4小时，通过低温透析除修饰剂，换缓冲液为pH9.5的50mM的硼砂-氢氧化钠缓冲液，按干扰素∶白蛋白＝1∶5加入干扰素，37℃水浴摇床反应16小时。交联产物经SDS-PAGE电泳检测，结果显示有86kD条带生成。干扰素分子量为19kD，白蛋白分子量为67kD，86kD为干扰素与血清白蛋白的交联物的分子量，说明生成了干扰素与血清白蛋白的偶联物。
实施例9乙二醇二缩水甘油醚一步交联血清白蛋白与集落刺激因子血清白蛋白浓度5mg/ml，集落刺激因子浓度5mg/ml，溶液体系为pH8.7的50mM硼酸缓冲液、溶液总体系为5ml，乙二醇二缩水甘油醚与血红蛋白摩尔比为100∶1，37℃水浴摇床反应6小时。集落刺激因子分子量为19kD，白蛋白分子量为67kD。交联产物经SDS-PAGE电泳检测，结果显示有86kD条带生成，说明生成了血清白蛋白与集落刺激因子的偶联物。
实施例10乙二醇二缩水甘油醚两步交联血清白蛋白与胰岛素血清白蛋白浓度10mg/ml，溶液体系为pH7.5的50mMHEPES缓冲液、溶液总体系为5ml，摩尔比为乙二醇二缩水甘油醚与血红蛋白摩尔比为100∶1，37℃水浴摇床反应4小时，通过低温透析除修饰剂，换缓冲液为pH9.5的50mM的硼砂-氢氧化钠缓冲液，按胰岛素与白蛋白的摩尔比5∶1加入胰岛素，37℃水浴摇床反应16小时。胰岛素分子量为5.7kD，白蛋白分子量为67kD，SDS-PAGE电泳检测结果显示，72KD～84kD有条带生成，说明生成了胰岛素与血清白蛋白的偶联物。
权利要求
1.本发明所使用的交联剂为末端带有环氧基团的同型双功能交联剂，将其用于交联蛋白质(多肽)。
2.权利要求1中的交联剂优选为各种二醇二缩水甘油醚，包括乙二醇二缩水甘油醚、1，4-丁二醇二缩水甘油醚、1，6-己二醇二缩水甘油醚、二甘醇二缩水甘油醚、聚乙二醇二缩水甘油醚。
3.权利要求1中的交联剂交联方法，其特征是交联剂对蛋白质(多肽)进行交联。
4.权利要求1中的蛋白质(多肽)优选为血红蛋白、血清白蛋白、卵清蛋白、干扰素、集落刺激因子、胰岛素。
5.权利要求1中的交联剂交联蛋白质(多肽)的方法，其特征是环氧基团与各种不同基团反应具有一些特殊的性质，在pH7.5-8.5之间，其主要是与巯基发生反应，在pH9以上，其主要是与氨基反应，在pH11以上，其主要是与其羟基反应。控制反应条件可控制蛋白质交联。
6.权利要求5中的反应条件是指pH6-12，优选为pH7.5-9.5的磷酸、HEPES、硼酸或碳酸钠缓冲溶液，温度为4-55℃，优选为25-37℃，蛋白质浓度为1-150mg/ml，优选为5-100mg/ml，交联剂与蛋白质的摩尔比为5∶1-600∶1，优选为25∶1-500∶1，反应时间1-48h，优选为2-24小时。
7.权利要求1中交联反应可以是一步交联反应，即直接将交联剂加入蛋白(多肽)或蛋白(多肽)混合物中进行交联；也可以是两步交联反应，即先用交联剂活化一种蛋白(多肽)，通过Sephadex G-25凝胶过滤或低温透析脱修饰剂，同时调节缓冲液pH值，使pH与第一步反应pH相同或不同，补加修饰剂或不补加修饰剂，再加入另一种蛋白(多肽)进行反应。
8.权利要求1中的交联剂与血红蛋白溶液反应生成的分子内交和聚合血红蛋白用于制备血液代用品。
9.权利要求7中的制备出的血液代用品，其特征在于将制得的蛋白交联产物溶于与生理条件近似的溶液中或将其制成冻干粉。
全文摘要
本发明提供了一种将带有环氧基团的同型双功能交联剂应用于蛋白质、多肽交联的方法。本发明所使用的交联剂对蛋白质、多肽的交联反应速度适中，可在不同条件下与蛋白质、多肽的不同基团反应，实现蛋白质、多肽的交联，可控性强。将其用于血红蛋白交联，控制条件，可使血红蛋白分子内交联，其产率高于90％；或使血红蛋白同时进行分子内交联和分子间交联，交联产率可达98％，其中血红蛋白二聚体占交联蛋白总量的80％。此交联剂也能应用于血红蛋白、血清白蛋白、卵清蛋白、干扰素、集落刺激因子、胰岛素等蛋白质、多肽自身及相互之间的交联。
文档编号C07K14/76GK1524880SQ0310500
公开日2004年9月1日 申请日期2003年2月28日 优先权日2003年2月28日
发明者苏志国, 徐宇红, 路秀玲, 郑春杨 申请人:中国科学院过程工程研究所