专利名称：：通过靶向肿瘤坏死因子受体的前配体装配域(plad)来缓解炎性关节炎的制作方法
技术领域：
：本发明提供了TNF受体(TNFR)超家族成员的胞夕卜区保守结构J^介导受体寡聚物的特异性非配体依赖性装配方面的新功能。
背景技术：
：TNFR超家族成员通常含有胞外区的1至6个富含半胱氨酸的结构域(CRD)、单个的跨膜结构域和大小可变的胞质内结构域。该受体家族的成员通常可结合到由结构、功能和序列相似性所定义的TNF细胞因子家族的配体上。这些受体以其活性配体结合态(ligandedstate)形成三聚体，且一些成员含有被称为死亡结构域的胞质结构域。根据本发明，这些受体的胞外区可通过新的自締合或同型締合功能来进一步表征，所述功能由含有至少1个富含半胱氨酸的结构域的前配体受体装配域(PLAD)所介导。更糾地说，TNFR超家絲员，包括TRAIL受体1、CD40、60kDa的TNFR和80kDa的TNFR,表现出了这种同型締合功能。包括Fas、LTPR、C謂、CD30、CD27、HVEM、RANK、0X40和DR4在内的其它的TNFR超家族成员含有该PLAD。所述PLAD是配体结合和受体功能所必需的。因此，TNFR超家族成员似乎是通过不同的预形成的复M而不是通过配体诱导的单个受体亚基的交:^传递信号的。因此，PLAD可被药物制剂把向以阻断这些预形成的复合体的形成并因此阻断受体功能。已经确定许多^L生物都进化出了对抗针对它们的免疫应答的有效策略(79)。更具体地说，一些病毒和细菌会表达用于调节或直接阻断免疫效应分子作用的细胞蛋白同源物，包括细胞因子和趋化因子(80)。已经鉴定了一些较大DM病毒的TNF受体样受体(vTNFR)的病毒同源物，所述较大DM病毒包括一些痘病毒和人巨细胞病毒。PLAD介导的vTNFR自締合或与TNF家族受体的异源締合是否存在或其^f可作用尚未得到阐明。两种主要的关节炎为类风湿性关节炎(RA)和I^l毒性关节炎(SA)。RA是一种伴随有慢性关节炎症和进行性骨破坏的常见的人自身免疫性疾病(祸。尽管尚未完全了解M的病因和发病机制，但是疾病逸艮中涉及细胞因子例如TNF-a、IL-1、IL-6和NF-kB配体的受体激活物(RANKL)(M-<W。核因子-kB(NF-kB)是这些细胞因子的关键性调节物(。TNF-a在RA的发病机制中起重M用，M抗剂例如,西普(也称为Enbrel)、TNFRII免疫球蛋白Fc融合蛋白和英夫利昔单抗(也称为Remicade)、抗TNF-ct单克隆抗体可以改善RA的临床过程(铺。SA是一种由细菌感染诱发的快速进行性和高度破坏性的关节疾病，其中TNF-oc也起到了重要作用(^)。由TNF-a(59)、脂多糖(LPS)、CpG-DM(J。、"和M^、(幼诱发的实验性关节炎小鼠模型已被用来测试新的治疗方法。这些试剂能诱发滑膜炎、血管翳形成、骨和软骨磁:坏以4人RA和SA中观察到的其它特征。根据本发明，体外和体内数据表明TNFRPLAD蛋白能够有效地抑制TNF-a以及它在实验性炎性关节炎中的作用后果。
发明内容本发明提供了一种包括TNF受体样受体的前S己体装配域(PLAD)的分离的^J^^列的多狀。本发明还提供了一种包括前配体装配域(PLAD)的分离的M,列的多肽，其中所述PLAD选自TNF-R的PLAD、p60的PLAD、p80的PLAD、Fas(CD95/APO-1)的PLAD、TRAIL受体的PLAD、LTPR的PLAD、CD40的PLAD、CD30的PLAD、CD27的PLAD、H丽的PLAD、0X40的PLAD、DR4的PLAD、NGFR的PLAD、Troy的PLAD、EDAR的PLAD、XEDAR的PLAD、DcR3的PLAD、AITR的PLAD、4-1BB的PLAD、DR3的PLAD、RANK的PLAD、TACI的PLAD、BCMA的PLAD、DR6的PLAD、OPG的PLAD、DRS的PLAD、DcRl的PLAD和DcR2的PLAD。TNF-R、p60TNFR、p80TNFR、Fas、TRAIL受体、LTPR、CD40、CD30、CD27、HVEM、0X40、DR4、NGFR、Troy、EDAR、XEDAR、DcR3、AITR、4一1BB、DR3、RANK、TACI、BCMA、DR6、0PG、DRS、DcRl和DcR2全是TNF受体超家族(在本文中也称为TNF受体样受体家刻的成员。本发明还提供了TNF受体超家族其它成员的PLAD以^U页域技术人员能够如何对它进行鉴定的方法。本发明的多肽可^J1来抑制PLAD的自締合以及TNF受体超家族成员的寡聚化。这些多肽也可^UI来抑制配体与TNF受体超家;^员的结合。本发明还提供了一种包括TNF受体寡l^应抑制剂的组合物。本发明进一步提供了缺少PLAD的TNF受体超家;^A员。图1A示出了缺少配体时的TNFR寡聚物。用DTSSP(7)交联经TNFa处理过或未经TNFa处理过的H9T细胞淋巴瘤。如图所示，在非还原(泳道1-4、9-12)性或还原(泳道5-8、13-16)性条件下，对全细胞溶胞产物进行电泳，并针对p60或p80TNFR进行印迹。括号标明了三聚体(T)和单体(M)的位置。圆圏标明了与抗-p80抗体交XSJI的非特异性蛋白。所述结果^4了三次独立的实验。图1B说明了特异性的p60TNFR自締合。用p60ACD-GFP-HA(泳道l-3)或pEGFP-Nl(泳道4-6)，并且用pcDM3(泳道1、4)或p60ACD-HA(泳道2、5)或HVEMACD-HA(泳道3、6)转染293T细胞。如图所示，用抗-GFP抗体进行免疫沉淀(GFPIP在上面的2个图中)并用抗-HA抗体(HAWB)或抗-GFP抗体(GFPWB)进行印迹。上图和中图分别示出了沉淀的p60ACD-GFP-HA(或GFP)和p60ACD-HA。下图示出了细胞溶胞产物中的p60ACD-HA和HVEMACD-HA蛋白。结果^RA了五次实验。图1C说明了特异性的p80自締^^和前配体装配域(PLAD)的定义。用图上方所示的质粒转染293T细胞。用仅识别全长p80的C末端特异性抗-p80抗体(p80IP)进行免疫沉淀(上图和中图)。溶胞产物中截短的p80或p60蛋白的表錄下图中示出。用抗-HA抗体(上图和下图)和C末端特异性抗-p80抗体(中即进行蛋白质印迹。空心圆圈^4糖基化和非糖基化形式的P80。实心圆圏表示Ig重链。图1D说明了PLAD足以满足受体自締合。用p80ACD-GFP-HA(泳道l-5)和每条泳道上方所示的质粒一^^转染293T细胞。用抗-GFP抗体进行免疫沉淀并且用抗-HA抗体进行蛋白质印迹。共沉淀的DCD蛋白以及它们在总细lfc^胞产物中的表达分别在中图和下图中示出。上图示出了沉淀的p60ACD-GFP-HA蛋白。图1E说明了PLAD是TNFoc结合所必需的。直方图示出了在用所示构建体转染过的293T细胞中转染后受体的表达(通过抗-HA染色)以及它们与TNFa的结合(25)。x-轴表示荧光强度，y-轴表示细胞数量。所示数量为与用载体转染的对照相比的阳'^^的百分数。图2A说明了置换PLAD中的残基可防止自締合。用所示质粒转染293T细胞。用抗"GFP抗,照图1中的方法进行免疫沉淀。用抗-HA抗体进行蛋白质印迹。上图和中图分别出示了沉淀的p60ACD-GFP-HA(空心圆圏)和p60ACD-HA突变蛋白(括号)。下图示出了细胞溶胞产物中p60△CD-HA突变体(括号)和HVEMACD-HA(实心圆圏)的表达。图2B说明了通过荧光共振能量转移(FRET)所证明的p60和p80TNFR的同型自締合。用所示的CFP(上图)和YFP(下图)质丰iJit转染的293T细胞的流式细胞分析的直方图。虚线表示单独用CFP转染的对照，实线表示不使用TNFa的FRET而粗线表示使用TNFa的FRET。x-轴和y-轴分别表示FRET荧光强度和细胞数量。在CFP阳性群中分析FRET,在所述CFPP曰性群中所有细胞也都是YFP阳性的。FRET被定义为由CFP所激发的YFP的荧it^射。该结果代表了四次独立的实验。图3A示出了TNFR超家族典型成员的CRD1(p60的CRD1(SEQIDNO:22)、p80的CRD1(SEQIDNO:23)、LTPR的CRD1(SEQIDNO:24)、CD40的CRD1(SEQIDNO:25)、HVEM的CRD1(SEQIDNO:26)和CD30的CRD1(SEQIDNO:27))的序列比对。该图示出了高度保守的半^t^酸位置，所述位置用于二^克键并且界定了能赋予TNFR超家M员资格的富含半皿酸的结构域。图3B说明了TNFR超家族其它成员中的受体自締合。用DR4ACD-GFP-HA(泳道1-4)或CD4△CD-GFP-HA(泳道5、6)与p80△CD-HA(泳道1、6)、p60△CD-HA(泳道2)、HVEM△CD-HA(泳道3)、DR4△CD-HA(泳道4)或CD40△CD-HA(泳道5)—^转染293T细胞。分别用抗-GFP和抗-HA抗体进行免疫沉淀和蛋白质印迹。上图示出了免疫复合体中的沉淀蛋白，下图示出了细胞溶胞产物中的DCD蛋白表达。实心圆圏表示GFP融M白，箭头表示免疫复合体中的DCD蛋白。图3C示出了通过FRET证明的DR4和CD40的特异性受体締合的流式细胞分析。按图2B中的方法使用所示的CFP(上部)和YFP(下部)质丰iJft进行转染。虚线表示单独用CFP时的本底FRET，粗线表示同时存在CFP融合蛋白和YFP融^^蛋白时的FRET。对于每个组来说，x-轴为FRET强度，y-轴为细胞JL量。图3D示出了两种基于预締合三聚体复M的TNFR信号传导模型。对于预装配链重排模型(左)，椭圆形^4CRDC^M远端向膜近端的方向将CRD编号为l-4)，斑点方才錄示月M结构域。该受体是从垂直于质膜的角度观察的。罗马数字代表三聚体复合体中的链。对于该三聚体簇模型(右)，灰色符号表示细胞表面上预装配的TNFR三聚体，带圆團的三角代束三聚的TNFot。数字1-3代表预装配三聚体复合体中的受体的三条随。该受体是按向下俯视质膜的角度》见察的。图4A示出了在没有配体结合的情况下，病原性Fas突变会导致显性干涉。野生型(WT)、Pt2(del52-96)和Pt6(A241D)Fas分子的表面表达和结^#征。左侧栏示出了通过针对每个受体蛋白N-末端存在的AU-1表位标签染色时，转染到293T细胞后24小时的表面表达。中间栏示出了用10pg/ml抗-Fas拮抗抗体AP0-1(Kamiya)染色的同样的细胞。右侧栏示出了设计用于通过修饰的亮氨酸拉链来三聚化并且用抗-亮氨酸拉链mAb(FasL染料)通过染色来显影的FasL的结合。抗体结合用藻红蛋白缀合的抗-小鼠抗体来显影。括号(bracket)表示与未转染的对照相比时，对染色呈强阳性的细胞的百分数。在每幅图中，粗线和细线分别代耒转染的和未转染的细胞制品的信号。所有的直方图都代表了以4个十进制刻度间隔(4decade)对数焚光刻度(X轴)相对细胞计数(Y轴)作图的10，000次事件。在使用Flowjo软件(Treestarsoftware)的FACScalibur流式细胞/f义上收集lt据。图4B示出了与WTFas共转染的突变体Fas分子导致的显性抑制。将10|ig所示的表达载体或单独的PCI载体电穿孔到不^t。先前所述(M的人Fas的BW细胞中，用5pgpEGFP-Nl(Clontech)标记转染了GFP的细胞。24小时后，加入所示量的抗-FasmAbAP0-1和1/20体积的可溶性蛋白A(Sigma)以使凋亡诱导最大化。通过用流式细胞术计算GFP-阳性的活细胞并计算细胞消亡来量化凋亡U力。图4C说明了Fas分子的自締合。将编码HA-标记的Fas的表达栽体与野生型(WT)Fas和EC突变体Pt2Fas(del52-96)共转染，所述HA-标记的Fas的C-末端死亡结构域4皮绿色荧光蛋白(HAFas1-210:GFP)所代替。对照细胞用WTFas和TNF受体家族成员疱渗病4^A介质(HVEM或HveA)的HA-标记的胞质截短型共转染，所g质截短型融合了GFP(HAHVEMACD:GFP)。按实施例中所述，裂解细胞溶胞产物，用抗-GFP进行免疫沉淀并且进行电泳。用抗FasC—末端的多克隆^j6l清(C20，SantaCruzbiotechnology)(抗—FasCT)探测沉淀蛋白的印迹以显示与GFP标记的蛋白共沉淀的全长Fas分子。也可以用抗-HA-HRP(RocheMolecularBiochemicals)和抗-FasC20通过蛋白质印迹(WB)检测细胞溶胞产物以测定这些蛋白的总量。空心圆圏表示免疫沉淀物种的IgG重链，实心圆圏表示WTFas，箭头表示截短的Pt2Fas蛋白。一些用抗-FasC20印迹的泳道中的上方条带表示糖基化的Fas。图5A示出了缺乏PLAD或配体结合的Fas突变体的表达和功能。利用N-末端Fas突变体的APO-1和FasL的结合。如图1A中所示(除了用抗-HA代替抗-AU1)，用C-末端截短的HA标记的TNFR2(TNFR2)对所示的HA标记的Fas突变体、R86SFas突变体和对照转染物进4亍染色以显示细胞表面每种突变体的总表达。图5B示出了Fas胞外结构域的相互作用依赖于该蛋白N-末端区域中的结构域。在泳道l-4中，用不含死亡结构域的AU-l标记的Fas1-210和所示的HA-标记的Fas突变体或对照TNF2蛋白(HATNFR2ACD)共转染293T细胞。溶胞产物用抗-AUl免疫沉淀并且用抗-HA探测以显示共沉淀的蛋白。已经证明使用了抗FasN-末端的抗体(WB抗-FasN)的对照印迹可祐月来测定溶胞产物中AU-1Fas1-210蛋白的量。该结果代表了三次独立的转染。泳道5-7示出了用与图1C中所用的同样的步骤，利用HAFasl-210:GFP进行的WTFas和FasR86S突变体的共沉淀。空心圆圏表示免疫沉淀抗体的Ig重链，实心圆圈示出免疫沉淀的Fas的位置。图5C说明了缺少自締合结构域的Fas分子无法诱导凋亡。用10ng用于所示Fas分子的表达载体转染BW5147鼠胸腺瘤细胞。用500jag/ml可溶性APO-1i秀导凋亡并按图IB中的方法进行定量。图5D示出了无配体结合的R86SFas突变体对凋亡的诱导和抑制作用。用10ing的每种Fas表达载体和5|ug的GFP质粒转染BW细胞。按图2C中的方法进行凋亡诱导和定量，除了用APO-1来诱导用空心条表示的样品中的凋亡并且向用实心条表示的样品中加入5%v/v的FasL上清。图6A示出了Fas分子间的荧光共振能量转移。点图示出了所示共转染子中CFP、YFP和FRET信号之间的关系。构建CFP和YFP融合蛋白并转染到293T细胞中，在FACSvantage细^/f义上进行分析。数字为具有FRET信号的CFP或YFP阳性细胞的百分数(右上象限)。图6B为全长和N-末端缺失的Fas受体之间FRET信号的比较。IRET信号的直方图是在对CFP荧光设门的细胞中产生的。所有的转染子的YFP荧5是相当的。粗线为共转染细胞的信号，细线为每一对中单独转染CFP构建体的信号。图6C示出了通过在单个细胞上进行YFP的显微光漂白确定的所示CFP和YFP对的FRET效率(4-7个细胞区域的5次读奶。该数字代表了每个质|树的平均E"/。和标准误。图7A说明了内源Fas受体链的预締合。将lxlO'个H9淋巴瘤细胞用交联剂DTSSP处理(Pierce,4'C下用10mM处理30分钟，然后用10mMpH8的Tris-Cl终止15分钟)和/或在所示##下用1/ig的拮抗抗体AP0-1或FasL刺激15分钟。对于抗-Fas免疫印迹，在电泳之前用N-聚糖H"F(RocheMolecularBiochemicals)处理细胞i^胞产物，并用抗-FasC末端mAbBIO(SantaCruzBiotechnology)和抗-小鼠IgGl-HRP(SouthernBiotechnology)探领'J。图7B,在用所示试剂处理后，将细胞自、免疫沉淀并按照先前所述(7i)进行FADD和半胱天冬l8印迹。用箭头标出了两种半胱天冬H"8酶原同种型(p54/52)和pll半胱天冬酶亚基蛋白酶解后半胱天冬酶-8的切割产物(p43/41)的位置。图7C示出了PARP的切割。在37。C下将(A)和(B)中所用的细胞等^#另外培养4小时并且用抗-PARPmAb(ResearchDiagnosticsInc)对细胞溶胞产物进行印迹。上方的条带为115kD全长PARP,下方条带为标志物85kD的半胱天冬酶切割片段。该结果4议了每种M下至少三次独立的实验。图8A说明了显性干涉依赖于PLAD的N-末端。对选定的来自NIH所研究家族的ALPS患者(Pt)Fas突变进行比对。符号"X"表示点突变的位置。如图，示出了通过共沉淀测试的与野生型Fas締合的能力(SA)和共转染研究中Fasi秀导的凋亡的显性抑制作用(DI)。示出了患者#1和#20的编码显性负性PLAD的序列，所述PLAD含有由突变编码的多肽。从信号肽后的第一个氨基酸开始编号。斜体字母表示由移码突变引入的额外的氨基酸。图8B示出了无PLAD时没有显性干涉。Fas^t感性JurkatT、淋巴瘤细胞用10ng所示构建体和2.5mgGFP才艮告质粒转染。转染后18小时，连续6个小时加入所示量的Apo-1并通过用膜^:蛋白V-PE(Pharmingen)染色iMt凋亡进行定量。百分itAM联蛋白V染色阳性GFP(+)细胞的百分比。这些结果代表了三次独立的转染。图9示出了用于确定p80嵌合受体或截短形式存在情况的免疫沉淀分析。用所示质粒转染293T细胞并收集细胞以便用抗-p80COOH-末端特异性抗体进行免疫共沉淀。^使用抗-HA抗体通过蛋白质印迹^^斤法^^斤免疫沉淀物以确定p80嵌合受体或截短的存在情况(上即。下图示出了全细胞溶胞产物中HA-标记蛋白的表达。图10示出了重组细菌PLAD蛋白的表达。(a)PLAD如何帮助受体三聚体装配以及配体结合反应性的模型。可溶性PLAD蛋白可以与单个的受体链締合、防止三聚受体装配并从而阻断配体-诱导的信号传导。(b)纯化的GST、P60PLAD-GST(P60)和P80PLAD-GST(P80)的^_电泳。左侧示出了分子量标记，其大小以千道尔顿为单位。(c)使用抗P60PLAD(上图)或P80PLAD(下图)的单克隆抗体(MAb)的蛋白质印迹分析。示出了P60PLAD(左图)或P80PLAD(右图)在最初的舰电泳中所使用的以iug蛋白为单位的滴定。图ll示出了PLAD蛋白在TNF-ot诱导的细胞死亡中的作用。(a)用培养基、人TNF-oc(hTNF)(2ng)、TNF-oc(2ng)+P60PLAD(P60)(40pg)处理L929细胞后，利用流式细胞术评估的细胞死亡。插图示出了相差显微照片。右下角给出了被设门的活细胞的百分数。Y轴为^ft丙啶(PI)染色，X轴为FSC(前向角散射分布)。死亡细胞^4现出增多的PI染色和减少的FSC。(b)小鼠TNF-a(mTNF)(2ng)或hTNF(2ng)以及不同剂量的PLADP60(P60)蛋白诱导的细胞消亡。(c)mTNF(2ng)或hTNF(2ng)以及不同剂量的PLADCD40(CD40)蛋白诱导的L929细胞的消亡。(d)在存在或不存在P60PLAD(P60)、P80PLAD(P80)和GST的情况下，用TNF-oc或抗-Fas处理12小时后，42.3Jurkat细胞的消亡。TNF-oc(3ng)、P60L(低;4.5pg)、P60H(高；15jig)、P80L(低;4.5|ig)、P80H(高;15pg)、GST(15pg)、抗-Fas(10ng)。(e)通ii^存在或不存在P60PLAD(IOOjug)、依那西普(25jag)、英夫利昔单抗(20ng)的情况下，用mTNF-oc(4ng)处理的底物转化的光密度(OD)来测量L929细胞中的半胱天冬l8活性。图12示出了P60和P80PLAD蛋白对关节炎的作用，所述关节H由在BALB/c小鼠的关节内注射TNF-ot以及在C3H/HeJ小鼠的关节内注射细菌CpGDM来诱发的。(a)膝关节HE染色组织切片的^4性显徵照片，示出了PBS;45ngTNF-oc;P60PLAD(IOOing)和45ngTNF-oc;P80PLAD(IOOjig)和45ngTNF-oc;CpGDNA(lnM);CpGDNA(lnM)和P60PLAD(100|ug)。箭头表示炎症的集中灶区。标记为C(软骨)、JC(关节腔)、ST(滑膜组织)、B(骨)，且该箭头指向滑膜组织的,iia层。(b、c)如图所示，单独用TNF-oc(TNF)或者用TNF-a加P60PLAD蛋白(P60)或者用TNF-a加P80PLAD蛋白(P80)处理的实验组(11=5)的滑膜炎、血管翳、骨和软骨侵蚀的定量组织分析。(d)每个实验组(11=5)的滑膜炎、血管翳、骨和软骨组织侵蚀的定量组织分析。这些分析要重复至少两次。单独的CpGDM(CpG)、CpGDNA加P60PLAD(P60)。数值为平均值土标准差(s.d.)，"为与对照组相比处理组的P<0.01。关节内接种后3天处死小鼠以便进行组织病理学检查。结果^C4了三次实验。图13示出了P60和P80PLAD蛋白对DBA/1J小鼠体内CIA的作用。盲法实验(a-f)。(a)用PBS或P60PLAD处理的CIA小鼠的足爪照片。(b)用PBS处理的初次免疫后75天或腹腔内注射P60PLAD蛋白4周(每周三次，每次100iag)的CIA关节的HE染色切片。(c)用PBS(n-13只小鼠)(方刻、P60PLAD蛋白(P60)(n=12只小鼠)(菱形)和P80PLAD蛋白(P80)(n=13只小鼠)(椭圆)处理的CIA小鼠中关节炎的严重度、足爪厚度的测量以及体重。(d)PBS、P60和P80处理组中关节炎的发病率。(e)对按所示方法处理4周的CIA关节切片中滑膜炎、血管翳、骨和软骨侵蚀的评估。(f)血清中IL-l和IL-6水平。*=与对照PBS纟M目比P<0.05。(g)舰内注射两周PBS(n=10只小鼠)(方W、P60PLAD蛋白(P60)(n=10只小鼠)(菱形)和依那西普(11=10只小鼠)(椭圆)后CIA小鼠体内关节炎的严重度。f-与对照PBS组相比P〈0.05。(h)在所建立的CIA中P60PLAD蛋白的作用。皿内注射两周PBS(n=9只小鼠)(方W、P60PLAD蛋白(P60，每隔一曰400ng)(n=10只小鼠)(菱形)后所建立的CIA小鼠的关节iU^重度。*=与对照PBS《W目比P<0.05。图14示出了关节炎关节中TNFR的表达、PLAD蛋白对TNF-oc结合的抑制以及NF-kB的活化。(a)用PBS或P60PLAD处理75天后处死的患有CIA的DBA/1J小鼠的关节炎关节中TNFRl和TNFR2的免疫组织化学。褐色表示表达TNFR的细胞。(b)在用50ng生物素化的人TNF-a(Bt-TNF-a)和不同剂量的P60PLAD蛋白预处理染色后，进行流式细胞术。曲线代表了单独的Bt-TNF-a、Bt-TNF-ct加3ygP60PLAD、Bt-TNF-a加15jigP60PLAD、Bt-，-a加30pgP60PLAD、人TNF-a或阴性对照。(c)用所示的依那西普(l|ig)、P60(1ing)或P80(1|ag)PLAD蛋白(测试蛋白)免疫沉淀(IP)的50ng人TNF-a的皿电泳。使用抗TNF-oc抗体进行的蛋白质印迹。(d)在存在(+)或不存在(-)P60PLAD蛋白的情况下，使用NF-kB(左箭头)或0CT1(右箭头)的放射性标记寡核苷酸探针，对从经TNF-ot处理的A3Jurkat细胞制得的核提取物进行的电泳迁移率变动检测。^在或不存在P60(100jig)或(100jig)PLAD蛋白的情况下，在体外用mTNF-oc(2ng)处3g^TNFRl(e)或TNFR2(f)敲除(-/-)小鼠脾脏分离的单核细胞之后，对这些细胞中的NF-KBp65核易位进行的定量分析。*=与对照组相比P<0.05;**=与对照组相比P<0.01。在每个遗传背景中P60和P80处理组之间的差异都是显著性差异(P<0.01)。图15示出了P60PLAD蛋白可抑制破骨细胞生成以及RANK和RANK配体(RANKL)的表达。(a)胶原初次免疫并用PBS或P6GPLAD蛋白处理75天后处死的DBA/1J小鼠的关节炎关节中降钓素受体的免疫组织化学的代表性显孩t照片。浅色阴影箭头标明了阳性染色(在原始彩色切片中为褐色)。(b)PLAD蛋白在体外的TNF-ct诱导的破骨细胞生成中的作用。用M-CSF和小鼠TNF-ot(10iug)、小鼠TNF-ot(10pg)力口32jagP60PLAD或PBS培养的骨髓巨噬细胞(B應)中TRAP-阳性破骨细胞的显微照片。浅色阴影箭头标明了耐酒石酸的酸性磷酸酶(TRAP)阳性》皮骨细4包。对用所示不同剂量的P60PLAD蛋白处理7^，B謹培养物的每个孔中的TRAP-阳性细胞的定量，用显孩i镜测定。(c)用胶原初次免疫然后用PBS、P60PLAD蛋白处理75天后处死的DBA/1J小鼠的关节炎关节中，RANK和RANKL染色的免疫组织化学的显孩i照片。深色(在原始彩色切片中为褐色)染色部分表示阳性染色细胞。图16示出了标准的单字母代码形式的人PLAD-GST融M白的g,列。(a)所示^EL体和下划线(M酸g230-282)为P60PLAD肽序列(SEQIDNO:59)。(b)所示粗^体和下划线CtJ^酸戎基230-274)为P80PLAD肽序列(SEQIDNO:60)。这两部分中以纯文本形式给出的是GST蛋白序列。图17示出了P60PLAD蛋白对L929细胞中TNF-oc诱导的细胞死亡的作用。用下列试剂处理了19个小时的细胞的相差显微照片(a)单独的培养基；(b)人TNF-a(2ng);(c)P60PLAD(3yg)+hTNF-oc(2ng);(d)P60PLAD(30jag)十hTNF-a(2ng);(e)英夫利昔单抗(1mg)+hTNF-ot(2ng);(f)依那西普(1jug)+hTNF-a(2ng);(g)P80PLAD(30/ag)+hTNF-a(2ng)。400倍放大;(h)在存在或不存在P60PLAD(50|ig)、依那西普(1jig)和英夫利昔单抗(1Jig)的情况下，由hTNF(2ng)诱导的L929细胞的消亡。图18示出了GST蛋白和P80PLAD蛋白对炎性关节炎的作用。(a)单独用TNF-a(45ng)(TNF)或TNF-a(45ng)加GST蛋白(GST，100|ag)处理的BALB/c小鼠实验组(11=5)中滑膜炎、血管翳以及骨和软骨组织的定量组织分析；(b)在C3H/HeJ小鼠中单独4吏用CpGDNA(lnM)(CpG)或CpGDNA(lnM)加P80PLAD蛋白(P80,100pg)。数值为平均值士标准差。在关节内接种后3天将小鼠处死以便进行组织病理学检查。结果^4了三次实验。(c)H&E染色切片的显微照片，示出了进行了为期4周的P80PLAD蛋白(100jig)的J^M内注射的初次免疫后75天的CIA关节的炎症和破坏。200倍放大。(d)用P80PLAD蛋白处理4周的DBA/1J小鼠的CIA中滑膜炎、血管翳以及骨和软骨侵蚀的定量组织分析。与对照组相比P〉0.05。图19示出了免疫组织化学的显微照片。(a)6个月时处死的TNF-oc转基因小鼠关节炎关节中的TNFR1和TNFR2。TNFR1图中的箭头标出了表明受体表达的深色染色部分(在原始彩色切片中为褐色)。TNFR2图中的箭头标明了软骨深部的软骨细胞的高TNFR2表达。(b)6个月大时处死的TNF-oc转基因小鼠的关节炎关节中的以;SJ寸照C57BL/6小鼠的使泉关节中的降4丐素受体。(c)6个月大时处死的TNF-cc转基因小鼠的关节炎关节中以;Sjt常对照C57BL/6小鼠的健康关节中的RANK和RANKL染色。深色(在原始彩色切片中为褐色)染色表示阳性组织化学反应。300倍;改大。图20示出了P60PLAD蛋白的免疫原性和半衰期。(a)基于从用胶原初次免疫然后用PBS、P60或P80PLAD蛋白处理后75天处死的DBA/1小鼠血清中纯化的PLAD蛋白，与标准曲线相比的抗-PLADP60抗体水平。GST+是指加入GST以便从血清中去除GST抗体。(b)P60PLAD蛋白的半衰期。(c)P80PLAD蛋白的半衰期。图21示出了PLAD蛋白可抑制TNF-oc诱导的IkBcc降解。蛋白质印迹示出了在存在或不存在P60(10、50、100pg)或P80(10、50、100yg)的情况下，在体外用mTNF-a(2ng)处3g^TNFR1或TNFR2敲除(-/-)小鼠脾脏分离出的单核细胞5分钟(b)、15分钟(a)或者在存在或不存在GST(lO、50、100pg)的情况下，用mTNF-a(2ng)处理这些细胞l小时(c)后，这些细胞中的IkBoc降图22示出了用不同量的斜I5西普和P60PLAD蛋白来免疫沉淀(IP)的50ng人TNF-ot的凝胶电泳。(a)所示的依那西普(10pg)或P60PLAD蛋白(100g)(测试蛋白)。(b)所示的^^西普(0.1、1、10yg)或P60PLAD蛋白(O.1、1、lOjag)(测试蛋白)。箭头标明了TNF蛋白在^MJi的位置。用抗TNF-oc抗体(Ab)进行蛋白质印迹。图23示出了TNFR1晶体结构(PDBID:1NCF)中二聚化的PLAD部分。深灰部分和浅灰部分表示PLAD二聚体的单个肽链。圆圈中标出了每个肽中His-34的镜像(mirror)咪哇环。这些^i且氨酸在链间袋中互相固定。图24示出了与,西普^/^的P80PLAD蛋白的免疫沉淀(IP)和蛋白质印迹(WB)。图25示出了P60-PLAD蛋白可抑制CIA中的MMP表达。注:左图中深色(在原始彩色切片中为褐色)染色部分表示MMP表达。图26示出了P60-PLAD蛋白可抑制CIA中的iNOS表达。注左图中深色(在原始彩色切片中为褐色)染色部分表示iNOS表达。具体实施方式参照下文中关于本发明优选实施方案和其中所含实施例的详细描述，并参照附图和关于它们的在上文和下文中的描述，可以更容易地理解本发明。根据上下文，说明书和权利要求中所用的"一，，可以表示一个(种)或多个(种)。因此，例如，提及"一种核酸"时是指使用了至少一种核酸。多肽本发明提供了一种包括前配体装配域(PLAD)的分离的氨基酸序列的多肽。本发明还提供了一种由前配体装配域的M酸序列组成的多肽。本发明的PLAD可以是TNF-R的PLAD、p60的PLAD、p80的PLAD、Fas(CD95/APO-l)的PLAD、TRAIL的PLAD、LTPR的PLAD、CD40的PLAD、CD30的PLAD、CD27的PLAD、HVEM的PLAD、0X40的PLAD、DR4的PLAD或TNFR超家族成员的任何其它PLAD结构域。由于PLAD结构域在TNFR超家族成员中是高度保守的，守基序来鉴定任何TNF受体的PLAD结构域。TNF受体样受体中这些区域的鉴定是.通#文4^供的示例性PLAD序列以^J阵它们与该家族其它成员公开序列进行比较来以常规手段完成的(例如，参见图3)。此外，本领域技术人员也应该能够通过进行功能测定(例如实施例中所提供的功能测幻来鉴定PLAD。在一个实施方案中，所述功能性PLAD不是Fas/CD59的PLAD(83)。在另一个实施方案中，所述功能性PLAD不是Fas/CD59受(^末端的49个氨基酸(83)。本文所提供的PLAD可以仅包括成熟的TNF受体样受体N-末端的38个氨基酸。成熟的TNF受体样受体是不含信号序列的TNF受体样受体。序列表中公开了PLAD的实例，该序列表包括含有其信号序列的頂F受>^#受体实例的M酸序列。参照表1中列出的这些TNF受^#受体的GenBank射己号可以找到各个受体的信号序列残基。因此，所给的序列中公开了成熟TNF受体样受体及其对应PLAD的序列。表3提供了关于本文所公开的TNF受体样受体和受体配体的附加信息。它还提供了关于分离的PLAD以及含有本文所公开的分离的PLAD的多肽的用途的信息。所述PLAD可^JI来研究干扰TNFR超家族受体介导的信号传导途径的意义。例如，如果经由TNFR超家族受体的信号传导是已知的或被证明与疾病途径相关，则通过本发明的多肽抑制受体的前g己体装配可以治疗获预防该疾病。例如，可净皮治疗的疾病包括癌症、心脏病和炎性疾病。PLAD的修飾也会改变配体/受体相互作用的亲和力，这可被用于体夕卜研究，例如测量配体和受体的结合、受体信号等。荧光标记的PLAD蛋白也可净皮用作通过流式细胞术或荧光显孩沐来确定细胞表面上特异性TNFR相对表达时的试剂。4^发明还4^供了^、有分离的PLAD的38至125个氨基酸的多肽。例如，所述肽可以是含有分离的PLAD的50至125个氨基酸的多肽。在一个进一步的实例中，所述多肽可以包括子序列R广TNF受僻^羊受体PLAD-R2,其中R!和R2是任选的，当存在时它们可以是H、絲、NH2、絲酸或肽。当存在时，&和/或R2可以是^f可M酸。当Ri和/或R2;Ui时，该肽的长^l:可变的。例如，Ri和/或R2的长度可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个絲酸，只要含有分离的TNF样PLAD的整个肽不超过125个M酸g，而且其长度可以是38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124或125个絲酸。R1和R2也可以是TNF受伟样受体的序列，所*列一^位于天然存在的TNF受>(^#受体中TNF受体样受体PLAD的侧面，其中所述含有TNF样受体PLAD的多肽并不是TNF受体样受体的整个胞外结构域。本发明进一步提供了任何大小的多肽，包括TNF受体样受体的前配体装配域(PLAD)的分离的氨基酸序列，其中所述多肽为Rl-TNF受体样受体PLAD-R2,其中Rl或R2包括不位于天然存在的TNF受体样受体中TNF受体样受体PLAD侧面的tt酸序列。Rl或R2(但并非两者同时)可以是TNF受体样受体的全部或部分序列，所述序列通常位于天然存在的TNF受*受体中TNF样PLAD的侧面。例如，PLAD可以来自TNF受体样受体且R1或R2可以是不存在于所述TNF受体样受体中或任何其它TNF受体样受体中的M酸序列，所述多肽的TNF样PLAD来自于所述TNF受体样受体。Rl或R2可以是任何的氨基酸序列，只要R1-TNF样PLAD-R2不^然存在的全长TNF受体样受体。在另一个实例中，PLAD可以来自TNF受体样受体且Rl或R2或两者，如果存在的话，可以是来自另一个TNF受^#受体的^列。因此，本领域技术人员可以将一个TNF受^#受体的PLAD与来自一个不同的TNF受体冲羊受体的Rl或R2序列结*来以获得这种多肽。由于已知的TNF受4^羊受体的序列是可公开获得的，所以本发明的多肽的Rl和R2的结构4艮多，但也是已知的并被本文所考虑。或者，Rl或R2可以是不与任何TNF受^f羊受体序列相关的^列。在一个实施方案中，所述含有分离的PLAD的多肽不是美国专利5，633，145(Feldmanetal.)中所v^开的成熟(不含信号序列)TNF1受体的124个虔基酸的序列。^^有上述子序列的多肽的实例包括R厂成熟p60的第1-38、1-39、1-40、1—41、1-42、1—43、1-44、1-45、1—46、1-47、1-48、1-49、1—50、1—51、1-52、1-53或1-54位M酸-R2(例如SEQIDNO:1);R广成熟p80的第10-48、10-49、10-50、10-51、10-52、10-53或10-54位#^酸-112(SEQIDNO:2);R「成熟Fas的第1-38、1-39、1-40、1-41、1-42或1-43位絲酸-112(SEQIDNO:3);R厂成熟Fas的第1—38、1—39、1-40、1—41、1-42、1-43、1-44、1-45、1-46、1-47、1-48、1-49、1-50、1-51、1-52、1-53、1-54、1-55、1-56、1-57、1-58、1-59、1-60、1-61、1-62、1-63、1-64、1-65或1-66位絲酸-R2(SEQIDNO:4);R广成熟LtpR的第13-50位絲酸-R2(SEQIDNO:5);R厂成熟CD40的第6-39位絲酸-R2(SEQIDNO:6);R厂成熟CD30的第11-49、11-50或11-51位絲酸-&(SEQIDNO:7);R厂成熟CD27的第7-42位氨基酸-R2(SEQIDNO:8)，R广成熟HVEM的第6-37位絲酸-FUSEQIDNO:9);R广成熟0X40的第3-36位絲酸-R2(SEQIDNO:10)以及R厂成熟DR4的第109-138位M酸-FUSEQIDNO:11)。成熟p60(TNFR1)多a始于祐耒示为SEQIDNO:12的全长p60编码序列的第30位。因此，本发明提供了一种含有成熟p60蛋白的第l-M位氨基酸的多肽(SEQIDNO:12的30-83位絲酌、一种含有成熟p60蛋白的第1-53位氨基酸的多肽(SEQIDNO:12的第30-82位M酌、一种含有成熟p60蛋白的1-52位氨基酸的多肽(SEQIDNO:12的第30-81位M酌、一种含有成熟p60蛋白的第1-51位M酸的多肽(SEQIDN0:12的第30-80位M酌、一种含有成熟p60蛋白的第l-50位氨基酸的多肽(SEQIDNO:12的第30-79位婁l船、一种含有成熟p60蛋白的第l-49位氨基酸的多肽(SEQIDNO:12的第30-78位#^酌、一种含有成熟p60蛋白的第l-48位M酸的多肽(SEQIDNO:12的第30-77位J^酌、一种含有成熟p60蛋白的第1-47位#^酸的多肽(SEQIDNO:12的第30-76位絲紛、一种含有成熟p60蛋白的第1-46位氨基酸的多肽(SEQIDNO:12的第30-75位絲酌、一种含有成熟p60蛋白的第1-45位M酸的多肽(SEQIDNO:12的第30-74位M酌、一种含有成熟p60蛋白的第l-44位氨基酸的多肽(SEQIDN0:12的第30-73位M酌、一种含有成熟p60蛋白的第1-43位M酸的多肽(SEQIDNO:12的第30-72位tt酌、一种含有成熟p60蛋白的第l-42位絲酸的多肽(SEQIDNO:12的第30-71位M酌、一种含有成熟p60蛋白的第1-41位M酸的多肽(SEQIDNO:12的第30-70位M酌、一种含有成熟p60蛋白的第1-40位氨基酸的多肽(SEQIDNO:12的第30-69位M紛、一种含有成熟p60蛋白的第1-39位萄基酸的多肽(SEQIDNO:12的第30-68位M酌以及其它含有成熟p60蛋白的保持了PLAD活性的第l-54位氨基酸片段的多肽。成熟p80(TNFR2)多A^始于被表示为SEQIDNO:13的全长p80编码序列的第23位。因此，本发明提供了一种含有成熟p80蛋白的第10-54位M酸的多肽(SEQIDNO:13的第32-76位M酌、一种含有成熟p80蛋白的第10-53位氨基酸的多肽(SEQIDNO:13的第32-75位M酌、一种含有成熟p80蛋白的第10-52位絲酸的多肽(SEQIDNO:13的第32-74位絲酌、一种含有成熟p80蛋白的第10-51位絲酸的多肽(SEQIDN0:13的第32-73位M酌、一种含有成熟p80蛋白的第10-50位M酸的多肽(SEQIDNO:13的第32-72位M酌以及其它含有成熟p80蛋白的保持了PLAD活性的第10-54位M酸片段的多肽。成熟Fas受体多^始于被表示为SEQIDNO:14的全长Fas编码序列的第17位。因此，本发明提供了一种含有成熟Fas蛋白的第位#^酸的多肽(SEQIDNO:14的第17-59位絲酌、一种含有成熟Fas蛋白的第1-42位氨基酸的多肽(SEQIDNO:14的第17-58位#^酌、一种含有成熟Fas蛋白的1-41位氨基酸的多肽(SEQIDNO:14的第17-57位M紛、一种含有成熟Fas蛋白的第1-40位絲酸的多肽(SEQIDNO:14的第17-56位M酌、一种含有成熟Fas蛋白的第1-39位g酸的多肽(SEQIDNO:14的第17-55位M酌以及其它含有成熟Fas蛋白的保持了PLAD活性的第1-43位氨基酸片段的多狀。本发明还提供了一种含有成熟Fas蛋白的第l-66位M酸的多肽(SEQIDNO:14的第17-82位^J^酌、一种含有成熟Fas蛋白的第1-65位M酸的多肽(SEQIDNO:14的第17-81位絲船、一种含有成熟Fas蛋白的第1-64位^J-酸的多肽(SEQIDNO:14的第17-80位絲酌、一种含有成熟Fas蛋白的第1-63位氨基酸的多肽(SEQIDNO:14的第17-79位M酌、一种含有成熟Fas蛋白的第1-62位氨基酸的多肽(SEQIDNO:14的第17-78位M酌以及其它含有成熟Fas蛋白的保持了PLAD活性的第1-66位氨基酸片段的多肽。本发明还提供了一种含有^L4示为SEQIDNO:15的全长LTPR蛋白的第43-80位M酸的多肽以及其它含有SEQIDNO:15的保持了PLAD活性的第43-80位M酸片段的多肽。本发明还提供了一种含有^^示为SEQIDNO:16的全长CD40蛋白的26-59位M酸的多肽以及其它含有SEQIDNO:16的保特了PLAD活性的第26-59位J^酸片段的多肽。成熟CD30多Jlk^始于被表示为SEQIDNO:17的全长CD30编码序列的第19位。因此，本发明提供了一种含有成熟CD30蛋白的第11-51位氨基酸的多肽(SEQIDNO:17的29-69位M酌、一种含有成熟CD30蛋白的第11-50位M酸的多肽(SEQIDNO:17的29-68位^J^酌、一种含有成熟CD30蛋白的第11-49位氨基酸的多肽(SEQIDNO:17的第29-67位M酌、一种含有成熟CD30蛋白的第11-48位M酸的多肽(SEQIDNO:17的第29-66位M酌、一种含有成熟CD30蛋白的11-47位M酸的多肽(SEQIDNO:17的第29-65位M酌以及其它含有成熟CD30蛋白的保持了PLAD活性的第11-51位M酸片段的多肽。本发明还提供了一种含有^il4示为SEQIDNO:18的全长CD27蛋白的第27-62位M酸的多肽以及其它含有SEQIDNO:18的保持了PLAD活性的第27-62位M酸片段的多肽。本发明还提供了一种含有被表示为SEQIDNO:19的全长HVEM蛋白的第42-75位氨基酸的多肽以及其它包含含有SEQIDNO:19的保持了PLAD活性的42-75位M酸的多肽片段的多肽。成熟0X40多J!^始于祐耒示为SEQIDNO:20的全长0X40编码序列的第29位。因此，本发明提供了一种含有成熟0X40蛋白的第3-36位M酸的多肽(SEQIDNO:20的第31-64位M酌、一种含有成熟0X40蛋白的3-35位絲酸的多肽(SEQIDNO:20的第31-63位絲酌、一种含有成熟0X40蛋白的3-34位氨基酸的多肽(SEQIDNO:20的第31-62位M劇、一种含有成熟0X40蛋白的3-33位g酸的多肽(SEQIDNO:20的第31-61位M酌、一种含有成熟CD30蛋白的第3-32位氨基酸的多肽(SEQIDNO:20的第31-60位以及其它包含含有成熟0X40蛋白的保持了PLAD活性的第3-36位氨基酸的多肽片段的多肽。本发明还提供了一种含有^L4示为SEQIDNO:21的全长DR4蛋白的第132-170位氨基酸的多肽以;^其它包含^^有SEQIDNO:21的保持了PLAD活性的第132-170位M酸的多肽片段的多肽。表1列举了含有本发明的PLAD的TNF受体样受体的实例。根据表1中列出GenBank躬己号可以找到这些受体的核苷酸和多M列。根据表1中列出GenBank躬己号所示出的核苦酸序列、多肽序列以及^f^f可信息(例如信号序列和成熟蛋白歹MJ^O的全部内容通过引用的方式纳入本说明书。例如，根据GenBank躬己号M75866可以找到p60的核苦酸序列、多肽序列和附加信息(例如信号序列和成熟蛋白残基奶。根据GenBank躬己号M75866所示的这些p60序列和附加信息的全部内容通过引用的方式纳入本说明书。类似地，根据GenBank&己号M32315可以找到4十对p80所示出的核苷酸序列、多肽序列和附加信息(例如信号序列和成熟蛋白残基奶。根据GenBank射己号M32315所示出的这些p80序列和附加信息全部通过引用的方式纳^^说明书。通过访问表l中列出的GenBank躬己号，本领域技术人员可以访问到其中列出的附加GenBank躬己号以获得与信号序列和成熟蛋白序列相关的附加信息。例如，当访问GenBank射己号M75866时，本领域技术人员可以访问到表示p60的信号序列和成熟蛋白序列信息的GenBank射己号AAA61201。该信息也可通过直^访问GenBank射己号AAA51201(p60)、GenBank躬己号AAA59929(p80)、GenBank射己号AAA63174(Fas)、GenBank射己号AAA36757(LTBR)、GenBank射己号CAA43045(CD40)、GenBank射己号AAA51947(CD30)、GenBank躬己号AAA58411(CD27)、GenBank射己号AAB58354、GenBank躬己号CAA53576(0X40)、GenBank躬己号AAC51226(DR4)找到，该信息通过引用的方式纳入本说明书。表1还提供了TNF样受体的LocusLink射己号。现在LocusLink射己号等同于在美国国立医学图书馆的美国国家生物^支术信息中心可以访问到的EntrezGene识别号(GeneID号)。例如，本领J^^支术人员可以通过访问EntrezGene数据库中的LocusLink号7132(3脉为EntrezGene中的GeneID7132)获得关于p60的附加信息，包括核苷酸和蛋白序列。类似地，本领域技术人员可以通过访问EntrezGene数据库中的LocusLink号7133(现在为EntrezGene中的GeneID7133)获得关于p80的附加信息，包括核苦酸和蛋白序列。因此，本领域技术人员通过访问表l中所列的4^f可TNF样受体在EntrezGene中的相应LocusLink(GeneID)号可以#^1易地获得与它们相关的信息。所有根据表l中列出的LocusLink(GeneID)号提供的信息的4^P内絲过引用的方式纳入^^i兌明书。提供了含有vTNFR蛋白PLAD结构域的分离的J^^列的多肽(SEQIDNO:28-39)。可以4吏用蛋白-蛋白BLAST数据库的用于TNFR1和TNFR2PLAD序列的同源搜索来鉴定其它vTNFRPLAD。也包括每种vTNFR及其修饰蛋白的全长絲蔣列(SEQIDNO:44—55)。还提供了可被本领域技术人员用iMt其他vTNFRPLAD多肽进行鉴定、生产和功能测试的方法等。vTNFRPLAD结构域可以中断宿主TNFR的自締合和/或随后的配体结合以抑制抗病毒免疫和/或保护感染的细胞免遭TNF介导的细胞死亡。M-T2蛋白---种由粘液瘤病毒编码的TNF受>^#蛋白一一可以保护粘液瘤感染的T细胞免遭TNF诱导的死亡并且不^其胞外TNF结合能力(82)。由于针对与宿主TNFRPLAD结构域结合的较高亲和力的进化选择，vTNFRPLAD序列可以用作比P60或P80PLAD本身更有效的TNF诱导作用抑制剂。在这点上，分离的病毒PLAD蛋白代表了用于阻断与类风湿性关节炎和其他自身免疫性疾病相关的TNF-相关发病的临床应用的改良试剂。应该理解的是，例如本文所述的这些技术，可被用于鉴定其它的微生物蛋白，所述蛋白与本文所述其它TNF受体样受体(例如Fas)中存在的PLAD结构域具有同源性。例如公开了含有与所述FasPLAD结构域(SEQIDNO.41-43，56-58)同源的序列的微:生物多肽的三个实例。本文所用的"PLAD的分离的M齡列"是指M上不含在自然界中通常与所述M酸序列相关的天然存在的物质的序列。本发明的多肽可以包括具有PLAD活性的PLAD结构域或其片段的整个M酸序列。本发明的多M其片段可通it^细胞中分离和纯化所述多肽来获得，其中这些多肽可天然产生或通it4iii^码PLAD的外源核g产生。PLAD的片段可以通过肽的化学合成、通过PLAD或含有PLAD的多肽的蛋白水解切割以及通过用编码目的部分的核酸合成来获得。所述PLAD可以包括保守性置换，其中天然存在的氨基酸被具有类似性质的氨基酸所置换。这类保守性置换不会改变该多肽的功能。通过产生各种氨基酸置换并iL4说明书中所述的结合测定中使用本领域普通技术人员可利用的技术对它们进行测试可以找到能增强结合和有效性的突变。因此，应该理解的是，如果需要，可以在编码本发明多肽的核酸和/或本发明多肽的^J^酸序列中进行修饰和改变并且仍获得具有类似的或所需的特征的多肽。这类改变可以存在于天然分离物中或者可以利用定点突变来通过合成手段引入，其方法(如错配聚合絲iUJl(PCR))在本领域中是已知的。例如，多肽中的某些M酸可以净皮其它氨基酸置换，同时没有明显的功能活性损失。因此，应该考虑到可以在所述PLAD的JIJ^酸序列(或其基础核酸序列)中制造各种改变，同时没有明显的生物效用或活性损失并且这些效用或活性还可能增加。例如，p60TNFR天然序列中的Q24A突变、D49R突变和K19E突变不^有损PLAD的自締合。这些多肽也可以用本领域熟知的许多方法中的任何方法来获得。一种产生多肽的方法是利用蛋白质化学技术来将两种肽或多M接起来。例如，可以通过Fmoc(9-芴曱氧mO或Boc(叔丁氧J^O化学，利用现在可获得的实验室4义器来化学合成肽或多肽(AppliedBiosystems，Inc.,FosterCity,CA)。本领域技术人员可以#^易地认识到可以通过标准的化学^来合^目当于特定蛋白的肽或多肽。例如，可以一种合成肽或多肽并且不将它从其合成树脂上切下来，同时可以合成一种杂合肽的另一片段并I^将它从所述树脂上切下来，从而暴露出该另一个片段上被功能性封闭的末端基团。利用肽缩合反应，可以分别通itit些两片段的g和M末端的肽键将它们共价连4!"起来形成较大的多肽(Grant,ASyntheticP印tides:AUserGuide,W.H.FreemanandCo.，N.Y.(1992)和BodanskyandTrost,Ed"PrinciplesofPeptideSynthesis,Springer-VerlagInc.,N.Y.(1993))。或者，如上所述，可以在体内独立地合成所述肽或多肽。一旦分离，则可以通过类似的肽缩^^M将这些独立的肽或多肽连^^形成较大的蛋白。例如，克隆的或合成的肽区段的SI^连接可使得能够将相对短的肽片段连接起来以产生较大的肽片段、多肽或全蛋白结构域C^w/z^e/7Wa/.Biochemistry,30:4151(1991))。或者，可以利用合成肽的天然化学连接来通过合成方法由较短的肽片段构建较大的肽或多肽。该方法由两步化学Jl^组成(/feH^0/7e/"a/.ASynthesisofProteinsbyNativeChemicalLigation,Science,266:776-779(1994))。第一步是无保护的合成肽-%-疏酯与另一种含#^末端Cys残基的无保护肽区段进行化学选择反应以产生作为初始共价产物的硫酯连接性中间产物。在不改变反应条件的情况下，该中间产物经历了自发的快速分子内反应从而在连接位置形成天然肽键。这种天然化学连接方法在蛋白分子全合成过程中的应用可通it^白细胞介素8(IL-8)的制备来i兌明(67a,i-Zew7ia/.FEBSLett.，307:97(1987)，6VarHew^y"a/,J.Biol.Chem.，269:16075(1994)，C/ayir-Zew^ya/.Biochemistry,30:3128(1991),和ia力ra^/a迈Wa/.Biochemistry,29:1689(1994))。或者，无保护的肽区段可以是化学连接的，其中由于化学连接而在所述肽区段之间形成的键是非天然键(非肽键)CSt力加/zera/.Science,256:221(1992))。这种技术已经被用来合成蛋白结构域的类似物以及大量具有完全生物活性的相对较纯的蛋白(f/eZ/Wea/.ATechniquesinProteinChemistryIV，AcademicPress,NewYork,pp.257-267(1992))。本发明还提供了用于所公开多肽的g拟物。"g拟物"被定义为包括化合物或有机分子或任何其它肽才莫拟物，其结构是基于或书f生自蛋白的结合区域。例如，人们可以建立预测化学结构的模型以模拟结合区域(如PLAD)的结构，。可以使用标准方法来进行这种建模。或者，也可以以和所述肽大致相同的方式来从组合化学文库中选择肽模拟物(Ostresh，J.M.a丄，Jcad5t/做j1994Nov8;91(23):11138-42;Dorner,B.a/.，A/oow#ecTC力e迈1996May;4(5):709—15;Eichler，J."a人，1995Nov;15(6):481-96;Blondelle，S.E."a厶5/oc力柳/1996Jan1;313(Pt1):141—7;Perez—Paya，E.a/.,/A/o/C力e迈1996Feb23;271(8):4120-6)。也可以利用功能测定iM^择Ab^拟物。本发明的多肽可与另一部分例如核酸、蛋白、肽、配体、糖部分、病毒蛋白、单克隆抗体、多克隆抗体或脂质体相连接。此外，也可以将两个或多个含PLAD的多肽彼jtbf目连接。例如，可以制名^^有两个或多个不同PLAD的双功能或多功能多肽以使得所述多肽能够调节多种TNF受>^#受体的活性。所述多肽也可以含有两个或多个源自相同TNF受^#受体的PLAD以增加这种多M"特定TNF受^#受体的亲合力。含PLAD的融^^构j^体本文公开了含PLAD的融合蛋白和编码它们的核酸。所述融合蛋白可以包括本文所公开的连接了融合标签的TNF受体样受体PLAD。所述功能分子可以是抗体或其靶向部分或其它融合标签。由于PLAD是在细I^面上的，所以所组成部分。例如，非TNF受^^羊标志物的配体的标志物结^P分可以与PLAD融合，所述标志物位于指定的靶细胞的表面。所述PLAD可以与各种载体蛋白例如免疫球蛋白或其它血清、可溶的和/或稳定的蛋白融合。所述融合标签可以是GST或其它有助于所述融^白纯化的分子。含PLAD的融^白可以包括有助于重组表达的PLAD分泌的信号序列。也可以将编码包括PLAD或由PLAD组成的多肽的核酸与其它核酸功能性地连接以编码免疫粘合素。对本发明来i兌，术语"免疫粘合素"被定义为包括任何由核酸编码的多肽，其中编码非免疫球蛋白分子(例如PLAD)的核酸的至少一部分与编码免疫球蛋白重链多肽(例如IgG)的核酸的至少"-^分偶联。IgG2、IgG3、IgM、IgA、IgE的Fc区也可^UUiM^^疫津t^素。在一个具体的实例中，所述融合蛋白包括与IgFc区部分一一特别是IgY4的Fc区部分一一融合的PLAD,。所述偶联是通过一种确保所述核酸片段能进行功能性转录⑩译并提供从其中分别获得的信息的方式来实现的。可以通#各种哺乳动物宿主细胞以及杆状病毒感染的细胞中的瞬时或稳定转染来表达PLAD多肽融合蛋白。所表达的融M白可以根据标准方法来纯化。与抗体类似，IgG免疫粘合素可以通过一步蛋白A或蛋白G亲和色语从被分泌了该免疫津給素的培养基中纯化出来。转基因提供了编码PLAD的转基因。"转基因，，是指被^MlA为地插入到细胞中并成为该细胞及其子代细胞基因组的一部分的核酸序列。对于所述细胞来说，该转基因可以是(但不一定;U部分或完全异源的(例如，来自不同的物种)。术语"转基因"宽^J也指被导入到动物基因组中的^f可核酸，包括但不限于含有通常可能不存在于所述基因组中的序列的基因或DNA、在给定基因组中存在但通常不会被转录和翻译(表达)的基因或者人们希望导入到所述基因组中的4封可其它基因或DNA。这可包括可能通常存在于非转基因基因組中但是人们希望改变其表达或者是人们希望以改变或变体形式导入的基因。转基因可以包括一种或多种转录调控序列和可能是所选定的核酸的最佳表达所需的任何其它核酸，例如内含子。转基因可以只有两个核苷酸长，但是优选地至少约50、100、150、200、250、300、350、400或500个核苷酸长或甚至更长。转基因可以是编码或非编码序列或者其组合。转基因通常包括能够在适当M下促使一种或多种转基因表达的调控元件。抗体本发明还提供了与TNF受体样受体的PLAD特异性结合的抗体。例如，本发明的抗体可以是与TNF受体的PLAD特异性结合的抗体、与FAS的PLAD特异性结合的抗体或与DR4的PLAD特异性结合的抗体，仅举这些为例。所述抗体(多克隆或单克隆)可以是指本文所提供的何所考虑到的任何多肽，天然存在的和重组的多M其免疫源片段。所述抗体可净皮用于例如诊断、治疗或疫苗接种等技术或方法中。也考虑到了抗-个体基因型抗体和亲和力成熟抗体。可以通过许多熟知的方法来制备抗体(例如，参见a/w/Za/e，"Antibodies;ALaboratoryManual"ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NewYork,(1988))。简言之，以足以引出免M答的量和间隔将纯化的抗原注射到动物体内。抗体可以是直接纯化的或者脾细胞可以是从动物体内获得的。然后可以将所述细胞与无限增殖细胞系融合并且筛选抗体分泌。所述抗体可用来筛选可分泌该抗原的细胞的核酸克隆文库。然后对这些阳性克隆进行测序(例如，参见Kellyeta/.A/0/rec力/70/0^7，10:163—167(1992);&^//7^0/7Wa人Ar'o/7fec力加/^7，10:169—175(1992))。本发明也考虑了人源化抗体和嵌合抗体。可以通过熟知的方法来制备异源抗体(例如，参见美国专利5545806、5569825、5625126、5633425、5661016、5770429、5789650和5814318)。术语与多肽"特异性结合"是指可确定在一群异源蛋白和其他生物制品中是否存在所述蛋白的一种结合反应。因此，在指定的免疫测定条件下，与特定蛋白结合的特定抗体不与样品中的其它蛋白以显著量结合。在这类M下，与抗体的选择性结合可能会需要根据它对特定蛋白的特异性而被选出的抗体。可以使用各种免疫测定形式来选择会与特定蛋白选择性结合的抗体。例如，通常使用固相ELISA免疫测定法^择可选择性地与蛋白进行免^L^应的抗体。关于可被用来确定选择性结合的免疫测定形式和条件的描述请参见泡r/owa/"a/e"Antibodies,ALaboratoryManual"ColdSpringHarborPublications,NewYork,(1988)。核酸本发明还提供了编码最长达125个氨基酸的多肽的核酸，所述多肽含有TNF受体样受体的PLAD;以及提供了编码由TNF受体样受体PLAD组成的多肽的核酸。本发明还提供了编码最长达125个氨基酸的多肽的核酸，所述多肽含有分离的PLAD,其中所述多肽含有子序列R广PLAD-R2，其中H和&是^^的，并且当存在时，它们可以是H、、NH2、^J^酸和肽。本发明进一步提供了编码这样一种多肽的核酸，所述多肽含有TNF受体样受体的前配体装配域(PLAD)的分离的M酸序列，其中所述多肽为R广TNF受体样受体PLAD-R2，其中R!或R2包括不位于天然存在的TNF受体样受体中TNF受体样受体PLAD侧面的M酸序列。本文所用术语"核酸"是指可以是DNA或RNA或其4^f可组合的单链或多链分子，包括对这些核酸的修饰。所述核酸可以代表编码链或其互4喊或其任何组合。核酸的序列可以与本文所讨论的任何新基因的天然存在序列相同或者可以包括编码与天然存在序列中发现的M酸一样的氨基酸的备选密码子。也可以对这些核酸的典型结构进行修饰。这些修饰包括但不限于曱基化核酸、将磷酸残基上的未桥接氧用硫(产生硫代磷自氧核苷酌、硒(产生硒代磷酸(phosphorselenoate)脱氧核苷酌或曱基基团(产生曱基膦皿氧核可以从通常存在编码PLAD的核酸分子的生物体中将其分离。例如，可以构建基因组DM或cDNA文库并筛选目的核M否存在。构建和筛选这类M的方法是本领域中已知的，用于进行所述构建和筛选步骤的试剂盒是市售的(，'H口，StratageneCloningSystems,LaJolla，CA)。一旦分离，就可以将所述核酸直接克隆到适当的载体中，或者如果需要的话，可以对其进行修饰以帮助后续的克隆步骤。这些修饰步骤是常规的，一个实例是在所述核酸末端加入含有限制性位点的寡核苷酸接头。i^迈6/w^efa/.,"MolecularCloning,aLaboratoryManual,"ColdSpringHarborLaboratoryPress(1989)中阐述了-"^:的方法。本发明也考虑了编码PLAD的不含配体结合位点的核酸。一^SJ^得了所需的PLAD的核酸序列，就可以利用本领域中已知的技^任何具体的tt酸位置对编码特定氨基酸的序列进行修饰或改变。例如，可以设计跨越所述一个或多个g酸位置的以>^任何#^酸可#:另一种氨基酸置换的PCR引物。然后可以扩增核酸并将其插入到野生型PLAD编码序列中以获得在所述PLAD的任何位置上的氨基酸的许多可能组合的任一种。或者，本领域技术人员可以通过点突变技术在特定核酸序列中的任何位点引入特定的突变。5fe"力，M"Invitromutagenesis"Ann.Rev.Gen.，19:423-462(1985)和ZoZ/er,i/."Newmolecularbiologymethodsforproteinengineering"Curr.Opin.Struct.Biol.，1:605-610(1991)中阐述了一般的方法。这些技术可^^1来改变编码序列而不改变所编码的M酸序列。一种获得编码PLAD的DNA分子的方法的另一个实例是^^成编码所述PLAD的重组DNA分子。例如，寡肽合成方法在是本领域中常规的，用于编码特定蛋白区域的寡核苷^UL^易通过自动DNA合成来获得的。可以合成双链分子一条涟的核酸并且使其与它的互^喊杂交。Ail']可以i殳计这些寡核苷酸^吏得所得的双链分子具有内部P艮制性位点或在末端含有适当的5，或3，突出端以克隆到适当的载体内。通过下述方法可以#^易地合成编码相对较大的蛋白的双链分子首先构建几种不同的编码所述蛋白特定区域的双链分子，之后将这些廳^"连接在-"^。例如，C画/./^A2迈，e"丄，"Rec印torandAntibodyEpitopesinHumanGrowthHormoneIdentifiedbyHomolog-ScanningMutagenesis,"Science,243:1330-1336(1989)已经通过首先构建重叠和互补的合成寡核苷酸并将这些片段连接起^而构建了编码人生长激素基因的合^&因。也可参见ferre"/，a/.，Proc.Nat.Acad.Sci.82:599—603(1986)，其中/^开了用合成的寡核苷^L合成1057个絲对的合成的牛视紫红质基因。通过以这种方式构建PLAD,本领域技术人员可以;f膝易地获;^f壬何特定的PLAD，所述PLAD在PLAD内的任何一个或多个特定位置上具有所需氨基酸。也参见美国专利5，503,995,所述专利描述了一种制*成基因的酶模;^1>^应方法。这类技术在本领域中是常规的并且是有详尽记录的。然后可以按照下文所^体内或体外表iiii些核酸或编码PLAD的核酸片段。本发明还提供了编码PLAD的分离的核酸，所述核酸位于适合于表达它的载体中。一旦对编码特定的目的PLAD的核酸或该核酸的一个区域进行构建、修饰或分离后，就可以将该核^隆到适当的载体中，所述载体可以指导该野生型和/或修饰后PLAD的体内或体外合成。考虑到了所述载体应具有指导和调控插入基因或核酸转录所需的功能元件。这些功能元件包括但不限于启动子、所述启动子的上下游区域例如可能会调控所述启动子转录活性的增强子、复制起点、有助于所述启动子附近的插入片段克隆的适当的限制性位点、抗生素抗性基因或能用来筛选含有所述载体或所述的含插入片段的载体的细胞的其它标记、RNA剪接点、转录终止区或者能用来帮助所述插入基因或杂合基因表达的4^f可其它区(通常参见i^6rooi:efa人)。丑co7/(;tM埃希氏菌Cfoc力er/c力/aco/i))表达载体。其它适^H^吏用的微生物宿主包括杆菌例如枯草杆菌(勘c///^，以及其它肠杆菌(勘c///〃》例如沙门氏菌C^/MMey/a)、沙雷氏菌(5fem和名4f假单胞菌(AeW咖o加;y)种。在这些原核宿主中，人们也可以制备表达载体，所ii^达载体通常含有与所述宿主细船目容的表达控制序列(例如复制起点)。此夕卜，应存在^f可数量的各种已知启动子，例如享Ut启动子系统、色氨酸(Trp)启动子系统、P-内,酶启动子系统或入噬菌体的启动子系统。所述启动子通常会控制表达，任选地具有操纵子序列；并且应含有核糖体结合位点序列，例如用于启动并完成转录和翻译。如果需要的话，可以通过插入5，端Met密码子并符合读框地插入下游核酸插入物来提供^J^末端曱减氨酸。也可以使用标准的寡核苷酸突变方法iM多除核酸插入片段的^^末端延伸部分。此外，可以使用酵母表达。酵母表达系统具有多种优势。首先，有证据表明酵母分泌系统产生的蛋白呈现出具有正确的j^克键配对。其次，翻译后糖基化是通过酵母分泌系统来有效地进行的。酿酒酵母CS^cc力aro迈ycescerew'w'ae)的前-原-oc因子前导区(由W-7基因编码)通常可^^l来指导酵母的蛋白分泌C&"We，""，Alpha-Factor-DirectedSynthesisandSecretionofMatureForeignProteinsini^cc力aro,ce51cereWae.Proc.Nat.Acad.Sci.，81:4642-4646(1984))。前-原-oc因子的前导区含有信号肽和原区段，所ii^、区段包括由KEX2基因编码的酵母蛋白酶的识别序列这种酶可切割Lys-Arg二肽切割信号序列的g侧上的前体蛋白。所述核酸编码序列可以在框内与所述前-原-ot因子的前导区融合。然后将这种构建体置于强转录启动子例如乙醇脱氢酶I启动子或糖酵解启动子的控制之下，。所述核酸编码序列之后是翻*止密码子，所述翻*止密码子之后是转录终止信号。或者，所述核酸编码序列可以与另一种蛋白编码序列(如Sj26或p-半乳糖苷酶)融合以便于通过亲和色语来纯化所述融M白。对于用于酵母表达的构建体来说，插入蛋白S^刀割位点来分离融M白的^^且成部分是可4亍的。也可以在杆状病毒系统中实现有效的翻译后糖基化和重组蛋白表达。哺乳动物细胞能在有利于重要的翻译后修饰(例如折叠和半胱氨酸配对)的环境中表达蛋白、加入复杂的糖结构以及分泌活性蛋白。用于在哺乳动物细胞中表达活性蛋白的载体以在强病毒启动子和多腺苷酸化信号之间插入了蛋白编码序列为特征。所述载体可以含有赋予了用于基因扩增的潮霉素抗性、庆大霉素或G418抗性的基因，或者其它适^^被用作可筛选标记的基因或表型，或者的甲M呤抗性基因。使用曱呤抗性编码栽体可以将所述嵌合蛋白编码序列导入到中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系中或者使用适合的筛选标记将其导入到其他细胞系中。通过DNA印迹分析可以确证是否在转化的细胞中存在所述载体DNA。通过RM印迹可以证实产生了对应于插入片段编码序列的RM。本领域中已经开发了许多其它适合的能够分泌完整的人类蛋白的宿主细胞系，包括CHO细胞系、Hela细胞、骨髓瘤细胞系、Jurkat细胞等。用于这些细胞的表达载体可包括表达控制序列，例如复制起点、启动子、增强子和必需的信息加工位点，例如核糖体结^^位点、RNA剪接位点、多腺苦酸化位点和转录终止序列。优选的表达控制序列是来自免疫球蛋白基因、SV40、腺病毒、牛乳头瘤病毒等的启动子。通过已知的方法可以将含有目的核酸区段的载体转移到宿主细胞中，这些方法^^艮据细胞宿主的类型变化。例如，氯化钩转化通常祐JD于原核细胞，而磷酸钓、DEAE葡聚糖或脂质转染试剂(lipofectin)介导的转染或电穿孔可被用于其它真核细胞宿主。可釆用用于在哺乳动物细胞中表达基因或核酸的备选载体，那些载体与被开发用M达人Y-干扰素、组织纤溶酶原激活因子、凝血因子vm、乙型肝炎病毒表面抗原、蛋白酶Nexinl和嗜酸性粒细胞主要碱性蛋白的载体类似。此外，所述载体可以包括可以用于在哺乳动物细胞(如C0S-7)中表达插入核酸的CMV启动子序列和多腺苷酸化信号。昆虫细胞也能表达哺乳动物蛋白。在含有杆状病毒载体的昆虫细胞中生产的重组蛋白可经过类似于野生型蛋白的翻译后修饰。简言之，用于在昆虫细胞中表达活性蛋白的杆状病毒载体以插入了苜蓿银紋夜蛾(^^^ra/7力2'caca/27bi77/'ca)核型多角体病毒(AcNPV)启动子下游的蛋白编码序列为特征，所述启动子是针对编码主要的包涵体蛋白一一多角体蛋白的基因的。用病毒DNA和质粒DNA的混合物转染所培养的昆虫细胞例如草地贪夜蛾GS^cto/^e"/y塔2》er^)细胞系并JJ^所述病毒子代进行平板培养。多角体蛋白基因的缺失或插入失活会导致产生包涵体阴性病毒，所述病4^形成与野生型包涵体阳性病毒明显不同的蚀斑。这些特征性蚀斑形态允许可^li也筛选AcNPV基因已经被选定的杂合基因所^l代的重组病毒。本发明还提供了含有预期核酸的载体，所述载体位于适合于表达所述核酸的宿主中。通过已知的方法可以将含有目的核酸区段的载体转移到宿主细胞中，这些方法会根据细胞宿主的类型变化。例如，氯化钙转化、转导和电穿孔通常被用于原核细胞，而磷酸钙、DEAE葡聚糖或脂质转染试剂(lipofectin)介导的转染或电穿孔可被用于其它细胞宿主。或者，本发明的核酸可以与一个或多个指导和调控插入核酸转录的功能元件可操作地连接，且所述核酸可净i^达。例如，核酸可以与细菌或噬菌体启动子可^作地连接并且净皮用来指导所述核酸的体外转录。一个进一步的实例包括在偶联的转录-翻译系统中使用本文提供的核酸，其中所述核酸指导转录且由此产生的RNA会被用作翻译的模板以生产多肽。本领域技术人员应理肽来产生^体)中或口用在将所述多M予至细胞或受试者的方法中。结合载体进行的核g达可以是在体内或在体外的。体内合成包括转化可以用作所述载体的宿主细胞的原核或真核细胞。或者，所述核酸的表达可以存在于体外表达系统中。例如，通常净iU^来合成相对较大量的mRNA的体外转录系统是市售的。在这类体外转录系统中，编码PLAD的核酸可被克隆到表达载体中并邻近转录启动子。例如，所述BluescriptII克隆载体和表达载体含有侧面为强原核转录启动子的多个克隆位点(StratageneCloningSystems,LaJolla，CA)。包含所有用于在体外根据DNA模板合成RNA的所需试剂(如Bluescript载#0的试剂^T是可以^^得的(StratageneCloningSystems,LaJolla，CA)。然后在体外通过这种系统产生的RNA可以在体外翻^f产生所需的PLAD多肽(StratageneCloningSystems,LaJolla，CA)。基因治疗方法通过基因治疗方法可以给予编码含有PLAD或由PLAD组成的多肽的核酸。编码本发明的多肽的核酸可被置于载体中并且在体内或离体条件下通过标准方法将其送递到受试者的细胞中。本发明的核酸编码多肽可以被功能性地连接到可特异地用于该多肽分泌的特异性前导肽上。例如所述肽可以具有信号序列，例如鼠Ig-入信号序列Cff/ez//^erefa/.Nat.Biotechnol.17:343-8，1999)、大鼠胰岛素前导序列(尸aiAra/Wa/.J.I咖unother.20:437-8，1997)、FGF-4信号序列(〃，e"/.Aterioscler.Thromb.Vase.Biol.,17:2453-2460,1997)、人生长激素信号肽WacfeWa/.GeneTher.6:385-92，1999)、P内St^酶信号序列(#收力"Wa/.Hum.GeneTher.5:1445-55，1994)、牛促乳素j言号序列(fo/wa""a/.BranRes.Mol.BrainRes.44:143—146,1997)和其它类似的信号序列。对于体内给药，所述细胞可以是在受试者体内的且所述核酸可以通过可药用载体来给予。受试者可以是任何需要在细胞中选择性表达核酸的动物。在一个优选的实施方案中，本发明的动物是人。此外，可以通过本发明的方法来治疗的非人JI动物可包^^但不限于猫、狗、鸟、马、奶牛、山羊、绵羊、豚鼠、仓鼠、沙鼠和兔以及任何其它可以按照本文所述方法在细胞中选择性表达核酸的动物。在上述包括在受试者细胞中引入夕卜源DM的方法中(即基因转导或转染)，本发明的核酸可以是棵露DM形式或者所述核酸可以位于用来将所述核酸送送递到细胞以便在细胞内表达该核酸的栽体中。所述载体可以是市售的制品，例如腺病毒载体(QuantumBiotechnologies,Inc.(Laval,Quebec,Canada))。可以通过各种机制将所述核酸或载体送递到细胞中。作为一个实例，可以通itJ3旨质体来进行送递，佳月市售的脂质体制品例如Lipofectin,Lipofectamine(GIBCO-BRL，Inc.,Gaithersburg，MD)、Superfect(Qiagen，Inc.Hilden，Germany)和Transfectam⑧(PromegaBiotec，Inc.,Madison,WI)，以及其它按照本领域的标准方法开发的脂质体。此外，可以通过电穿孔以及Sonoporation仪器(ImaRxPharmaceuticalCorp-，Tucson,AZ)在体内送递本发明的核酸和载体，用于电穿孔的技术可以从Genetronics，Inc.(SanDiego，CA)获得。作为一个实例，可以通过病毒系统来进行载体送递，例如可以包装重组体逆转录病毒基因组的逆转录病毒载体系统。然后所述重组体逆转录病毒可被用来进行感染从而将核酸送递到被感染的细胞中。将所述核酸导入哺乳动物细胞中的确切方法为，当然不限于使用逆转录病毒载体。其它可以被广泛地用于该过程的技术包括^J^腺病毒载体、腺伴随病毒(AAV)载体、慢病毒载体、假型逆转录病毒载体和痘病毒载体，例如痘苗病毒载体。也可以使用物理转导技术，例如脂质体送递机制、受体介导的机制以及其它^4^制。本发明可以与任何的这些或其它通常使用的基因转移方法一起使用。本发明的核酸和核酸送递运载体(例如病毒；脂质体、质粒、载体)可以位于可药用载体中以用于在体内给予至受试者。"可药用，，是指不嘸i在生物学上或其他方面具有不良作用的物质，即可以将所述物质与所述核酸或运载体一同给予受试者，同时不会引起任何不良的生物学影响或以有害的方式与含有它的药物组合物的任何其他组分相互作用。应当然地选择可使活性成分的任何降解降到最低并且使受试者体内的任何不良副作用减到最小的载体，这是本领域技术人员所熟知的。所述核酸或运载体可以以下述方式给药口服、肠胃夕卜(例如静脉内)、通过肌内注射、通it^内注射、经皮肤、体外、局部等。所需要的核酸或载体的确切量会随受试者的不同而变化，这取决于受试者的物种、年龄、体重和总体状况、进行治疗的任何病症的严重度或机理、所用的具^t酸或运载体、其给药模式等。PLAD自締合抑制剂本发明进一步提供了一种包括PLAD自締^s抑制剂或TNF样受体寡聚抑制剂的组合物。"抑制剂"被定义为一种可与PLAD结合的化合物或一种可与耙标的PLAD结合并且阻止PLAD活性的化合物(包括抗体)。一旦与PLAD结合，所述抑制剂可以中断或防止PLAD自締合，因此抑制TNF受体样受体的寡聚化。TNF样受体寡聚化抑制剂可以是PLAD特异性结合的抗体(多克隆或单克隆)、与PLAD结合的配体、与PLAD结合的多肽、与PLAD或基于PLAD的g拟物结合的化合物。例如，包括PLAD或由PLAD组成的多肽可以与天然存在的TNF受>^=羊受体的PLAD締合，因此防止或抑制该TNF受^#受体与其它天然存在的TNF受体样受体自締合。所述包括PLAD或由PLAD组成的多肽可以是可溶性PUD。也考虑了抗个体基因型抗体和亲和力成熟抗体。其它抑制剂包括但不限于设计用于阻断PLAD自締合的分子或化合物。所述抑制剂可以是抑制PLAD自締合的全蛋白或蛋白片段，因此防止了TNF受>^=羊受体的寡聚化。所述抑制剂可以是根据本文所述方法鉴定的有机分子。TNF受体及它们的寡M合体的晶体结构可被用来设计可中断PLAD自締合的分子。也可以分析所述晶体结构以设计可模拟PLAD并且中断PLAD自締合的分子。因此，提供了一种制备小分子抑制剂的方法，通过该方法生产该抑制剂。提供了干扰TNFR装配和TNF结合的小分子(SM)和PLAD-肽衍生物。才艮据TNFR1蛋白二聚体的晶体结构，进行了PLAD締合结合表面搜索。结合了保守同源性检索的上述搜索以及基于本文PLAD突变的数据使得可以鉴定一些潜在的链间締合位点。例如，如PLAD二聚体结构所示(图23)，每条肽链第34位的两个组氨酸环似乎在链间袋中彼此呈镜像固定互相镜锁(mirror-lock)。由于组氨酸残基的咪喳是中断PLAD自締合的良好候选物，所以咪哇和咪哇衍生物可以是有效的受^#异性阻断物并且可#皮用于治疗TNF介导的疾病。本文公开了可干扰TNFR装配和TNF结合的化合物。j来说，适合的抑制剂是那些可ii7v所述PLAD二聚结构的链间袋并且^"f扰位于第34位的两个组氨酸环之间的相互作用的化合物。^J1个意义上讲，不优选含有较大取^基的抑制剂，所述取4^^^^碍i^到所述链间袋中或阻止第34位的两个组氨酸之间相互作用的中断。相反，优选含有具有以下性质的取代基的抑制剂，所述取^J^吏得ii^所述链间袋很容易并且可M插入和随后第34位的两个组氨酸之间的相互作用的中断。此外，甚至更优选含有具有以下性质的取4m的抑制剂，所述:^^J^目对于所述链间袋中的其它g具有更高的亲和力，因此可^t和/或增强PLAD二聚结构中抑制剂的结合。本领域技术人员可以用电脑分析假定的抑制剂以评估某些取^RJ^是否会增强或妨碍与所述PLAD二聚结构的结合。本文所用的术语"祐:取代的"应该被认为包括所有允许的有机化合物取代基。在一个广义方面中，所述允许的取代基包括非环状的和环状的、支链的和非支链的、碳环的和杂环的以及芳香的和非芳香的有机化合物取代基。示例性的取代基包括例如下文所述的取代基。对于合适的有机化合物来说，所述允许的取^J^可以是一个或多个并且可相同或不同的。对于本公开来说，所述杂原子(如氮)可以具有氬取^J^和/或本文所述有机化合物的任何允许的取代基，所述取代基满足杂原子的配价。本公开不意欲受到所述允许的有机化合物取代基的任何方式的P艮制。术语"取代"或"用…取代"也包括隐含的条件，即这种取代应依照被取代原子和取代基的许可配价且所述取代产生的是稳定的化合物，例如不会自发地经历转化的化合物，所述转化例如重#、环4匕、消除等。本文中"A1，，、"A2，，、"A3，，和"A4，，^U^作通用符号以^^各具体的取^J^这些符号可以是4^f可取^C基，不限于本文所7>开的那些，并且当在一种情况下它们被限定为某些取^RJ^时，在另一种情况下它们可以被定义为某些其它的取储。本文所用术语"烷基"为1至24个碳原子的支链或非支链饱和烃基，例如曱基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基、M、辛基、壬基、癸基、十二烷基、十四烷基、十六烷基、二十烷基、二十四烷基等。所ii^也可以;U皮:^代的或未^皮:^代的。可以用一种或多种基团来取代所ii^基，所述基团包括但不限于如下所述的烷基、卣代坑基、烷M、烯基、絲、芳基、杂芳基、醛、絲、羧酸、酉旨、醚、面化物、羟基、酮、硝基、甲^J^、辟i/R氧代(sulfo-oxo)、磺iH^、砜、亚mil巯基。在本说明书中，一般用来指未被取代的娱基基团和被取代的^i基团；但是，本文中也可以通过鉴定^^基团上的一个或多个特定^Mm来特指所述被取代的烷基基团。例如，术语"面代烷基"特指用一个或多个卣化物(例如氟、氯、溴或碘)取代的烷基基团。如下所述，术语"烷M烷基"特指用一个或多个烷lL^基团取代的烷基基团。如下所述，术语"烷M"特指用一个或多个氨基基团取代的烷基基团等等。当在一种情况下使用"烷基"而在另一种情况下使用特定的术语如"烷基醇，，时，并非意在暗示术语并不会也指特定的术语例如"烷基醇"等。该实践也可被用于本文所述的其它基团。即，当术语如"环烷基"是指未被取代的和被取代的环烷基部分时，该取代的部M可被特别地指明；例如一种务本的被:^代的环^可以^皮称为，例如";^环烷基"。类似地，一种被取代的烷絲可以被特异性地称为，例如"卣代烷錄"、一种具体的被取代的烯基可以是，例如"烯基醇"等。同样，使用上位术语例如"环^&"和下位术语例如";^环烷基'，的实践也并非意在暗示该上位术语不包招4亥下位术语。本文所用术语"烷氧基"是通过单独的末端醚键结合的烷基；即，"烷氧基"基团可以^X义为-0A1，其中(是如上所述的;^。本文所用术语烷氧基烷基是含有烷lL^取代基并且可被定义为-A1-0-A2的娱基基团，其中^和A2为娱J^基团。本文所用术语"烯基"为结构式中至少含有一个碳-碳双键的具有2至24个碳原子的烃基。不对称结构(如(W)C=C(A3A4))意在包括A和Z型异构体。这一点可以根据本文的结构式来推测，其中存在不对称烯，或者可以通过键符号C=C来明确地标明。所述烯基可以被一个或多个基团所取代，所迷基团包括但不限于如下文所述的烷基、面代烷基、烷氧基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、醛、、羧酸、酯、醚、卣化物、羟基、酮、硝基、曱^m^、碌L代氧代、磺StJ^砜、亚mils^。本文所用术语为结构式中至少含有一个碳-碳三键的具有2至24个碳原子的烃基。所述炔基基团可以被一个或多个基团所取代，所逸基团包:^但不限于如下所述的烷基、卣代烷基、烷氧基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、醛、、羧酸、酯、醚、卣化物、羟基、酮、硝基、曱>^^、硫代氧代、磺^t^、砜、亚^iUl^本文所用术语"芳基"为含有任何基于碳的芳族基团的基团，所述芳族基团包括但不限于苯、萘、苯基、联苯基、苯lL^苯等。术语"芳基"也包括"杂芳基"，所述杂芳基被定义为含有芳族基团并且至少具有一个掺入所述芳族基团环内的杂原子的基团。杂原子的实例包括但不限于氮、氧、减和磷。同样，术语"非杂芳基"也被包括在术语"芳基"内，它的定义为^^有不含杂原子的芳族基团的基团。所述芳_^基团可以是净皮^^代的或未#皮:^代的。所述芳基基团可以被一种或多种基团所取代，所述基团包括但不限于如本文所述的錄、卣代絲、烷絲、烯基、錄、芳基、杂芳基、醛、絲、羧酸、酉旨、醚、囟代物、羟基、酮、硝基、曱>^^、硫代氧代、磺絲、砜、亚砜或巯基。术语"联芳基"是一种特定类型的芳基基团并且被包括在芳基的定义中。联芳基是指通过稠环结构结合在一起的两个芳基基团(如在萘中)或者是通过一个或多个碳-碳键连接的两个芳基基团(如在^^基中)。本文所用术语"环烷基"是由至少三个碳原子构成的非芳族碳环。环烷基基团的实例包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基等。术语"杂环烷基"为其中至少一个环上碳原子净皮杂原子取代的如上所述环烷^^基团，所述杂原子例如但不限于氮、氧、硫或磷。所述环M和杂环烷基基团可以^^皮^^代的或未^C^M、的。所述环:^和杂环娱J^基团可以净皮一个或多个基团所取代，所述基团包括但不限于如本文所述的烷基、烷氧基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、醛、絲、羧酸、酉旨、醚、囟化物、羟基、酮、硝基、曱硅;^、硫代氧代、碌g、砜、亚m^统u^。本文所用术语"环烯基"是由至少三个碳原子构成并且含有至少一个双键(即CO的非芳族碳环。环烯基的实例包括但不限于环丙稀基、环丁烯基、环戊烯基、环戊二烯基、环己烯基、环己二烯基等。术语"杂环烯基"为一类如上文所定义的环烯基基团并且被包括在术语"环烯基"的含义中，其中所述环的至少一个碳原子#皮杂原子取_代，所述杂原子例如但不限于氮、氧、硫或磷。所述环烯基基团和杂环烯基基团可以是被取代的或未被取代的。所述环烯基基团和杂环烯基基团可以被一个或多个基团所^L代，所逸基团包括但不限于如本文所述的烷基、烷氧基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、醛、氨基、羧酸、酉旨、醚、由化物、羟基、酮、硝基、曱^)^、硫代氧代、磺酰基、砜、亚miL统u^。本文所用术语"环状基团"是指芳基基团、非芳基基团(即环絲、杂环貌基、环烯基和杂环烯J^基团)或两者。环状基团具有一个或多个被取代的或未被取代的环系统。环状基团可以含有一个或多个芳基基团、一个或多个非芳J^基团或者一个或多个芳J^基团和一个或多个非芳^^基团。本文所用术语"醛，，可用式-c(o)hM示。在本说明书通篇中，"c(o)"是(H)的缩写符号。本文所用术语"胺"或"M，，可用式狀^3"示，其中a1、f和a3可以独立地为如上所述的氢、烷基、囟代烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、环烷基、环歸基、杂环;^或杂环烯基基团。本文所用术语"羧酸"可用式-c(0)0H"示。本文所用"羧酸才艮"可用式-c(0)0—来表示。本文所用术语"酯"可用式-oc(0)V或-c(0)0^来表示，其中^可以^_如上所述的;^、卣代M、烯基、g、芳基、杂芳基、环;^、环烯基、杂环:^或杂环烯基基团。本文所用术语"醚"可用式a^^ij^示，其中(和a'可以独立地为如上所述的M、卣代g、烯基、g、芳基、杂芳基、环g、环烯基、杂环^4或杂环烯J^基团。本文所用术语"酮，，可用式At(0)VM示，其中A'和A'可以独立地为如上所述的M、面^^&、烯基、、芳基、杂芳基、环M、环烯基、杂环:^或杂环烯J^基团。本文所用术语"卣化物"是指卣素氟、氯、溴和硪。本文所用术语"羟基"可用式-OHM示。本文所用术语"氮"可用式-N02i)t4示。本文所用术语"曱M基"可用式-SiAlW^^示，其中A1、V和尸可以独立地为如上所述的氢、烷基、卣代烷基、烷氧基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、环坑基、环烯基、杂环M或杂环烯基基团。本文所用术语"硫代氧代'，可用式-s(o)a1、-s(0)2A1、-0S(0)^或-os(o)2(^i^示，其中v可为如上所述的氢、m、卣^m^、烯基、炔基、芳基、杂芳基、环烷基、环烯基、杂环;^或杂环烯1^基团。在本说明书通篇中，"S(0)"是S=0的缩写符号。本文所用术语"磺酰基"是指可用式-S(0)^来表示的碗代氧代基团，其中^可以^_如上所述的氢、烷基、卤代烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、环烷基、环烯基、杂环m或杂环烯j^基团。本文所用术语"磺随基"或可用式-S(0)2冊-絲示。本文所用术语"砜"可用式AS(0)^来表示，其中l和f可以独立地为如上所述的烷基、卣代烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、环烷基、环烯基、杂环m或杂环烯基基团。本文所用术语"亚砜"可用式^S(0)f^示，其中Y和A'可以独立地为如上所述的烷基、卣代龍基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、环坑基、环烯基、杂环m或杂环烯j^基团。本文所用术语可用式-SHij^示。本文所用的"R1，，、"R2，，、"R3，，、"Rn"(其中n为整奶可以独立地具有一个或多个上逸基团。例如，如果W为直^^基团，那么所述^^基团的一个氢原子任选地可以被羟基基团、烷lL^基团、^J^基团、卣化物等所取代。根据所选的基团，可以将一个第一基团掺入到第二基团中或者可以将所述第一基团悬吊(即连接)到所述第二基团上。例如，对于短语"含g基团的烷基基团"，所述l^^基团可以被掺入到^^基团的骨架上。或者，所述^J^基团可被连接到所ii^^基团的骨架上。所选基团的性质将会决定所述第一基团是被^v还是被连接到所述第二基团上。除非另作说明，含有的化学^^仅以实线而未以楔形或虚线示出的化学式考虑了每种可能的异构体，，例如每种对映异构体和非对映异构体以及异构体的混合物，如外消旋或非消旋手性(scalemic)混合物。提供了一种通*予有效量的咪哇或咪哇衍生物来抑制配体与TNF受体样受体结合的方法。本文所考虑到的抑制剂的实例通常为5元含氮杂环，所述杂环通过各种取^J^来起作用。这类抑制剂的实例在下文中示出，并且一般通过未4皮:^代的鉢杂环结构的名称来确定(即，其中R"为H)。异噁唑异噻唑在具有上述结构的抑制剂的许多实例中，r1、r2、r3、r4和R5若存在，则独立地为H、烷基、烷氧基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、醛、氨基、羧酸、酯、醚、囟化物、羟基、酮、硝基、曱^S、硫代氧代、磺g、砜、亚sUi^。在具体的实例中，R1—5独立地为d-C6;^、"-C6烷M^i^d-C6烷llj^基团。示例性C厂C6^^基团和C「C4^^基团包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、仲丁基、异丁基、戊基、异戊基、己基、2-乙基丁基、2-曱基組等。对应的C「C6烷tt含有与l^子键合的上述C厂C6絲，所述luf、子也与所述阳离子环键合。烷lLj^^基团含有与烷基键合的醚基并且最多总共含有六个碳原子。应该注意到有两种异构的1，2，3-三唑。本发明也考虑到了靶向TNF受体样受体的其它区域，使得与该区域一旦结合后，所述受体中PLAD的构象就会被破坏，从而阻止它与另一个PLAD締合。例如，本领域技术人员可以耙向p60TNFR的CRD3，使得p60TNFR的CRD3区一JS^皮结合，所述受体的构象就会被改变，从而防止p60TNFR的PLAD与另一个PLAD締合。因此，本发明还提供了一种通*予有效量的TNF受M受体寡聚化抑制剂来抑制细胞中TNF受>^=羊受体寡聚化的方法。本发明也考虑到了通过增强PLAD自締合来增强TNF受>^#受体的作用。例如，存在需要增强TNFR信号传导的情况。在这类情况下，PLAD自締合激动剂可^J]来将由于弱PLAD相互作用而对TNFR作用具有抗性的细胞转化成对TNFR作用铜:感的细胞，所iiJt动剂例如某些可与PLAD结合并且具有增强PLAD自締合的特定性质的抗体或分子。这类增强的PLAD自締合可以提高配体结合以及信号传导。需要这类增强的PLAD相互作用的疾病状态的实例包括但不限于自身免疫性淋巴组织增生综合征(ALPS)和高IgM综合征。本发明还提供了利用PLAD作为靶向部分来将生物试剂送递到细胞中。例如，与毒素相连的PLAD可被送递到细胞中，使得与TNF-R上的天然存在的PLAD一结合，寡聚化就受到抑制，并且所述天然存在的TNF-R—内化，与毒素连接的PLAD就会被内化，从而将所述毒素iHit到细胞中。本文通篇所用的"TNF受体样受体"是指TNF受体超家族的^f可成员，包括但不限于TNF-R、p60(也称为p55和TNFR1)、p80(也称为p75、TNFR2)、Fas(CD95/APO—1)、TRAIL受体、LTPR、CD40、CD30、CD27、HVEM、0X40、DR4、TR0Y、EDAR、XEDAR、DCR3、AITR、4—1BB、DR3、RANK、TACI、BCMA、DR6、DPG、DR5、DCR1和DCR2(参iL41)。才艮据表1中给出的GenBank射己号而列出的核苷酸序列、多肽序列以及^^f信息(例如信号序列和成熟蛋白残基奶的4^P内^it过引用的方式纳7^^i兌明书。如先前所述，TNF受体样受体寡聚的抑制剂包括与PLAD特异性结合的抗体、配体、肽模拟物、化合物和多肽。这些多肽包括含有PLAD或由分离的(例如可溶的)PLAD组成的多肽。本发明还提供了一种通#予有效量的TNF受体样受体寡聚化抑制剂来抑制配体与TNF受^4羊受体结合的方法。例如，通*予一种抑制剂(如包括TNFR-PLAD或由TNFR-PLAD组成的多肽)，可以抑制TNF受体寡聚化，从而防止TNF-a与TNF受体结合并且减小TNF-a的有害作用。类似地，给予含有CD40受体-PLAD(CD40R-PLAD)的多肽可抑制CD40R寡聚化，从而防止CD40配体与CD40R结合并且减小CD40R对病情(如同种*移植物排斥、类风湿性关节炎和全身性红斑狼疳)的有害作用。抑制配体与TNF受^#受体结^^导致抑制借助于TNF受体样受体的信号转导，从而提供了一种调节借助于TNF受体样受体的信号传导的方法。此外，本发明已经证实TNF受体样受体通过同型締合来结合配体和传导信号，即TNFR-PLAD与TNFR-PLAD相互作用；Fas-PLAD与Fas-PLAD相互作用；CD40-PLAD与CD40-PLAD相互作用等。因此，利用PLAD自締合来干扰肽和g拟物的治疗可以确保受体特异性治疗，因为本发明证明了每种受体仅^it过所述PLAD与其自身締合。例如干扰TNF-R1功能而不影响TNF-R2优于现在的非选择性治疗。类似地，特异性干扰特定的TNF受体样受体功能而不影响其它TNF受体样受体功能是非常理想的，并且可由本文教导提供。蛋白治疗方法本发明还提供了一种通#予有效量的PLAD自締合抑制剂来治疗受试者体内的炎症的方法。本发明还提供了一种通it^予有效量的PLAD自締合抑制剂来治疗受试者体内与自身免疫性疾病相关的炎症的方法。这类疾病包括但不限于周期热综合征、脓毒病综^^征和成^v呼吸窘迫综^^征。因此，提供了一种其中所述炎症与膝勤生关节炎有关并且所述抑制剂是TNF受体样受体的可溶性PLAD的方法。在本发明中，所述受试者可以是^^可哺乳动物，优逸人，并且可以包括但不限于小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、兔、猫、狗、山羊、猴子、马和猩猩。本文所用"治疗"描述了患者临床状态的改善。所述改善包括从减轻炎性应答到完全改善炎性疾病。本文所用"自身免疫性疾病"描述了一种受试者的身体对其自身的身体成分产生了伴有有害作用的功能障碍性免疫应答的疾病状态或综合征，。这可以包括B细胞的产生或者可包括T细胞的产生，所述B细胞^4十对所有抗原、变应原或主要组织相容性(MHC)抗原产生特异性抗体，所述T细胞具有可识别自身成分并产生会引起炎症的细胞因子的受体。自身免疫性疾病的实例包括但不限于溃疡性结肠炎、克罗恩病、多发性石更化、类风湿性关节炎、脓毒性关节炎、糖尿病、恶性贫血、自身免疫性胃炎、银屑病、白塞氏病、韦格纳氏肉芽肺病、结节病、自身免疫性曱状腺炎、自身免疫性卵巢炎、大疱性类天疱疫、天疱掩、多内分泌腺疾病、斯提勒尔氏病、兰伯特—尹顿肌无力综合征、重症肌无力、古德帕斯彻氏综合征、自身免疫性睾丸炎、自身免疫性葡萄膜炎、全身性红斑狼齊、斯耶格伦氏综合征和强直性脊柱炎。由于某些TNFR受体(如HVEA)是病毒受体JJt些受体^l赖于寡聚化作用，本发明也考虑到了通过P且止PLAD装配来阻断病毒进入。所用的最佳剂量应根据所治疗的个体以及所用的抑制剂而变化。抑制剂的量也应根据个体的年龄、身材、体重、状况等而变化。本领域技术人员应认识到执业医师所优化的剂量是最佳的，并且例如，^迈27^0/7」州ar側ce"〃ca/iWe/ces中描述了用于确定剂量和用药方案以及制备剂型的方法。例如，通过与目前在炎症或自身免疫性疾病的治疗或预防中所用的药剂比较，可以确定适合的剂量和给药方案。通常，根据所要获得的临床反应可以按0.1至100mg/kg体重的剂量范围来口服给予或肠胃外给予本发明的抑制剂。例如，当所述抑制剂是可溶性PLAD或含PLAD化合物时，可以以0.5至100mg/kg的量^M^予所述抑制剂，例如5mg/kg。在一个进一步的实例中，当所述抑制剂是可溶性(分离的)p60PLAD且所述疾病是关节炎(例如脓毒性关节j^)时，可以以每个关节0.5至100mg的剂量iM^予所述PLAD。例如，关节内给予剂量为4mg/kg或肠胃外给予16mg/kg的P60PLAD可有效地治疗脉^毒性关节炎。在疾病征候和症状长期緩和或稳定后可以完全停止抑制剂的给药并且在所述疾病征候或症状恶化后或者在免疫状态明显变化后可以再次给药，这可以通过本领域医师所熟知的常规随访免疫研究来确定。通过评估病史、征候、症状以;s^:观实验室测试的具体方面来确定所给予的特定剂量的抑制剂在治疗本文所述的炎症或自身免疫性疾病方面的效果，所述客观实验室测试在评估所治疗的特定病症的病理生理活性方面具有证明性用途。这些征候、症状以^^观实验室测试可根据所治疗的具体病症而变化，这是本领域4^f可医师所熟知的。例如，根据与适当的对照组的比较以及关于所述疾病在"-^A群或特定个体中的正常进程的知识，如果l)证明了受试者的复发频率或严重度获得了改善；2)证明了疾病或病症进程得到了稳定；3)减少了使用其它免疫抑制药剂的需求，则可以认为一种特定的治疗是有效的。一旦证实通过一种特定抑制剂可以显著改善或稳定疾病活动后，就可以依照简化的或不连续的治疗方案来评估特定的征候、症状或实验室测试。根据评估本文所述的特定征候、症状或^^见实验室测试的标准方法，如果疾病活动复发，那么可以再次开始治疗。此外，通过长期评估标准征候、症状和^C实验室测试(本领域技术人员已知的)可以确定所给予的特定剂量的肽配体在预防受试者自身免疫性疾病方面的效果，所述受试者未患有自身免疫性疾病Mt艮出自身免疫性疾病的危险。该时间间隔可以很长(即，数年/数十年)。根据目前关于本领域医师和研究人员所熟悉的特定疾病的已知危险因素的知识(如特别强的疾病家族史或者暴露于或获得了可能导致产生自身免疫性疾病的因素或M)可以确定有狄出自身免疫性疾病风险的患者。"可药用"是指不会在生物学上或其他方面具有不良作用的物质，即可以将所述物质与所选的化合物一同给予个体，同时不会引起任何不良生物效应或以不良方式与含有它的药物组合物的任何其他组分相互作用。载体的选择取决于给药方法和务沐的患者。给药方法可以是口服的、舌下的、粘膜的、吸入的、吸收的或通过注射。也应该注意并非所有的给予本文所述TNF受体样受体寡聚抑制剂的方法都需凓^可药用载体。本发明中，可以口月l给予或胃肠外给予在用于人受试者的可药用载体中的PLAD自締合或TNF样寡聚抑制剂。适合用于口月l或^L^给药的载体可以包括一种或多种用于人受试者的可药用载体。适合用于口服的载体包括一种或多种也可用作调p未剂、润滑剂、助悬剂或4呆护剂的物质。适合的固态载体包括磷酸钙、碳酸钙、硬脂酸镁、糖、淀粉、明胶、纤维素、羧聚曱烯(carboxypolymethylene)或环糊精。适合的液态载体包括水、不含热原的盐水、可药用油或<^阿这些的混合物。所述液体也可以含有其它适合的药物添加剂例如緩冲剂、防腐剂、调味剂、粘度或渗透调节剂、稳定剂或助悬剂。适合的液态载体的实例包括含有或不含各种添加剂的水，所述添加剂包括作为ph-调节胶的羧聚乙烯。所述抑制剂可以被包含在肠溶胶嚢中，所，溶胶嚢可将多肽释放肠道中以避免胃内破坏作用。为了经肠胃外给予拮抗剂，用可含添加剂(如油酸乙酯或异丙基肉豆蔻酸酯)的盐水制备无菌溶液或悬液并且可以将其注射到例如皮下或肌内组织中以及静脉内。筛选方法一种筛选PLAD締合抑制剂的方法，包括a)用以下两种质粒转染同一细胞，其中一种质粒含有包括编码一种分离的PLAD的核酸序列的核酸，另一种质粒含有编码另一种分离的PLAD的核酸序列；b)将所述细胞与假定的抑制剂接触；并c)测量PLAD的自締合，其中同未与所述假定抑制剂接触的细胞中的PLAD締合相比，步骤b)的细胞中PLAD締合的减少表明了存在PLAD締合抑制剂。本筛选方法的一个实例是一种筛选PLAD-締^s押制剂的方法，包括a)用以下两种质粒转染同一细胞，其中一种质粒含有的核酸包括编码与荧光供体功能性连接的分离的PLAD的核酸序列，另一种质粒含有的含有编码与荧光受体功能性连接的分离的PLAD的核酸序列；b)将所述细胞与所述抑制剂接触；并c)测量FRET,其中同未与所述抑制剂接触的细胞中的FRET测量相比，FRET的下降表明存在PLAD締^^抑制剂。本发明还提供了一种筛选PLAD締合激动剂的方法，包括a)用以下两种质粒转染同一细胞，其中一种质粒含有包括编码一种分离的PLAD的核酸序列的核酸，另一种质粒含有编码另一种分离的PLAD的核酸序列；b)将所述细胞与假定激动剂接触；c)测量PLAD的自締合，其中同未与所述假定激动剂接触的细胞中的PLAD締合相比，步骤b)的细胞中PLAD締合的增加表明存在PLAD締合激动剂。下面的实例举例说明了使用FRET来测量PLAD締合。此外，在进行上述筛选方法时，可以使用单个质粒来送递多个编码PLAD的核酸。在包括FRET分析的方法中，可以使用单个质粒来送递多个编码PLAD的核酸，所述PLAD与荧光M或受体功能性M接。或激动抗剂。也可以通过使用细胞测定法来鉴定PLAD締合的抑制剂或激动剂，所述细胞测定法可以包括但不限于细胞凋亡诱导、NF-KB诱导、淋巴细胞成熟或活化以及坏死i秀导(3、4、8、15、29、33、42、45)。下述实施例中更加具体地描述了本发明，所述实施例仅意在举例说明，因为其中的许多修改和变4树本领域技术人员来i)U^而易见的。实施例1洗涤H9S沐巴瘤细胞并重悬于PBS中。然后在4"C下用100ng/ml的人重组体TNFoc(R&DSystems)旋转孵育细胞l小时。然后用2mM交联剂DTSSP(Pierce)处理细胞30分钟并用20mMTris.Cl[pH7.5]在冰上终止所itA应15分钟。用加入了蛋白酶抑制剂(BoehringerMannheim)的150mMNaCl、20mMTris.Cl[pH7.5]、1mMEDTA、30mMNaF、2mMb-甘油鳞酸酯和1mM原钒酸钠裂解细胞。在非还原(不含P-巯基乙醇)或还原(含有280mMP-巯基乙醇)的条件下将等量的溶胞产物电泳并且用特异性抗体分析p60和p80复合沐(19)。用KodakImageStation440it:^f亍光密度分析。发现p80复合沐所示出的分子大小是单元大小的约三倍，符^t基化和iMt基化三聚体(图1A)。令人惊奇的是，在存在或不存在TNFoc的情况下均可有^i也捕^1^p80复M(通过光密度分析测得占链的65-70%，图1A,泳道3和4)。尽管事实是大多数p60存在于高尔基体中并且无法接触到交联剂(7)，无论是否加入TNFoc，都有差不多15-20。/。的p60链被交联成明显的三聚体以及不连续的较高级的复合体(图1A,泳道11和12)。对照实验显示没有可检测的内源TNFoc且没有显示出其它蛋白(如p80)与p60复*交联。蛋白质印迹分析证实溶胞产物中不含TNFot。佳月抗-p60抗体的交^1合*的免疫沉淀显示蛋白质印迹中的p60复M中没有可检测水平的p80。通过用统u^乙醇切割交联剂可将所述复^^分解成单体(图1A，泳道7、8、15和16)。因此，这些结a明在配体结合前p60和p80链会自締合。为验证非配体，性自装配的可能性，鉴定了介导这种现象的TNFR的结构域。已经确定当过表达时，p60的胞质死亡结构域可以自締合并且^^触发凋亡(8)。但是，由于所观察的预装配复M显然是非信号传导性的，所以人们假设所述装配域存在于胞质区外。人^们发现在酵母双杂交相互作用测定中，p60和p80的ECD的N末端区可以特异性地自締合(9)。通过聚合HMiC^应(PCR)可以产生p60、p80、HVEM、DR4和CD40的各种截短形式和突变形式并且将它们测序。简言之，扩增p80的前导序列和前10个氨基酸残基使得可以在3，端包括HA表位标签以在受体的N-末端产生HA标签。用BamHI和EcoRI消化所述PCR产物并将其克隆到pcDNA3中。然后通过EcoRI和Xhol位点将含有受体片段的PCR片段导入至该质粒中。对于所述GFP/CFP/YFP嵌M来说，可通过PCR扩增所述片段并将其符^^读框地导入p60ACD-HA的XhoI和XbaI位点中。按照每个制造商的说明书用Fugene6(BoehringerMannheim)转染293T细胞。用150mMNaCl、20mMTris.Cl[pH7.5]、1mMEDTA、30mMNaF、2mM0-甘油磷酸酯、1mM原钒^#)、5mM橫乙酰胺、2niM二碌L苏糖醇(DTT)、TRITONX-IOO和蛋白酶抑制剂(BoehringerMannheim)裂解细胞。在用蛋白G琼脂糖孩i球(BoehringerMannheim)和正常小鼠IgG预清除后，用2mg抗-GFP和蛋白G琼脂糖孩O求将蛋白^y^斤iij^胞产物中免疫沉淀下来。用含0.5MNaCl的肖緩冲液将所述免疫复合体洗涤两次，然后用常规裂解緩冲液洗涤三次。在Tris/甘氨,(Novex)上辨析免疫复M。Jurkat细胞的转染显示了类似的结果。在哺乳动物细胞中，人们发现嵌合p60受体会与无尾p60(p60ACD-HA)强烈地相互作用而不会与TNFR样受体疱渗病4^^调控因子(HVEMACD-HA)相互作用，所述嵌合p60受体的胞质结构J^净皮乡录色荧光蛋白(GFP)所^^a(图1B，比较泳道2和3)。GFP无法单独与p60ACD-HA締合(图1B,泳道5)。观察到全长p80和无尾p80之间有类似的彭卜部分同型相互作用(图1C，泳道6)。此外，仅移除p80的第10-54位氨基酸(a.a.)，即重叠CRD1，会完全阻止与完整p80的非配体絲性締合(图1C，泳道7)。通狄p60中进行类似的缺失(a.a.1-54)可以消除自締合(参见下幻。通过将p80的N-末端部分(a.a.10-54)附加到p60受体上，然后所述p60受体与全长p80相互作用，可进一步说明该p80的N-末端部分的重要性(图1D,比较泳道3与泳道4和5，图9)。因此，该结构J^UL以介导异源受体的特异性締合。该締合是非配体依赖性的，因为嵌合p8(Ws46055—211(111)具有两个由EcoRI限制性位点编码的絲酸，所述限制性位点被插A^Lp80和p60序列的4^^处，所述M酸中止了TNFoc的结合(图1E,图片k和l)。因此，在缺少配体的情况下，一种与TNFR-ECD的配体结合袋不同的新的功能结构域介导了自装配。自此，该结构域被称为前配体装配域(PLAD)。p60或p80中缺失所述PLAD可完全消除配体结合(表2和图1E，比较图片d、f和h)。然而，加入p80的PLAD^f吏得缺失PLAD的p60可以与TNFoc结合，但是如上所述，通过插入两个由EcoRI位点编码的M酸可以阻止这种结合(图1E,图片j和1)。因此，TNFR与TNFot的有效结^^取决于受体的自装配。或者，移除PLAD可以z皮坏整个ECD结构。由于先前的结果显示移除CRDl不会破坏p60ECD的正确折叠(7》，所以后一种可能性是不可能的。然而，为明确地辨清这些可能性，在p60ACD-HA的CRDl-3中引入M酸置换并且测定它们对p60ACD-GFP-HA相互作用的影响。按照每个制造商的说明书使用Quikchange法(Stratagene)进^f亍诱变。通过DNA测序证实所述突变。p60和p80中除K19夕卜，所有置换的M酸都是保守性的。p80中对应的g为E22。PLAD中的两种置换KY19/20AA和K32A(力消除了自締合(图2A，比较泳道3和5与泳道2)并且排除了TNFoc结合(表2),所述置换并不欲中断直接的配体接触。PLAD中另一个残基的置换一一Q24A不影响自締合或TNFoc结合(图2A，泳道4和表2)。表2中所指的^J^bl^于p60的成熟序列的。CRD2配体结合袋中PLAD外侧的两种其它置换——E57A和N66F会中断TNFot结^(a对受体自締合几乎没有影响(表2和图2A,泳道6和7)。人们^现缺少胞质尾区的突变受体与野生型ECD的締合与它显性干涉p60诱导的凋亡方面的能力有关，表明了所述突变受体通过PLAD进入内源功能性p60受体复*(表2)。这些结果显示PLAD本身与配員触结构域不同但是对于有效的TNFa结合和受体功能来il^仍是必要的。与单体受体链不同，预计预装配受体复合体中受体链的胞质部分彼*说其接近。这样TNFa结^St成胞质结构域较紧密的締合，从而导致了信号传导蛋白的募集。为评估这一假说，采用了实施例II(7力中所述的新型流式细胞方法来分析两种GFP光i普变体之间的焚光共振能量转移(FRET)，青色荧光蛋白(CFP)作为荧光餅，黄色荧光蛋白(YFP)作为荧光受体(12)。FRET是一种有效的测量活细胞中分子相互作用的方法。由于当焚光团之间距离增加时能量转移迅逸减弱，所以GFP变体t间的FRET允许检测100A内的分子间相互作用。产生了嵌合蛋白，其中用CFP或YFP置换p60和p80的l&^区并且进行测试以确定不同的受体对之间是否发生了能量转移。用双激光FACSvantage仪器进行FRET，在514nm处激发YFP蛋白，然后在413nm处激发CFP蛋白。然后通过检测546nm处的发itiM^测CFP到YFP的能量转移。用远远多于CFP蛋白的YFP蛋白来转染细胞。然后4MFlowjo程序(TreestarInc.)分析CFP阳'It^的FRET。观察到了p60ACD-CFP和p60ACD-YFP之间的能量转移，所述能量转移M上是在加入TNFct后增加的(图2B，图片a)。通过缺失PLAD或通过可防止PLAD締合的K32A突变来阻止该FRET(图2B，图片b和c)。类似的p80厶CD-CFP:p80ACD-YFP对分析显示了通iiio入TNFot而再次增加的强FRET信号(图2B,图片d)。使用p60ACD-YFP作为受体和p80ACD-CFP或CFP-p80ACD(与胞外结构域的N-末端融合的CFP)作为供体的对照显示没有FRET(图2B,图片e和f)。这些数据-~^证明了在活细胞中，p60和p80链自身都极M^JL配体可诱导复合沐的变化，所述变化会导M质中的CFP和YFP部分发生紧密的締合。p60和p80的PLAD与TNFR家族中许多受体的第一CRD的比较显示出形成所述结构域的二硫键支架的半皿酸"卜的保守性(图3A，p80中的Y23、P36、G37和T50)。某些其它^^有DR4和Fas的TNFR样受体显示出CRD1的4呆守性较差，由此产生了这些受体中是否存在PLAD样结构域的疑问。本发明探究了TNFR超家族其它成员中是否存在非配体,性自締合。令人吃惊的是，TRAIL受体1(DR4)和CD40的ECD掀自締合，但与其它TNFR样受体的ECD相互作用不显著(图3B)。这些嵌^M^4现出了同型特异性FRET(图3C)。如实施例II中所述，Fas(CD95/AP0-l)也可以与其自身特异性締合U力。因此，通过PLAD的自装配是TNFR家族的一个保守性特征。本发明表明了在缺少配体的情况下，p60和p80TNFR通过被称为PLAD的新型N-末端结构域可预装配成功能性复^。这揭示了CRD1是如何在p60和p80的配体结合和受体信号传导中起到重要作用的(M。到目前为止，通过TNFR超家族成员进行信号传导的^i^t念是配体可使单体受体链附着到三倍复合体上，这会导致M信号转导蛋白的募集(入乂乂6。该模型很大程度上是以与配体复合的p60的晶体结构为基础的，该晶体结构表明三个受体链环绕着所i^聚配体的亚基间沟，持分开至少40A。所述配体与延伸的CRD2和CRD3结构域接触，而CRD1结构域不与配体相互作用或彼此不相互作用(J)。近来关于DR5/TRAIL复M结构的描i^示出了类似的受体-配体相互作用UJ)。然而，所述结合了配体的结构似乎并不会反映配体结合前的受体结构。现在人们已经清楚细胞表面上的p60和p80会自締合,如果缺失PLAD,则它们仅以单体形式存在。交联内源p60和p80受体表明三聚体是占优势构象，但是也可以存在其它的寡聚复M。由于现在已经清楚前締合是TNFoc结合所需的，所以关于配体如何与预締合受体复^相互作用受到极大的关注。利用两大类模型的其中之一可以解释TNFR信号传导，所述模型为l)链旋转和重排；和2)超团簇(supercluster)形成模型(图3D)。在链旋转和重排模型中，配体^v预形成的受体三聚体中，导致PLAD接触被中断以及链被旋#重排成三聚体，所iiX聚体^lit过与配体三聚,触而被稳定化。或者，配体结合可能会触发预装配的TNFR三聚体的聚簇，其中所述PLAD接触未被完全中断。PLAD-介导的预装配的TNFR三聚体的存在重新阐明了通过该受体大家族所进行的信号传导的重要方面，已知该受体家族中许多成员对于淋巴细胞功能和稳态是至关重要的(》。特异性同型ECD接触以及PLAD中关键残基的保守性是TNFR超家族成员的特征，所述超家族包M过死亡结构域进行信号传导的受体(p60、DR4和Fas)以及不通过死亡结构域进行信号传导的受体(p80和CD40)。在细l&4面上将链预分类为同型复合体可以促进应答的有效性和特异性。"受体干扰"应该被狄，在所述受体干扰例如p80链(缺少死亡结构樹^皮TNFot募集到与p60构成复合体，并且导致对凋亡的明显抑制。p80通过提供独立的促凋亡信号实际增强了p60-诱导的凋亡这一事实支持了这一观点(7力。预形成的三聚体也可以避免常规摸型可能要求的必^降，即连续地募集受体链以"建立"复合体，因此导致可通过TNFR样受体进行快速信号传导(。对其它受体家族的预装配已有记载，特别是IL-1和IL-2，它们由不同多肽的异聚体构成(M。特别值得注意的是最近关于红细胞生成素受体二聚体预締合的描述，所述二聚体显然经历了"剪刀式，，运动以接纳配体u;)。如果是那样的话，则可通过同样的M酸接触来进行受体链自締合，所述M酸接触对于配体结合是至关重要的U》。相反，TNFR超家族利用了与CRD2/3配体接触区不同的专用自締合结构域。PLAD的鉴定可提供通过特异性抑制TNFR样受体的前配体装配并因而阻止信号传导的疗法来治疗TNFa或相关配体导致的疾病的新疗法。实施例II在人自身免疫性淋巴组织增生综合征(ALPS)中，编码异常形式Fas(CD95/APO-1)的杂合突变会显性干涉Fas诱导的淋巴细胞凋亡。本发明证明了这种情况来源于利用胞外结构域的野生型和突变体Fas受体的预締合，而不依赖于配体诱导的受体寡聚化。发现预締合的Fas受体复M是信号转导所必需的，并JUfit^色荧光蛋白(GFP)变朱t间的FRET的新的应用在活细胞中证实了预締合的Fas受体复*。这些结果提供了一种用于人疾病中Fas信号传导和显性干涉的新的M机制。Fas(APO-1/CD95)是转导对于免疫稳态和耐受至关重要的凋亡信号的细月汰面受体("-i7)。Fas是具有三个富含半M酸的胞外结构域(CRD)的317个氨基酸的1型膜糖蛋白，所iil&外结构^Ut瘤坏死因子受体(TNFR)超家族的特征。对于人类，携带杂合Fas突变的患有1A型ALPS的患者的淋巴细胞具有减少的Fas诱导的凋亡，并且突变体等位基因的转染会导致对Fas诱导的凋亡的显性干涉(W-M。这被认为是由于配体介导的交联将野生型和有缺陷的Fas链交联成了混合的不能募集下游信号分子的三聚体复合本。然而，已经研究了通过改变的RNA剪接导致大多数CRD2的l^卜结构域(ECD)缺失(Pt2，缺失a.a.52-96)的显性干涉突变。Fas-阴性293T细胞上该突变的表*明该突变体不与对抗性抗体结合(图4A)("、JJ)。该突变体也不能与三聚化的FasL结合，而胞质死亡结构域中的ALPS突变(例如Pt6,A241D)并不影响FasL结合或AP0-1结合(图4A)。甚至在未与对抗性抗体或FasL结合的情况下，Pt2突变体也能以几乎与Pt6死亡结构域突变体一样的效率显性干涉Fas诱导的凋亡(图4B)。共转染细胞的表面染色表明与那些单独用WTFas转染的细船目比，Fas表达没有减少，排除所述突变体Fas分子抑制正常等位基因表达的可能性(J6。因此，通过常规的由FasL诱导的受M体交联的信号传导模型不能解释显性干涉，因为在该过程中Pt2突变体Fas分子不会成为混合受体复合体的"~#分。因此，使用构建体测试了Pt2Fas和野生型Fas之间的非配体，'f封目互作用，在所述构建体中野生型Fas的l^f结构域一皮绿色荧光蛋白(GFP)所置换(HA-Fas1-210:GFP)，以避免由所述死亡结构域导致的斜目互作用U《"。在缺少FasL的情况下，用Fas1-210:GFP嵌^^免疫共沉淀全长Fas受体和Pt2Fas受体(图4C)。该相互作用是特异性的，因为TNFR家族的另一成员——与GFP融合的疱療病4^A介质(HVEMACD:GFP)——不与Fas免疫沉淀。为进行这些免疫沉淀研究，按照制造商的i兌明书用Fugene6(BoehringerMannheim)转染293T细胞。用150mMNaCl、20mMTris.Cl[pH7.5]、1mMEDTA、5mM碘乙纖、2mM_^>危苏糖醇(DTT)、10%甘油、1%TRITONX-100和蛋白酶抑制剂(BoehringerMannheim)裂解细胞。在用蛋白G琼脂糖孩姊(BoehringerMannheim)和正常小鼠IgG预清除后，用1mg抗-GFP(RocheMolecularBiochemicals)和蛋白G琼脂糖孩姊免疫沉淀蛋白。用自緩冲液洗涤免疫复^^三次。用2y1抗AU1(Covance)和蛋白A微球免疫沉淀AUl。将蛋白在Tris/甘氨酸凝胶(Novex)上电泳，转移到硝酸纤维素膜上并且用指定的抗体进行印迹。将条带用SuperSignalWestDura(Pierce)显影。用ID图像分析软件(Kodak)进行光密度分析。在实施例I中，描述了被称为"前配体装配域"(PLAD)的保守性N-末端结构域，所述结构域介导TNFR超家族其它成员的特异性自締合。然而，Fas的N-末端缺少;W在其它TNFR家族受体中保守的关键性M酸，因此产生了Fas是否含有功能性PLAD的疑问。构建了截短或去除了第一CRD的N-末端Fas突变体，并且测试了配体结合、Fas-Fas締合以及凋亡功能(图5)。用适当的引物和Pwo高^聚合酶(RocheMolecularBiochemicals)通过PCR诱变产生Fas截短突变体。对于AU-1标记的受体，使用了一种具有预先插入到FasCRD1上游区中的AU-1标签的模板。为进行HA标记，将突变克隆到&造的pcDNA3载体的EcoRI/XhoI位点中，所述栽体在HA标签序列之前含有p80的前导序列。点突变是^J)Quickchange技术(Stratagene)来产生的，用Pwo代替Pfu聚合酶。通过限制酶作图和自动测序来验证突变。上述研究表明成熟Fas蛋白中的形成第一CRD亚结构域的起始43个M酸(a.a.)的缺失可显著减少配体结合但不会阻止AP0-1激动性抗体的结合(刘。缺失编码整个CRD1的起始66个M酸会阻断与FasL和APO-1的结合(图5A)。这两种缺失表现出了由APO-1抗体启动的凋亡中的相应缺陷(图5C)以及所述截短链与具有不同标签的Fas1-210蛋白的共沉淀的缺乏，所述Fas1-210蛋白含有完整的ECD(图5B，泳道1-4)。因此，尽管有部分的FasL结合和正常的APO-1结合，从FasN-末端移除仅43个氨基酸即会阻止凋亡诱导，这与这些截短型受体与野生型Fas的締合的缺失相关。基于大多数所预测的与FasL的接触均存在于CRD2和CRD3中这一事实，由66个氨基酸(构成CRD1)的缺失导致的FasL结合的缺失是令人意外的(22、23)。通过比较这些结果与那些在实施例I中用p60和p80获得的结果，假设了Fas受体复合本的非配体依赖性前装配对提供有效的FasL结合和受体信号传导可能是至关重要的。为进一步探究受体自締合中配体结合的必要务降，测试了一种Fas点突变-R86SUJ),这一R86S突变移除了对于结合FasL非常重要的一个CRD2接触残基，发现它在细胞表面表达时不与FasL结合(图5A，下图)。如利用两种不同的对抗性抗-Fas抗体的染色结果所示，整个受体结构是保存完整的(图5A和C劝)；并且如免疫共沉淀所示，仍旧会发生完整Fas的自締合(图5B,泳道5-7)。甚至更加有意义的是，当与野生型(WT)受体共表达时，该突变体会显性干涉FasLi秀导的凋亡，同时其自身不与FasL结合(图5D，实心^")。用APO-1抗体在相同细胞中诱导的凋亡在所有转染中均未受损，表明了两种受体都在细胞表面上功能性表达(图5D，空心条)。因此，显性干涉不依赖于天然存在和基因工程改造的Fas突变体的S5体结合。相反，Fas功能与自締合能力有关。为定量测定活细胞中的Fas受体自締合，开发了基于具有不同光镨的GFP突变体一_青色萸光蛋白(CFP)和黄色荧光蛋白(YFP)之间荧光共振能量转移(FRET)的流式细胞测定和显微测定。CFP和YFP具有有利于FRET的光潜性质，因为CFP的最;^j^射波长接近于YFP的最大吸收波长(M。由于这些蛋白间的FRET在距离大于50-IOOA时^il下降，所以CFP和YFP融M白之间存在FRET则表明它们的焚光蛋白结构域非常接近。当将C-末端符合读框地融合了CFP和YFP(在第210位代替了所述死亡结构樹的Fas受体共转染到293THEK细胞中时，它们在细胞表面上得以适当表达(划。通过标准PCR克隆技术来使Fas和其它TNF家族受体与CFP和YFP产生符合读框的融合，利用蛋白质印迹和荧M孩沐来证实正确的蛋白表达。用1jag所述的YFP融合蛋白构建体和2jag所述的CFP构建体转染293T细胞。24-36小时后，用PBS收集细胞并且用FACSvantage细胞/f3U^行分析，用于CFP时将氪激光器(Spectrophysics)调到413皿，用于YFP时将ILT气冷^tit器调到514nm。用470nm/20nm带通滤波器检测CFP。用546nm/10nm带通滤波器检测YFP和FRET，分别佳月514nm和413nm激光器产生的信号。然后用514和413nm激光器连续照射细胞使得可以从每个细胞中检测到全部三种信号。采用^hf尝校正以使得在单独用CFP或YFP转染的细胞中不存在可见的FRET信号。从每个样品中收集50，000次事件并且利用FlowJo软件包(Treestar)分析数据。为测量FRET的效率，在利用505-545nm带通滤波器用通过5分钟的照射漂白YFP之前和之后，用焚M微镜测量共转染细胞的CFP发射强度。对照表明这种大强M^上彻底地漂白了YFP，同时^没有直接漂白CFP。针对这种直接漂白进行了校正。使用下述公式来计算FRET效率E%=[l-(YFP漂白前的CFP发射/YFP漂白后的CFP发射)]x100%。当利用流式细胞^测时，由于FRET，用CFP和YFPFas融M白共转染的细胞的CFP发射触发了YFP波长处的强荧光发射(图6A，Fas1-210:CFP/Fas1-210:YFP)，特别是在YFP高水平表达时。使用了一种通过9个氨基酸的肽连接物将CFP与YFPM融合(CFP-YFP)的构建体作为阳'l"生对照("。在这些细胞中，緣测到了錄ii7K平线性增长的强FRET信号。在含有或不含所述死亡结构域的Fas融^^白之间检测到了FRET,但是在Fas和TNF家族成员TNFR1或HVEM之间未检测到FRET(图6A和B)。当与Fas1-210共表达时，截短或移除了PLAD的N-末端截短形式的Fas产生的FRET信号降低(图6B)。为定量测量这些不同受体突变体之间的FRET效率，对选择性光漂白YFP受体分子后的CFP脱淬灭(dequenching)(FRET的另一特征)进行了基于显微镜的测定(W、2力(图6C)。缺少死亡结构域的Fas的自締合产生了观测效率为16°/。的FRET。当两个分子上均带有死亡结构域时，FRET效率升至27。/。，这表明了死亡结构域的寡聚性质(幼。Pt2Fas产生了与Fas1-210相近的FRET效率，显示了接近正常的自締合，但是使用Fas43-210时信号减弱，使用Fas67-210时没有明显的FRET效率。这些结a明Fas^在细l^4面上特异性自締合，并M—性质,于PLAD。为测试天然Fas受体是否会在未转染的T淋巴细胞表面上自締合，进行了化学交联研究(图7)。加入不能穿透细胞的可切割巯基的交联剂3，3，-^f克双磺基琥珀酰亚胺丙酸酯(DTSSP)会将去糖基化细胞i^胞产物中Fas的表观分子量从45变为140kD,狄应于形成Fas三聚体(图7A，泳道2)。与单体条带的光密度比较表明有60%的Fas链被交^三聚体。用二疏苏糖醇(DTT)切割交联剂会将大多数三^l^ii原为单体态(图7A，泳道5-8)。DTSSP诱导的复M类似于那些在使用APO-1对抗性抗体或FasL激发而未进行化学交联后存在的复M(图7A,泳道3-4)U力。激动剂诱导的复^f^是通过衬间^^键连接的，这可通过DTT还原来证明(图7A,泳道7-8)。对这些细胞的免疫沉淀的Fas信号传导复M进行的检测表明，抗体或配体^m会触发FADD和半胱天冬酉l"8的募集并且导致半胱天冬il"8被蛋白酶解成其41和43kD的加工后形式(图4B)以及聚(ADP-核糖)聚合酶的半胱天冬SI^赖性切割(图7C)。然而，用DTSSP处理过的细胞中的信号传导复^^表现出中度的FADD締合，但没有半胱天冬酶-8结^^或加工并且没有PARP切割，表明预締合受体复合体的化学交联不足以触发凋亡信号。值得注意的是，DTSSP的预处理可防止响应于随后的AP0-1处理的活性信号传导复合体的形成(图7B)。这些结果表明Fas受体的非共^m締合不依赖于过表达。配体结合触发了受体复M结构的变化，所述结构变化与链间二硫键形成和分子内信号传导有关。Fas受体的化学交联似乎会捕获非信号传导态的预締合复合体。保守性N-末端PLAD;^^挥适当的Fas受体功能所必需的，并且因此可以在ALPS的显性干涉中起到关键作用。比较了国立卫生研究院所研究的大量ALPS患者的结构、显性干涉(DI)和Fas-Fas自締合(SA)(W、(图8),yU门发现每个与疾病相关的显性干涉突变样品中,留了PLAD，包括影响了Fas胞外或胞内部分的突变。在Ptl和20中，突变产生了仅编码成熟Fas蛋白的前57和62a.a.的提前终止多肽，表明PLAD本身足以进行显性干涉(图8A)。利用点突变移除全部或部分死亡结构域(Pt5、30或33)或消除其FADD结合功能(Pt3、6、26、29或31)会产生有效的显性干涉Fas分子(^)。因此，测试了通过去除了死亡结构域的Fas的基因工程终止突变体(Fas1-210)进行的显性干涉是否需要PLAD。结果表明N-末端截短破坏了通过Fas1-210进行的显性干涉(图8B)。来自ALPS患者(ALPSPt26，D244V)的Fas死亡结构域点突变体中的PLAD截短(最多缺失至a.a.42)消除了该天然突变体的显性抑制作用(图8B)。这些发现j重新明确了ALPS中Fas突变显性干涉正常Fas功能的枳逸。显然显性干涉Fas突变保留了N-末端PLAD,因为该结构域负责野生型和突变体Fas分子间的复M形成。遗传显性干涉的主^子原理是突变体蛋白必须充分地与特异性功能复合体中的野生型蛋白相互作用(43)。先前，与人疾病相关的显性负性突变已经被证明^if过掩蔽配体、阻断细胞内信号传导或阻止WT链被转运到细^4面来干扰正常的受体信号传导(44)。对于Fas而言，所述数据表明显性干涉来源于一种新的机制，所i^L制包括在配体结合前，由PLAD介导的野生型和突变体受体之间的締合。这些发现解释了为什么虽然ALPSPt2体内的异常Fas蛋白和其它FasECD突变体不能结合FasLM会产生足以导致疾病的显性干涉。由于PLAD的移除可以消除含有缺失或突变的死亡结构域的Fas分子的显性负性功能，所以PLAD^^导的相互作用也^^导致大量携带会影响Fas死亡结构域的突变的ALPS患者的显性干涉相互作用。PLAD相互作用也可能参与了Fas诱导的凋亡的下调，所述下调是通过含有全部该结构域的可溶性^^选剪接形式的Fas来进行的(45)。预计不编码功能性PLAD的天然受体突变体不是显性干涉的。PLAD介导的显性干涉也可以在通过诱骗受体进行的信号传导调节中起作用(20),并且会在由TNF家族其它成员的异源遗传异常导致的疾病发病中起作用。这些结果M出了一种新的用于理解由Fas进行的跨膜信号传导的模型，所述模型包括通过配体将预締合三聚体转化成信号传导态而不是配体诱导的单个受体链的寡聚。FRET研究使得可以评估在缺少配体的情况下，细l&4面上CFP和YFP标记的Fas分子间的距离。对于随;W^向的CFP和YFP而言，F6rster半径-R。为50A(2JD。假设与Fas融合的CFP和YFP是等量表达、彼此之间随才脉向并且随才M目配成等ii^聚体，那么所观察到的FRET效率(图3C)表明与全长Fas分子融合的CFP和YFP生色团之间的距离上P艮是57A,与Fas1-210融合的CFP和YFP生色团之间的距离上限是65A。由于在Fas和其它TNFR家族受体之间未观察到FRET,所以这些距离比，见察到的在细J^4面上随机分布的M之间的距离要近得多并且是特异性的。FRET需要阈水平的YFP表达(图3A,FAS1-210:CFP/FAS1-210:YFP)这一事实反映了混合的CFP标记的Fas和YFP标记的Fas的统计或者预締合实际上依赖于受体密度。由于预締合增强了Fas信号传导，因此通过改变Fas表达或其它方法来调控受体预締合量是一种新的用于调节凋亡信号传导的机制。通过受体复合体重排进行的信号传导可能是广泛使用的机制，以确保对配体的快速和特异性细胞响应。然而，这一信号传导机制也赋予了对于由ALPS中天然存在的受体变体或病原性异源突变导致的显性干涉的易感性。实施例in方法小鼠和试剂BALB/c、C57BL/6、DBA/1J、C3H/HeJ、C3H/HeN、TNFR1和TNFR2敲除小鼠购自JacksonLaboratory,TNF-a转基因小鼠购自Taconic。所有实验中均使用6-8周龄的雄性小鼠并且将其祠养在免疫实验室(NIAID、NIH)的动物房中。利用CBER合成CpGDNA。CpGDM1668序列为5，-TCCATGACGTTCCTGATGCT-3，(SEQIDNO:61)(J幼。通过^JDP60PLAD和P80PLAD制备抗P60(1H11)或抗P80PLAD(3H11)的小鼠单克隆抗体(MAb)。PLAD-GST融M白的纯化按照文献所述的方法进行PLAD-GST融^白的克隆和纯化(7劝。用4-20%Tris-甘氨酸皿和质语来验证纯化的PLAD-GST融合蛋白并且储存在-80。C下。用Detoxi-GelAffinityPak柱(Pierce)移除LPS。P60和P80PLAD蛋白的体外测试用胰蛋白酶处理后收集L929细胞。用不同剂量的PLAD蛋白预处理细胞30分钟，之后加入TNF-ot(2ng)。类似地，用PLAD蛋白和GST预处理42.3细胞。在30分钟预处理后，加入TNF-oc(3ng)、Fas的抗体U力(10ng)和蛋白A(20ng)并在37匸下培养。利用血细胞计数器或流式细胞#规定的时间点对细胞死亡进行定量测定。按照制造商的说明书(R&Dsystems)测量TNF-oc结合。PLAD蛋白的免疫原性和半衰期采用ELISA来研究PLAD蛋白的体内免^^、性和半衰期。PLAD蛋白可以引发抗体应答，其中至少一半是针对所述GST部分(附图5a)。利用在各个时间所取样的血液，采用ELISA测量P60PLAD或P80PLAD蛋白的体内半衰期，其半衰期接近5小时(附图5b、c)。采用PLAD蛋白疗法的由TNF-oc、CpGDNA触发的关节炎的j^在存在或不存在100"gPLAD蛋白的情况下，将TNF-a、CpGDNA或LPS关节内注射到小鼠膝关节中。注射后3天处死小鼠并且取出关节以进行组织病理学检查。CIA的i秀导和用PLAD蛋白治疗CIA将用等体积的完全弗氏佐剂(Sigma)乳化II型鸡胶原(Sigma),将0.1ml含100ngII型^f的乳液真皮内注射至雄性DBA/1J小鼠的^C^部。在21天时，给小鼠追加100ng用等体积的不完全弗氏佐剂(Sigma)乳化的II型胶原。在首次免疫后的22天，开始用PLAD蛋白或PBS进^f亍预防性处理，按编号方式(incodedfashion)每周蒯溪内给药三次直至第52天。在小鼠已经产生关节炎后三天开始用P60PLAD蛋白或PBS进行治疗性处理。腹膜内给予P60PLAD蛋白(每隔一天给予400pg)两周，然后在各组之间转换(switch)所述处理。在"盲法"实验中，由两名不知道所述处理的独立的检查员每三天对小鼠进行一次分析并且评估关节炎的程度；ot胀度和临床评分。通过用测径器测量足爪厚度来测定关节肿胀。使用下述评分级别来评估临床关节炎0级，无肿胀；l级，轻;U3t胀和红斑；2级，明显肺胀；3级，关节僵直。以0-3级和最大可能评分12对每只动物各肢分级。关节的组织病理学检查在将组织常规固定、脱钩和石蜡包埋后，制作关节切片并且用苏木精和伊红染色。由研究人员对所有切片进行编号并且进行盲法评估。按照从0级(无炎症迹象)、1级(滑膜^L^层增生的轻度炎症，最低限度为没有软骨破坏)到2和4级(逐渐增加的炎性细胞浸润或软骨和骨破坏的程^)的级别来判断滑膜炎、血管翳形成或者骨/软骨破坏的程度。体外破骨细胞形成测定从BALB/c小鼠的胫骨中提取骨髓细胞，并JL^含有M-CSF的oc-MEM培养基中培养。3天后，在存在或不存在PLAD蛋白的情况下，用TNF-oc(20ng/ml)和M-CSF(50ng/ml)进一步诱导骨髓巨噬细胞4天。然后固定细胞并且按照制造商的i兌明书(Sigma)针对破骨细胞标志物TRAP进行染色。免疫荧光(^)在存在或不存在P60和P80PLAD蛋白的情况下，在体外用TNF-ot处S^TNFR1或TNFR2敲除小鼠的脾脏分离的单核细胞。用抗NF-kBp65的兔抗体(C-20，SantaCruz)对经固定和透化的细胞进行染色。然后洗涤细胞并用FITC-偶联的驴抗兔抗体孵育细胞。用共聚焦显孩i镜以盲法方式分析核NF-kB并且进^Sf分。统计分析分别使用Fisher检验和Mann-WhitneyU检验分析各组中的发病率和严重度的不同。P《0.05#皮^人为著的。结果重组体PLAD-GST融合蛋白为获#^有人P60或P80TNFR的PLAD结构域的可溶性蛋白，制备谷胱甘肽-S-转移酶(GST)融合蛋白。亲和性纯化提供了全长分子量分别为34kD和33kD漆于絲齡列的预期大小)的P60和P80PLAD-GST融^白(图lb和附图l)。进行蛋白质印迹并通ii^:镨进行蛋白质测序以确证:m^Ji的两条带都为P60或P80PLAD蛋白(图lc)。PLAD蛋白抑制TNF-oti秀导的细胞死亡进行该实验以确定纯化的PLAD蛋白是否会抑制TNF-oc对L929细胞的细胞病变作用(M。纯化的P60PLAD蛋白以剂量依赖方式明显地抑制了小鼠和人TNF-a诱导的细胞死亡(图2a、b)。该保护作用与英夫利昔单抗和依那西普相当(附图2)。相反，对照CD40PLAD蛋白没有作用(图2c)。也测试了需要来自P60和P80的信号以经历由TNF-ocC^诱导的死亡的人42.3细胞。人们发现P60或P80PLAD蛋白会抑制TNF-ot诱导的细胞死亡但不抑制抗-Fas诱导的细胞死亡(图2d)。仅GST蛋白不会抑制TNF-a诱导的或抗-Fas诱导的细胞死亡。此外，P60PLAD蛋白与依那西普和英夫利昔单抗一样有效地抑制L929细胞中TNF-oc诱导的半胱天冬H"8激活(图2e)。因此，纯化的人P60或P80PLAD蛋白有效地阻断AJL小鼠TNF-oc。P60PLAD抑制TNF-oc或CpGDNA诱导的关节炎也测试了PLAD蛋白是否^^抑制体内TNF-oti秀导的关节炎。在加入或不加入100ygPLAD蛋白的情况下，通过关节内注射小鼠TNF-oc(45ng)来诱导关节炎。P60PLAD蛋白强力抑制了TNF-ot诱导的关节炎的特征，包括滑膜炎、血管翳和骨侵蚀(图3a、b)。相反，单独的P80PLAD或GST蛋白并不明显地影响疾病(图3a、c)(附图3a)。TNF-ct在SA的发病机制中起到重絲用(W、M、M。含CpG的细菌DNA和LPS都是能强烈地诱导可触发关节炎的TNF-ot从单核细胞和巨噬细胞中释放出来的细菌成分(W、"。共同注射100|LigP60PLAD蛋白可以显著减轻CpGDM诱导的关节炎中的血管翳和骨破坏(P〈0.05)(图3a、d)，但是100pgP80PLAD则不能(附图3b)。P60PLAD蛋白而非P80PLAD蛋白可显著地减轻LPS诱导的关节炎。P60PLAD抑制胶原诱导的关节炎(CIA)中的MMP表达基质金属蛋白酶(MMP)是关节炎过程中软骨和骨破坏的重^h质，TNF-oc可以诱导MMP表达。因此，该实验确定了P60-PLAD蛋白是否抑制CIA中的MMP表达。结a明P60PLAD蛋白显著地抑制了CIA的匿表达(图25)。注左图中的深色(在原始彩色切片中为褐色)染色部分表示MMP表达。P60PLAD抑制M^、i秀导的关节炎(CIA)中的iNOS表达一氧化氮(NO)是短效自由基气体。过量的一氧化氮是有毒的并且会导致慢性炎症。重要的是，已经证明TNFoc可通微活可诱导的一氧化氮合酶(iNOS)刺激巨噬细胞/单核细胞产生一氧化氮并且提高NO水平，由此导致局部关节损害。因此来确定P60PLAD蛋白是否会抑制CIA中的iNOS表达。结果显示P60PLAD蛋白显著抑制受CIA^Jl的关节中的iNOS表达(图26)。注左图中的深色(在原始彩色切片中为褐色)染色部分表示iNOS表达。这些结果支持了本文的教导，即通过干扰TNFR装配，P60PLAD阻断CIA中TNF-ct诱导的组织损害。结论本发明的结果证实了TNFR1中的PLAD为重要的治疗乾标。人们发现CD95PLAD通过介导显性干涉来参与ALPS的发病机制(77)。P60和P80PLAD蛋白可阻断TNF-cc与TNFRl结合但不会直接与TNF-oc结合。最重要的是，通过全身以及关节内给药，在几种关节炎的小鼠模型中，P60PLAD表现出显著的改^用。此外，通过P60PLAD治疗可以显著地减少关节的炎性细胞浸润。在先前的实例中，人们发现P60和P80PLAD的同型结^^^选择性的并且不^^彼此间交叉结合或与CD95PLAD交叉结合U7J》。那些实验逸实P60和P80PLAD优先作用于对应的受体^a是可能不4^是完全特异性的(图5e、f)。此外，P60PLAD可以在几种关节炎的小鼠模型中抑制所述疾病过程的关键方面。总之，我们的数据显示PLAD是一种重要的关节炎药物耙标。P60PLAD蛋白可有效地抑制由TNF-a产生的NF-kB诱导。P60和P80PLAD蛋白可以受体优先方式抑制TNF-a诱导的NF-kB易位。此夕卜，NF-kB是RANKLi秀导的破骨细胞形成所需的(7力。破骨细胞介导的骨和软骨侵蚀会导致关节炎中的大多数永久损伤(W、M、M。本发明的结果显示出了血管翳中的破骨细胞激活以及TNF-a转基因小鼠中骨破坏的位点。在TNF-a转基因小鼠的关节炎关节和M^i秀导的关节炎中存在大量的RANK和RAML表达(W。P60PLAD治疗显著地减少了被^i:和血管翳中的RANK和RANKL。英夫利昔单抗和依那西普都可以直接结合并且阻断TNF-a的作用，并且现在它们已被广i^用于RA和其它疾病的治疗中(领。然而，已，见察到了副作用例如狼齊样疾病、分枝杆菌感染和淋巴瘤发病率升高("-7J)。两种药物都直接阻断TNF-oc与两种TNFR的结合。因此，它们可有效地抑制TNFR2所介导的药效同时阻断TNFR1的疾病诱导作用。P60PLAD是可以优先地乾向TNFR1的小蛋白结构域。在我们的模型中，约4mg/kg(关节内)或16mg/kg(肠胃外)的P60PLAD蛋白剂量具有与英夫利昔单抗(IOmg/kg)(7^)和依那西普(0.4mg/kg)"剂量类似的作用，所述英夫利昔单抗和依那西普的剂量已经在临床上被用于改善关节炎。P60PLAD蛋白提供了一种抑制TNF-a的致病作用的新方法所述方法可以用于治疗RA。实施例IVPLAD蛋白直接与TNF受体结合为确定PLAD蛋白是否会直接与TNFR结合，将P80-PLAD蛋白与,西普通过与P80PLAD蛋白混合来测试含有TNFR2的完整胞外结构域的TNFR2融M白。免疫沉淀(IP)和蛋白质印迹(WB)的结果显示P80-PLAD-GST蛋白而非单纯的GST蛋白可与依那西普締合，表明了PLAD蛋白可与TNFR直接结合开且问jwi^f市i』_inot'/吝'r生、闺2^。<table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table>氺p60-特异性单克隆抗体MAB225(R&DSystems)的染色。通过区分MAB225阳性细胞的百分数和HA阳性细胞百分数，将数值根据HA表位标各的染色标准化。t将用p60-特异性单克隆抗体4.12(Zyme)的染色根据HA染色来标准化。J使用生物素酰化形式的TNFa来测定TNFa结合并且根据HA染色进行标准化(25)。S在所述293T暂态转染中通过免疫沉淀测定自締^i2)。NT，夫测试。，如所述测定显性干涉(26)。利用p60ACD-HA进行的显性抑制至少为p60ACD野生型(+)的50。/。。在所有的实验中，p6055_211、KY19/20AA和K32A不^^产生4^f可对抗TNFi秀导的死亡(-)的4呆护作用(<5%)。所述抗体和TNFa与p60ACD的结合^A为地设定为1。结果代表了三次独立的实验。200680029841.9势溢也被57/80:a;ilTNF/TNFR超家族成员<table>tableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table>下页中继续表l续<table>tableseeoriginaldocumentpage63</column></row><table>在本申请中，参考了各种出版物。这些出版物的公开内容4r^通过引用的方式纳4申请中，以便更加充分的描述本发明所属
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Le腿'doMRequireiaentforcaspase-8inNF-k邻paBactivationbyantigenreceptor.Scie/膨307,!465-8(2005).67.BgdiaAJIay^S,,lissHDavid,J-g^Ig^[a鍵-緣j4A攀ias，G.、她er,G.,Sfpoien,IS,,Wa幼er、E.F..&Sctett,G,OsteotdasteareessentialforTNF-alpha-斑edkted如kitdestruction.</,Cli,ihve汰110,(2002),68..Po;n勉,肌Calcitoninandeakit加inreceptors:bcmeandbeyond.jE^-户a27zo,,教i,405-422(2000),69.Boyte，WJ"SimonetW.S,，&Lacey,D丄.Osteoclastdifferentiaticmaadactivation.胸,423,337-342(2003》.70.Mori,L，feeliii,S,Delite线G.,&Lesslauer，，，Att微wti加ofcoUag幼-ind恥ed汰rt:tetisin554cDaTNFreceptortype.1(TNFiU)-IgGl-treatedandTOPKl-defickirtmice,J",.fowro恥/,IS7,3i7S-3182(19邻)，71.,Timi,E.,Aoki，K.,Safto，Ii，D'A—sto,F.,May,M丄，N^karawa，I"Sudo,T.,ICojima^■T"Ocamoto,F，Fukiishim.a,H.,Okabe，R.，Ohya^K.,，&Ghosb，S.SelectiveinhibitionofNF-kappaBblocksosteodastogenesisand.preventsinflamnnatorybonedes加ction.invivo.JVimf.她A沐617-624(2004》，72.Gomez掘tto,IJ.,Co加，L,,Vaiwde,Vl,Mola，B掘"Mo纽ero，M.D,;BIOBADASERGroup,Treatmenterfrheumatoidarthritiswithtamornecrosisfactor,inMWtorsmaypredisposetosignificantincreaseintuberculosisrisk:anmlticaiteractive-surveiU節cerepo汰jr法,'iriyiWwwK.48,2122-2127(20(B).73.Wolfe,F"'Micliaud，K"Anderson,JL,&Urbansky，K,Taberc'utosisinfectioninpatientswithrfieranatoWarthritisandtheeffectofiaflixiwabtherapy.JrrltrSisJAn,邻，372-379(2004).74.Shak加r，N.,MiehakkA亂，Harris,C.A，&Bto《J,A,Dwg-Mucedsystemictopuserythematosusassociatedwithetanerceptther邵y.￡acet579-580(2002).75.Wolfe,F.，&Michaod，KLLymphomainrheumatoidarthritis:theeffectofmcfeotrexateand幼ti-tumortiecrosisfactorthempyin18,572patienfe.爿w力r&紐SO,1740-1751(2004).76,腿ott，M.J,，編ni,誘.，Feldni,，M.,Long-Fox,A,，Ch欲te，P.,狄ai.Repeatedtlierap:ywith咖noetonaiantibodytotenournecrosis餘tora妙汰《cA2)inpatkate、vithrheumatoidarthritis.工做￡^《22,1125-112(1994).77,Jarvis，B,,&Fai她，D.Etanerc寧areviewofitsuseinrheumatoidarthritis.Drags57s945-966(W99),78,Zhang,Z,，Jimi，B,，&Bothwell,.A丄.Ree邻toractivatorrfNF-k^spaBlig節dstimulatesrecruitmento.fSHP-1tothecomplexcontainingTNFR-assod站edfactor6thatregulatesosteoclastogenesis.丄力附战附</*171,3620-3626(2003),79,Ftalay，B,.B.,andG.McFadden,2006.Anti-iiranimology:evasionofthehostiram難esystembybacterial加dviralpathogens.Cell〗24:767-782.80,Alcami，A-2003,Viralmimiciyofeytokines,diei加M加sandtheir'receptors.M#及ev7w"!'歸/3:36-50.81,Reading,P.C,，A.Khanna，andG,L.Smith:.2002,VacdboiavimsCoiiEencodesasolubleandcellsurfacetomornecrosisfactorreceptor也.atamtributestovimsvirulence,Wrofogy292:2SS-2將，82,Schrdber，M.，L,Sedger，andG,MdPadden.1997.Distinctdoniai邸ofM-T2,therayxo赚virustomornecrosisfactor(TNF)rec邻torfeo咖l賜mediateextrace!lularTNF■bindingandintraceltalar邵optosisinhibMon..,/朽ro/71:2171-2181,83-PapoffMalIdentificationandCharacterizationofaligand—independenttOMgomerizationDomainintheExtraceltolwRegionoftehCD59DeathReceptor./274(53),3S241-38250(19労)，.序列表IDNO:1p60的l-54位氨基酸(TWFR1)孤kAjxessi放No.M75866'ankAccessionNo.AAA6〗加LVPHLGDREKRDSVCPQGICY層Q,iSICCTKCHKGTY乙YNDCPGPGQDTDC腿SEQIDNO:2成熟p80的10-54位氨基酸(TNFR2)Gen錢ank登记号M32315fe幽nlt登记号AAA59929yapepgstcrjlreyydqtaqmccskcspgqhakwctk:tsdtvcdSBqIDno:3Fas的l-43位氨基酸GenBank登记号m67454r豕enBaflk登记号AAA63174RLSSKSVNAQVTraNSKGLBLRKTVTTYETQHLEGLHHDGQFCSEQIDNO:4Fas的l-66位氨基酸GenBank登记号M舒454GenBank登记号AAA63H4RLSSKSVNAQVT,SKG亂RKTVTTVETQNLEGiaHBGQFCHKPCPPGERKASDCTVNGD砂DCSEQIDNO:5Lt跳的13-50位氨基酸GenBaafc登记号L04270crdqekeyyepqi孤ccsrchpgtyvsaktsrirdtvcSEQIDN0:6CD40的6-.，位氨基酸GenBank螢记号.X605%GenBank登记夸，CAA43045CREKQYU,CCSLCVSDCTEFTETECSEQmNO:7CD30的U-51位氨基酸Ge德ank登记号，M83554GenBaiik登记告，AAA5W4CHGNPSHYY跳AVRRCCYRCPMGLFPTQQCPQRFTDCRKQC認QID勵8CD27的7-42位氨基酸GenBan.k登记夸AAA5841iCPERHYWAQGKLCCQMCEPGTFLVKDCDQHRKAAQCSEQDNO:9HV躍的6-3位氨基酸GenB腿lc發记号謂321GenB魏nk登记4"AABS8354CKEWYPVGSEOTKCSPGYRVKBACGBL窗S,DNO:雄0JC40的3-M位氨基酸GenBMk登记号X75诉2G加Bank登记号CAA53576SEQBDNO:ll'肌4的109-138位氨基酸GenBank登记景U滩875GenB該:k昼记夸AAC51226CMRCTEGVGYTNASNNLFACLPCTACKS加TNFR1的全长序列(p60〗GenBank登记号M75866455个氨基酸seqidNO:12mglstvpduxplvliellvgotsgviglvphlgdrekrdsvcpqgk:yihpq蘭sicCTK:C孤GTYLYNDCPGK3QDTECRECESGSFTASENHLRHCLSCSKCRKEMGQVBISSCTVDRDTVCGCRKHQYEHYWSENLFQCFNCSLCLNGTV腦CQBICQKrVCTCHAGFFmENBCVSCSNCKKSLECTKXCLP(2正nvkgtedsgttviiplvifr5lcllsixFIGLMYRYQRWKSKLYSIVCGKSTOEKEGELBGTTTKPLAPNPSFSPTPGFTPTmFSPWSSTFTSSSTYTP(JDCPNFAAPRREVAPPYQGADMLATALASDPIPNPL沐WEDSAHKPQSmTDDPATLYAVVENVPPLRWKEFVRRLGLSDH鹏RLBLQNGRCLREAQYSMLATWRRRTPKRBATLELLGRVLRD薩LLGCXEraEEALCGPAALP層SLLIlTNFR2的全长序列(p冊)Gen錢ank登记号M3B15461个氨基酸SBQIDNO:13MAPVAVWAALAVGLELWAAAHMJPAQVAFrPYAPBPGSTCRLREYYDQTAQMCCSKCSPGQHAKWCTKTSDTVCDSCEDSTYTQLWNWVPECI^CGSIICSSDQVETQActreq舰CTCRPGWYCALSKQEGC虹caplrkcrk3fgvark]rrETSDWCKPCAPGTFSNTTSSTDICRP卿CNVVAtPG函MDAVCTSTSFTRSMAPGAV證QPVSTRSQHTQPTPEPSTAPSTSFLUPMGPSKPAEGSTGDFALPVGUVGVTALGLUIGWNCVIMTQVKKKPLCLQREAKVPHLPADKA11GTQGPB(^HLLITAPSSSSSSLESSASALDRRAPTRNQPQAPGVEASGAGEARASTGSSDSSPGGHGTQVNVTCIVNVCSSSDHSSQCSSQASSTMGDT.DSSPSESPKDEqVPFSKEECAF腿QLETPETLLGSTEBKPLPLGVpdagmkpsFas全长,号M6454335个氨基酸seqidno:14mxhw1tllplvltsvarlssksvnaqvtd雨sk:腦lrktvttvetq腦glhhdgqfchkpckpgekkaudctvngiwdcwcqbgkeytdkahfsskcrrcrlcdbghglbv鹏ctrtqntkcrckpnffcn歸cehcdpctkcb恥1ikectltsntkckeegsrsnlg，lcl.lixhplivwvkrkevqk:tcrkhrkenqg娜sptl麼etvainlsdvdlskyrrnagvmtl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RDTVCGCRKNQYRHYWSENLFQCFNCSLCLNGTVHLSCQEKQNTVCSEQIDNO:41假定蛋白的139-171位氨基酸(空肠弯曲杆菌RM1221)GenBank登记号Genbank登记号CP000025AW35633麵SEGMEDLSFDDDAQDDNANKTLETQNLEHDSEQIDNO:42假定蛋白的438-454位氨基酸(布氏锥虫)GenBank登记号AC091702Genbank登记号AAX79885TEINELROTITDVETNLSEQIDNO:43假定蛋白的488-517位氨基酸(金黄色葡萄球-菌-)GenBank登记号BA000017Genbank登记号BAB56791DENSKELERLQKIAFNVETKTLESLVDEGQSEQIDNO:44T2蛋白的全长序列(粘液瘤病毒)GenBank登记号M95181326个氨基酸MFRLTLIXAYVACVYGGGAPYGADRGKCRGNDYEKDGLCCTSCPPGSYASRLCGPGSDTVCSPCKNETFTASTNHAPACVSCRGRCTGHLSESQSCDKTRDRVCDCSAGNYCLLKGQEGCRICAPKTKCPAGYGVSGHTRTGDVLCTKCPRYTYSDAVSSTETCTSSFNYISVEFNLYPVNDTSCTTTAGPNEWKTSEFSVTLNHTDCDPVFHTEYYGTSGSEGAGGFFTGMDRYQNTTKMCTLNIEIRCVEGDAVRTIPRTSDGVGVLSHSETITVIGGCLSDVNVD正YSDSNHPEEVDDFVEYHWGTRLRLFPSPKRCRLVSSEQIDNO:45s002R蛋白的全长序列(肖普纤维瘤病毒)GenBank登记号AF170722325个氨基酸MLRLIALLVCWYVYGDDWYSSNQGKCGGHDYEKDGLCCASCHPGFYASRLCGPGSNTVCSPCEDGTFTASTNHAPACVSCRGPCTGHLSESQPCDRTHDRVCNCSTGNYCLLKGQNGCRICAPQTKCPAGYGVSGHTRAGDTLCEKCPPHTYSDSLSPTERCGTSFNYISVGFNLYPVNETSCTTTAGHNEVIKTKEFrVTLNYTDCDPVFHTEYYATSGKEGAGGFFTGTDIYQNTTKVCTDWEIQCSEGDDIHTLQKTOGGSTMPHSETrrVVGSCLSDVNVDMYSDTNHPGEVDDFVEYHWGTRLRFFPLPKRCTPVSSEOIDNO:46UL144蛋白的全长序列(HCMV)GenBank登记号AF179208175个氨基酸MKPLVMLICFAVILLQLGVTKVCQHNEVQLGNECCPPCGSGQRVTKVCTDYTSVTCTPCPNGTYVSGLYNCTDCTECNDTEVTIRNCTSTNNTVCASKNYTSFSISGVQHHKQRQ丽TAHVTVKQGKSGRHTLARLSLFIFLVGnLLILYLIAAYRSEKCQQCCSIGKIFYRTLSEQIDNO:47CrmC蛋白的全长序列(牛痘病毒)GenBank登记号AF482758186个氨基酸MDIKNLLTVCTILYISTLVTADIPTSSLPHAPVNGSCDDGEYLDKTHNQCCNRCPPGEPAKJRCSGSDNTKCERCPPHTYTTVPNYSNGCHQCRKCPTGSFDKVKCTGTQNSKCSCLPG，CATDSSKTEDCRDC]PKRKCPCGYFGGIDELGNPLCKSCCVGEYCDDIRNHRVGPFPPCKLSKCNSEQIDNO:48CrmC(AHR)蛋白的全长序列(痘苗病毒)GenBank登记号AJ416893186个氨基酸MDIKNLLTACTIFYITTLATADIPTSSLPHAPVNGSCDEGEYLDKRHNQCCNRCPPGEFAKVRCNGNDNTKCERCPPHTYTAIPNYSNGCHQCRKCPTGSFDKVKCTGTQNSKCSCLPGWYCATDSSQTEDCRDCIPKRRCPCGYFGGIDEQGNPICKSCCVGEYCDYLRNYRLDPFPPCKLSKCNSEQIDNO:49CrniD蛋白的全长序列(牛j^病毒)GenBank登记号U87581148个氨基酸MMKMTPSYILLVYMFVVVSGDWYE丽GKCNGTDYNSNSNNLCCKQCDPGMYMTHSCNTTSNTKCDKCPDGTFTSIPNHIPTCLSCRGKCSSNQVETKSCSNTQAEYVSVHPDTTANLKDQMVAGYVYHKQSVILVTAYMATHLKEMSEQIDNO:50CnnE蛋白的全长序列(牛痘病毒)GenBank登记号AJ272008167个氨基酸MTKVHILGFLnNTNSLSMKCEQGVSYYNSQELKCCKLCKPGTYSDHRCDKYSDTICGHCPSDTFTSIYNRSPWCHSCRGSCGTNRVEVTPCTPTTNRICHCDSNSYCLLKASDGNCVTCAPKTKCGRGYGKKGEDEMG丽CKKCRKGTYSDIVSDSDQCKPMTRSEQIDNO:510RF167L假定蛋白的全长序列(淋巴嚢肿病病毒)GenBank登记号AY380826289个氨基酸MMLFELFLLPITVHTATDCPPGYYISKVYPAGTPMCSPCSPGTYTGLQNSLRKCLRCSTCSHNEEPKVACSTTSDVQCQCRQGYYYDPESEMCFPCSNCESSKVKVTTCNRTHDTVCKCKEGYYDKNGVCVKCGNCYLGEGVKSKCANNTDVTCELCKNGTFSDKVSSSNICYLYTMCTLGLTQLNFNVTWFDTICINCSMSTDLLDLETFFTINFVTQRRFPEDDLKNMFRLTYNKTRNDIDSANRDDVEGSFTYDPNLPYTMKQLDYLIASKFLMTAYKKISQICQLSEQEDNO:52EVMO(B蛋白的全长序列(小鼠脱脚病病毒)GenBank登记号NC—004105320个氨基酸—MMKMTPSYUXVYMFVWSGDVPYTPINGKCNGTDYNSNNLCCKQCNPGMYMTHSCNTTSNTKCDKCPDDTFTSIPNHSPACLSCRGKCSSNQVETKSCSNTQDRVCVCASGYYCEFEGSNGCRLCVPQTKCGSGYGVYGYSSKGDVICKKCPGMDICCDLSFNSIDVEINMYPVNKTSCNSSIGSSSTISTSELTrrLTHEDCTPWIGDYYSVVDKLATSGFFTM)KVHQDLTTQCKINLEIKCNSGRESRQLTPTTKVYFMPHSETVTWGDCLSNLDVYIVYANTDAIYSDMDVVAYHTSYILNVDHIPPNDCERDSB(2IDNO:53CrraB蛋白的全长序列(骆驼痘病毒)GenBank登记号AF438165349个氨基酸MKSVLYSYILFLSCIIINGRDVTPYAPSNGKCKDNEYKRHNLCCLSCPPGTYASRLCr)SKTNTQCTPCGSGTFTSRNNHLPACLSCNGRCDSNQVETRSCNTTHNRICECSPGYYCILKGSSGCKACVSQTKCGIGYGVSGHTSAG簡CSPCGLGTYSRTVSSADKCEPVPSNTFNYIDVEINLYPVNDTSCTRTTTTGISESISTSELTITMNHKDCDPWREEYFSVLNKVATSGFFTGENRYQMSKVCTLNFEIKCNNKGSSSKQLTKAKNDDG層HSETVTLVGDCLSSVDIY1LYSNTNTQDYETDTISYHAGNVLDVDSHMPGSCDIHKIJTNSKPTHFLSEQIDNO:54TNFR2同系物蛋白的全长序列(猴痘病毒)GenBank登记号DQ011155348个氨基酸逢SVLYSYILFLSC画GRDLAPHAPSNGKCKDNEYRSKNLCCLSCPPGTYASRLCDSKTNTQCTPCGSDTFTSHNNHLQACLSCNGRCDSNQVETRSCNTTHNRICECSPGYYCLLKGSSGCRTCISKTKCGIGYGVSGYTSTGDVICSPCGPGTYSHTVSSTDKCEPVTSNTFNYIDVEINLYPVNDTSCTRTTTTGLSESISTSEUnTMNHKDCDPWRAEYFSVLNNVATSGFFTGENRYQNTSKICTLNF孤CNNKDSSSKQLTKTKNDTIMPHSETVTLVGDCLSSVDlYILYSNTNTQDYETDTISYHMGNVLDVNSHMPASCDIHKLrTNSQNPTHLSEQEDNO:55G2R蛋白的全长序列(类天花病毒)GenBank登记号U88151349个氛基酸MKSVLYLYILFLSCGRDAAPYTPPNGKCKDTEYKRHNLCCLSCPPGTYASRLCDSKTNTQCTPCGSGTFTSRNNHLPA(XSCNGRCNSNQVETRSCNTTHNRICECSPGYYCLLKGSSGCKACVS(2TKCGIGYGVSGHTSVGDVICSPCGFGTYSYTVSSTDKCEPWNNTFNYIDVEITLYPVNDTSCTRTTTTGLSESILTSELTITMNHTDCNPWREEYFSVLNKVATSGFFTGENRYQNISKYCTLNFEIKCNNKGSSFKQLTKAKNDDGMMSHSETVTLAGDCLSSVDIYILYSNTNAQDYETDTISYRVGNVLDDDSHMPGSCDIHKLITNSKPTRFLSEQIDNO:56假定蛋白的全长序列(空肠弯曲杆菌RM1221)GenBank登记号CP000025547个氨基酸MKHXLNENPWSRLVSLSAKKMSYDFEELNAYSENLGNYDVIVVDSDTP肌KILKEKCDRLIFLAPRNQNVEDIDAQILQKPFLPTDHLNIXNNKDANKHTSIDLPMLSNDENPYADISLDLDNLNLDDLPDENSL画SEGMEDLSFDDDAQDDNANKTLETQNLEHDNLEQETKEQTQEDTQTDLDLTLEDSESEKEDLSQEHTALDTEPSLDELDDKNDEDLEIKEDDKNEE正KQELLDDSKTNTLEMQEELSESQDDNANKTLETQNLEHDNLEQETKJ3QTQEDTQTDLDLTLEDGESEKEDLSQEHTALDTEPSLDELDDKNDEDLEDNKELQ扁SDFDDLPEVEEQEKEMDFDDLPEDAEFLGQAKYNEESEENLEEFAPVVEEDVQDEIDDFASNLSTQDQIKEEIAQLDELDYGIDSDNSSKVLEDFKDEPILDDKELGTNEEEWWNLNISDFDTLKESDIQEALGEEILEKNEEPIVSDVTKDDNSEmVNELSQSIAGAITSSKDDTLKAALKGMNMNININISFKEDSEQIDNO:57假定蛋白的全长序列(布氏锥虫)GenBank登记号AC091702496个氨基酸MLRCRVADWSSDQMCEMTOFPPVQATVGYVQLLRRLSFKREFFVTFWTKHVIFTFQTKNPLEEGKVKDEVTDLVSHYFNWIRERGVYSFQILQLYVCILSGCTVVVIECPDTLTTLDVHSFSQEPEAPTVGKRRVLVFPCDNDEISDSELESNYYIVPTCTLCAERLEPTLTGYSSPTCSCVDGRECRCLLEQSSCWCQTSITMQHESQKVQCEQCSRTGDPWICLVCGYVGCSRYQAKHAREHYLQHKHLFSMSLLTQQIWDYDSDAFVHRVVVLLDNATGAVNRVQYPDRDNIPSSLADEYVDAAAEKVSKKHINAKEDSKVETSNEQLALMnSBLNTRRVEYETEMHGGSHHLNDELMGDPSLCSVIVAERACAASRERWWQLHNANECSIQEELMQRRREEEAHQKTIDELQQELRSVVQHYATREYSLLTEINELRQTITDVETNLRTFAKLSRGLGNDTLEHVRIVGGTKEPKPKRRGGNNTRDGRASE(2IDNO:58假定蛋白的全长序列(金黄色葡萄球菌)GenBank登记号BA000017680个氨基酸MEIFETttJFIAWILSSFVHTFIPKVPLAFIQIFLGMLLFITPIPVQFNFDSELFMVTMIAPLLFVEGVNVSRVHLRKYIKPVMMMALGL曹TVIGVGLFmWIWPDLPIGAAFAIAAILCPTDAVAVQAITKGKVLPKGAMTILEGESLLNDAAGIISFKIAVGVLVTGAFSLVDAVQLFLIASIGGAWGLLIGMALVRFRLTLMRRGYENINMFTnQLLTPFVTYLIAELFHASGIIAAVVAGLVHGFERDRIMQVRTQLQMSYNHTWNILGYVLNGFVFSILGFLVPEVHKUKTEPHNLIFUGmVVALAVYLFRFVWVYVLYPYFYLAISPFQKMMTKNDDDNPTTEKPPKRSLYAL]MTLCGVHGTISLAIALTLPYFLAGHHAFTYRNDLLFIASGMVnSLWAQVLLPLLTKPAPKTVIGNMSFKVARIYILEQVIDYLNQKSTFETSFKYGNVKEYHDKLAFLKTVEKDDENSKELERLQKIAFNVETKTLESLVDEGQITNSVLENYMRYAERTQVYRQASLIRRMIVLLRGALLKRRVQTRVNSASSLSVTDNLMELNKINKLVHYNWSRLSKETTKDNTLEIGMVCDGYLMRIENLTPSNFFNSASEDTITK1KLNALREQRRILREIJDTDEVSEGTALKLREAINYDEMVIVDSMTSEQIDNO.59MSPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGLEFPNLPYYIDGDVKLTQSMAnRYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGVSRIAYSKDFETLKVDFLSKLPEMLKMFEDRLCHKTYLNGDHVTHPDFMLYDALDWLYMDPMCLDAFPKLVCFKKRIEAIPQIDKYLKSSICYIAWPLQGWQATFGGGDHPPKSDLVPRGSPEFLVPHLGDREKRDSVCPQGKYIHPQNNSICCTKCHKGTYLYNDCPGPGQDTDCREFPGRLERPHRDSEQIDNO:60MSPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGLEFPNLPYYIDGDVKLTQSMAHRYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGVSRIAYSKDFETLKVDFLSKLPEMLKMFEDRLCHKTYLNGDHVTHPDFMLYDALDWLYMDPMCLDAFPKLVCFKKRIEAIPQIDKYLKSSKYIAWPLQGWQATIOTCm丁SDTVCDEFPGRLERPHRDSEQIDNO.61TCCATGACGTTCCTGATGCT权利要求1.一种38个至125个氨基酸的多肽，包括TNF受体样受体的前配体装配域(PLAD)的分离的氨基酸序列。2.权利要求1的多肽，其中所述PLAD选自TNF-R的PLAD、p60的PLAD、p80的PLAD、Fas(CD95/APO-1)的PLAD、TRAIL的PLAD、LTPR的PLAD、CD40的PLAD、CD30的PLAD、CD27的PLAD、HVEM的PLAD、0X40的PLAD、DR4的PLAD、NGFR的PLAD、Troy的PLAD、EDAR的PLAD、XEDAR的PLAD、DcR3的PLAD、AITR的PLAD、4-1BB的PLAD、DR3的PLAD、RANK的PLAD、TACI的PLAD、BCMA的PLAD、DR6的PLAD、OPG的PLAD、DRS的PLAD、DcRl的PLAD和DcR2的PLAD。3.—种由TNF受体样受体的前配体装配域的M酸序列组成的多肽。4.一种包括TNF受体样受体的前配体装配域(PLAD)的分离的M酸序列的多肽，其中所述多肽为R广TNF受体样受体PLAD-R2，其中R:或112包括在天然存在的TNF受体样受体中不位于TNF受体样受体PLAD侧翼的氨基酸序列。5.权利要求1的多肽，其中所述多肽为R厂TNF受体样受体PLAD-R2,其中Ri为H、酰基、NH2、絲酸或肽，R2为H、醃基、NH2、絲酸或肽。6.权利要求1的多肽，其中所述多肽为R广p60的氮基酸1-54(SEQIDN0:1)-R2，其中&为H、酰基、NH2、絲酸或肽，112为H、酰基、NH2、氨基酸或肽。7.权利要求1的多肽，其中所述多肽为R广p80的氨基酸10-54(SEQIDN0:2)-R2,其中K为H、酰基、NH2、絲酸或肽，112为H、酰基、NH2、氨基酸或肽。8.权利要求1的多肽，其中所述多肽为R广Fas的氨基酸1-43(SEQIDN0:3)-R2，其中Ri为H、絲、NH2、絲酸或肽，112为H、喊、冊2、氨基酸或肽。9.权利要求1的多肽，其中所述多肽为R广Fas的氨基酸1-66(SEQIDN0:4)-R2,其中l为H、絲、NH2、絲酸或肽，112为H、、NH2、氨基酸或肽。10.权利要求1的多肽，其中所述多肽为R「LTPR的氨基酸13-50(SEQIDN0:5)-R2,其中Ri为H、酰基、NH2、絲酸或肽，112为H、酰基、NH2、氨基酸或肽。11.权利要求1的多肽，其中所述多肽为Ri"CD40的氨基酸6-39(SEQIDN0:6)-R2，其中Ri为H、酰基、NH2、絲酸或肽，112为H、酰基、NH2、氨基酸或肽。12.权利要求1的多肽，其中所述多肽为R「CD30的氨基酸11-51(SEQIDN0:7)-R2，其中&为H、酰基、NH2、絲酸或肽，112为H、酰基、NH2、氨基酸或肽。13.权利要求1的多肽，其中所述多肽为R「CD27的氨基酸7-42(SEQIDN0:8)-R2,其中R!为H、錄、丽2、絲酸或肽，112为H、絲、NH2、氨基酸或肽。14.权利要求1的多肽，其中所述多肽为R广HVEM的氨基酸6-37(SEQIDN0:9)-R2，其中&为H、酰基、丽2、絲酸或肽，112为H、酰基、NH2、氨基酸或肽。15.权利要求1的多肽，其中所述多肽为R广0X40的氨基酸3-36(SEQIDN0:10)-R2，其中&为H、絲、冊2、絲酸或肽，！^为H、綠、NH2、絲酸或肽。16.权利要求1的多肽，其中所述多肽为R广DR4的氨基酸109-138(SEQIDN0:11)-R2，其中Ri为H、絲、NH2、絲酸或肽，112为H、綠、NH2、絲酸或肽。17.权利要求3的多肽，其中所述PLAD选自頂F-R的PLAD、Fas(CD95/AP0-1)的PLAD和TRAIL的PLAD。18.—种编码权利要求1的多肽的分离的核酸。19.权利要求18的分离的核酸，所述核酸在载体中。20.—种适合用于在宿主中表ii^利要求19所述核酸的载体。21.—种通*予有效量的权利要求1或3的多肽来抑制细胞中TNF受体寡聚化的方法。22.—种通it^予有效量的权利要求1或3的多肽来抑制细胞中Fas寡聚化的方法。23.—种通it^予有效量的权利要求1或3的多肽来抑制TNF受体样受体与配体结合的方法。24.—种通*予有效量的权利要求1或3的多肽来抑制Fas与配体结合的方法。25.—种通it^予有效量的权利要求1或3的多AUM台疗受试者体内炎症的方法。26.权利要求25的方法，其中所述炎症与自身免疫性疾病相关。27.权利要求25的方法，其中所述炎症与类风湿性关节炎、骨关节炎或l^毒性关节炎相关。28.—种包括PLAD締^^抑制剂的组合物。29.权利要求25的方法，其中所述抑制剂为与TNF受体样受体的PLAD特异性结合的抗体。30.权利要求25的方法，其中所述抑制剂为TNF受体样受体的PLAD。31.权利要求30的方法，其中所述可溶性PLAD为p60的PLAD。32.—种筛选PLAD締^^抑制剂的方法，包括a)用以下两种质粒转染同一细胞，其中一种质粒含有的核酸包括编码与荧光供体功能性连接的分离的PLAD的核酸序列，另一种质粒含有的含有编码与荧光受体功能性连接的分离的PLAD的核酸序列；b)将所述细胞与假定的抑制剂相接触；并且c)测量FRET，其中同未与所述假定抑制剂接触的细胞中的FRET测量结果相比，FRET下降表明存在PLAD締合抑制剂。v33.—种筛选PLAD締合抑制剂的方法，包括a)用以下两种质粒转染同一细胞，其中一种质粒含有包括编码一种分离的PLAD的核酸序列的核酸，另一种质粒含有编码另一种分离的PLAD的核酸序列；b)将所述细胞与假定的抑制剂相接触；c)测量PLAD的自締合，其中同未与所述假定的抑制剂接触的细胞中的PLAD締合相比，步骤b)细胞中PLAD締合的减少表明了存在PLAD締合抑制剂。全文摘要本发明提供了一种包括TNF受体样受体的前配体装配域(PLAD)的分离的氨基酸序列的多肽。本发明还提供了一种包括一种前配体装配域(PLAD)的分离的氨基酸序列的多肽，其中所述PLAD选自TNF-R的PLAD、p60的PLAD、p80的PLAD、Fas(CD95/APO-1)的PLAD、TRAIL受体的PLAD、LT/βR的PLAD、CD40的PLAD、CD30的PLAD、CD27的PLAD、HVEM的PLAD、OX40的PLAD和DR4的PLAD。TNF-R、p60、p80、Fas、TRAIL受体、LT/βR、CD40、CD30、CD27、HVEM、OX40、DR4、TROY、EDAR、XEDAR、DCR3、AITR、4-1BB、DR3、RANK、TACI、BCMA、DR6、DPG、DR5、DCR1和DCR2全部为TNF受体超家族或TNF样受体家族的成员。本发明还提供了TNF受体超家族其它成员的PLAD。本发明的多肽可被用于抑制TNF受体超家族成员的寡聚化。这些多肽也可被用于抑制TNF受体超家族成员的配体结合。本发明还提供了一种包括TNF受体寡聚化抑制剂的组合物。本发明进一步提供了缺少PLAD的TNF受体超家族成员。文档编号C07K14/435GK101273060SQ200680029841公开日2008年9月24日申请日期2006年6月26日优先权日2005年6月24日发明者F·K-M·陈,G-M·邓,L·郑,M·莱纳多申请人:美国政府(由卫生和人类服务部、国立卫生研究院的部长所代表)