转铁蛋白受体TfR特异性结合肽及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种转铁蛋白受体TfR特异性结合肽CPU-312-03及其应用。CPU-312-03的结合肽序列为GLSRAHQ，核苷酸序列为GGGCTTTCTCGGGCTCATCAG。体外实验表明该结合肽能与高表达转铁蛋白受体TfR的细胞结合，并能将耦连的异硫氰酸荧光素(FITC)靶向转入细胞，因此本发明所述的结合肽可用于以转铁蛋白受体TfR为靶点的药物靶向载体，对肿瘤靶向药物的开发，脑源性疾病的靶向治疗和以转铁蛋白受体TfR为目标的预测、诊断肿瘤的发生发展具有重要意义。
【专利说明】转铁蛋白受体TfR特异性结合肽及其应用
【技术领域】
[0001 ] 本发明属于一种转铁蛋白受体TfR抗体，特别涉及一种转铁蛋白受体TfR特异性结合肽及其应用。
【背景技术】
[0002]目前已知两种不同类型的转铁蛋白受体即转铁蛋白受体I(TfRl)和转铁蛋白受体 2 (TfR2)。
[0003]TfRl在许多细胞中都表达，如红血细胞、肝细胞、单核细胞和血脑屏障。TfRl是由同源二聚体通过两条二硫键交联而成。每个单体含760个氨基酸，分子量为90~95kDa，包含一个大的胞外C端区域(671个氨基酸)，一个单跨膜区域(28个氨基酸)及一个短的N端区域(61个氨基酸)。C端区域是一个外功能区，它包含转铁蛋白(Tf)的结合位点，三个N连接糖基化位点及一个O连接糖基化位点，这些位点的糖基化作用是TfRl功能所必需的。TfRl能够根据环境pH的变化而改变构像，并把构像变化结果转换为对转铁蛋白结合力强弱的变化。
[0004]TfR2 是一种II型跨膜糖蛋白，是Kawa-bata从Tf细胞和HL-60细胞cDNA文库中克隆出的TfRl同源基因，同TfRl有45%的相同序列，胞外区域同TfRl有66%的相似性，但TfR2与转铁蛋白的亲和性较低，比TfRl低25倍。TfR2主要在肝脏表达，其mRNA编码和非编码区域缺乏调控铁离子成分，这就表明TfR2的表达不是由铁离子响应蛋白反馈机制来调控的。
[0005]转铁蛋白受体TfR的功能是通过与转铁蛋白的相互作用介导铁的吸收。生理pH下，转铁蛋白受体TfR与带两个Fe3+的转铁蛋白亲和力最高，与带一个Fe3+的转铁蛋白亲和力次之，与不带Fe3+的转铁蛋白亲和力最小，带有两个Fe3+的转铁蛋白对转铁蛋白受体TfR的亲和力是脱铁转铁蛋白的10~100倍。在内含体中pH的下降促进了转铁蛋白构象的改变，随后转铁蛋白释放Fe3+，脱铁转铁蛋白和转铁蛋白受体TfR的亲和力降低。
[0006]研究显示鼻咽癌、胃癌、肝癌、血液系统肿瘤等多种恶性肿瘤细胞与它们的正常组织相比，转铁蛋白受体呈现高表达情况，并且转铁蛋白受体TfR的表达常常与细胞增殖活动有关。胃癌患者血清转铁蛋白受体TfR水平较良性胃病病人及正常人明显增高，同时II1、IV期肿瘤病人的转铁蛋白受体TfR也明显高于1、11期肿瘤病人。说明转铁蛋白受体TfR的表达增加使肿瘤细胞获得了异常的增殖活性。此外，转铁蛋白/转铁蛋白受体系统可通过胞吞作用提高生理屏障如肠道黏膜、血脑屏障对药物的通透性。血脑屏障的转铁蛋白受体TfR被认为几乎完全被转铁蛋白饱和，转铁蛋白作为药物脑靶向载体受到限制。然而，由于转铁蛋白受体TfR抗体与转铁蛋白受体的结合位点和转铁蛋白与转铁蛋白受体的结合位点不同，且不相互干扰，因而可采用转铁蛋白受体TfR的抗体进行药物转运。偶联有药物的抗大鼠转铁蛋白受体的单克隆抗体(0X26)可由转铁蛋白受体TfR介导内吞，跨过血脑屏障进行转运，并且0X26显示出较强的进入中枢神经系统的能力。
[0007]噬菌体展示技术由Smith于1985年创建，以改构的噬菌体为载体，把待选基因片段定向插入噬菌体外壳蛋白质基因区，使外源多肽或蛋白质表达并展示于噬菌体表面，进而通过亲和富集法表达有特异肽或蛋白质的噬菌体。其建立基于三点:(I)在PlII和PVIII衣壳蛋白的N端插入外源基因，形成的融合蛋白表达在噬菌体颗粒的表面，不影响和干扰噬菌体的生活周期，同时保持外源基因天然构象，也能被相应的抗体或受体所识别；(2)利用固定与固相支持物的靶分子，采用适当的淘洗方法，洗去非特异结合的噬菌体，筛选出目的噬菌体；(3)外源多肽或蛋白质表达在噬菌体的表面，而其编码基因作为病毒基因组中的一部分可通过分泌型噬菌体的单链DNA测序推导出来。该技术实现了基因型和表型的转换，已越来越广泛地用于抗原表位分析、蛋白质一蛋白质相互作用位点分析、酶作用底物的分析、寻找具有生物功能的蛋白的模拟肽、先导化合物的发现、分离与鉴定疾病特异性抗原模拟肽、筛选细胞和器官特异性结合肽、研究蛋白质与核酸结合特性、定位信号转导途径等。
[0008]小分子多肽结构简单穿透肿瘤组织的能力强，且不易被免疫系统所排斥，因此有很大的潜力作为良好的药物靶向载体。同时多肽长效化手段日益丰富，使得多肽在体内稳定性增加，半衰期延长。
【发明内容】
[0009]本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种转铁蛋白受体TfR特异性结合肽。发明的另一目的在于提供所述转铁蛋白受体TfR特异性结合肽的应用。
[0010]本发明的目的通过下述技术方案实现:一种转铁蛋白受体TfR特异性结合肽，其氨基酸序列为 Gly Leu Ser Arg Aal His Gln,即 GLSRAHQ ；
[0011]所述转铁蛋白受体TfR特异性结合肽的核苷酸序列如下:GGGCTTTCTCGGGCTCATCAG ;一种转铁蛋白受体TfR特异性结合肽，其特征在于:所述结合肽的氨基酸序列如Seq N0.1。
[0012]所述的转铁蛋白受体TfR特异性结合肽在药物靶向肿瘤的应用。
[0013]所述的转铁蛋白受体TfR特异性结合肽在药物靶向肿瘤中的应用，其特征在于肿瘤表面高表达转铁蛋白受体TfR。所选肿瘤为肝癌或乳腺癌。
[0014]所述的转铁蛋白受体TfR特异性结合肽在透血脑屏障药物中的应用。
[0015]所述的转铁蛋白受体TfR特异性结合肽在转铁蛋白受体TfR检测中的应用。
[0016]本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:本发明所述转铁蛋白受体TfR特异性结合肽通过噬菌体展示技术获得，是全新序列。易于通过生物及化学方法合成构建。生物信息学技术表明该结合肽能与转铁蛋白受体TfR结合，体外实验表明该结合肽能与高表达转铁蛋白受体TfR的细胞结合，并能将耦连的异硫氰酸荧光素(FITC)转入胞内，可用来作为药物载体以及转铁蛋白受体TfR的检测。因此本发明所述的结合肽可用于以转铁蛋白受体TfR为靶点的肿瘤靶向药物的开发，脑源性疾病的靶向治疗，并且对以转铁蛋白受体TfR为目标的肿瘤发生发展的预测、诊断具有重要意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]图1是转铁蛋白受体TfR与结合肽形成的复合物模型
[0018]图2是转铁蛋白受体TfR与结合肽相互作用的氨基酸残基[0019]图3荧光酶标仪检测H印G2细胞对耦连FITC结合肽和FITC的摄取实验
[0020]图4荧光酶标仪检测L02细胞对耦连FITC结合肽和FITC的摄取实验
[0021]图5是荧光显微镜观察HepG2细胞对耦连FITC结合肽的吞噬实验
[0022]图6是荧光显微镜观察IfepG2细胞对FITC的吞噬实验
[0023]图7是荧光显微镜观察L02细胞对耦连FITC结合肽的吞噬实验
【具体实施方式】
[0024]以下实施例所用材料和 仪器设备为:
[0025]实施材料:大肠杆菌ER2738 (美国New England Biolabs公司)、噬菌体随机7肽库(美国New England Biolabs公司)、转铁蛋白受体(德国CalBiochem公司)、HRP-M13抗体(GE Healthcare公司)、RPM1-1640 (Gibco公司)、小牛血清(Gibco公司)、膜蛋白酶(Gibco 公司。
[0026]下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0027]实施例1
[0028]通过噬菌体展示的方法，得到转铁蛋白受体TfR特异性结合肽CPU-312-03:
[0029](1)通过噬菌体随机肽库的筛选，得到转铁蛋白受体TfR特异性结合肽CPU-312-03的核苷酸序列:
[0030]A.噬菌体随机7肽库的生物淘洗:用包被液(0.1M NaHC03，pH8.6)将转铁蛋白受体TfR稀释至100 μ g/ml,加入150ul至酶标板的一个孔中，反复旋转直到表面完全湿润,保持湿润状态，4°C过夜。倒掉包被液，拍板除去残液，加满封闭液(0.1M NaHC03，pH8.6，5mg/ml BSA)，4°C 至少作用一个小时。倒出封闭液，用 0.1 % TBST [TBS+0.1% (v/v) Tween-20]洗
6次，每次拍板。用IOOyl TBST稀释10 μ l原始噬菌体肽库，加入用转铁蛋白受体TfR包被的孔中，室温温育1小时，倾倒未结合的噬菌体，用0.1% TBST冲洗10次，每次拍板。然后加入 100 μ l 洗脱液[0.2Μ Glycine-HCl (ph2.2)，lmg/mLBSA]室温轻微震荡 15min,吸出洗脱液，再用15 μ l的IM Tris-HCL中和上述洗脱液。吸取I μ l已中和的洗脱液测定滴度，其余液体加入20mlLB培养基(含20 μ l四环素+200 μ I过夜培养的菌液)，37°C，225rpm培养5小时；离心扩增噬菌体，40C，12000g离心10分钟，将上清的80%转入一新离心管中，加入1/6体积的PEG8000/NaCl，让噬菌体4°C沉淀过夜；离心噬菌体，12000g, 15分钟，4°C。倒掉上清，吸取残余溶液。加Iml TBS重悬沉淀，转入微量离心管中。4°C，14000rpm离心5分钟使残余细胞沉淀。上清转入另一微量离心管中，加1/6体积的PEG8000/Nacl，冰浴lh。4°C，14000rpm离心10分钟，弃上清，沉淀用200 μ ITBS重悬。离心Imin沉淀任何不能溶解的物质，上清转入一新的微量离心管中，此即扩增噬菌体。按以上步骤进行第2，3轮筛选，每筛选一轮减少转铁蛋白受体TfR的包被浓度，改为50 μ g/ml和30 μ g/ml，结合时加2X1011的上一轮洗脱扩增物，洗脱时用游离转铁蛋白受体TfR分子(100gy g/ml溶于TBS)竞争洗脱结合噬菌体，改用5% TBST进行洗涤，提高筛选的特异性。
[0031]B.噬菌体滴度测定:用LB培养基稀释噬菌体，未扩增噬菌体稀释范围JO1-1O4,扩增后噬菌体稀释范围:IO8-1O11tj取10 μ I上述稀释的噬菌体，加入200 μ I对数中期ER2738中，作用2分钟，将得到的感染菌体加入3ml液体上层琼脂中混匀，均匀铺在预热的IPTG/Xgal/Tet平板上，37°C倒置避光过夜，计算平板上的蓝色噬菌斑数量，稀释倍数乘以噬菌斑数量即为噬菌体滴度。
[0032]C.噬菌斑的扩增:测定第三轮未扩增的噬菌体滴度，300μ I过夜培养物，30μ ITet, 30mlLB液体培养基混匀后分成30个试管中，每个试管1ml，每个试管挑取一个蓝斑加入，37°C摇床培养5小时，培养物转入微量离心管中，离心30秒，上清转入新的离心管中再离心，将80 %上清转入新的离心管中，此即为扩增的噬菌体贮液，4V贮存。
[0033]D.ELISA鉴定阳性噬菌体克隆:取5 μ I步骤C中所得的噬菌体贮液，加入20mlLB培养基(含20 μ I四环素，200 μ I过夜培养的菌液)中，37°C培养4.5小时，离心扩增噬菌体，4°C 12000g离心10分钟，将上清的80%转入一新离心管中，加入1/6体积的PEG8000/NaCl，让噬菌体4°C沉淀过夜；离心噬菌体，12000g, 15min，4°C。倒掉上清，吸取残余溶液。加Iml TBS重悬沉淀,转入微量离心管中。离心，4°C, 14000rpm, 5min使残余细胞沉淀。上清转入另一微量离心管中，加1/6体积的PEG8000/NaCl,冰浴lh。离心，4°C, 14000rpm, IOmin,弃上清，沉淀重悬于50μ I TBS中，此即为扩增的噬菌体贮液，测定滴度，准备进行ELISA鉴定。 [0034]准备100 μ g/ml的转铁蛋白受体TfR分子(溶于0.1M NaHCO3, PH8.6)。对于30个待鉴定的噬菌体设置4个噬菌体梯度，每个梯度3个孔，并设置未包被空白孔为阴性对照，包被好的酶标板放置4°C过夜。吸出多余靶分子溶液，加入封阻液，4°C作用I小时，阴性对照同样封闭。甩出封阻液，用0.5% TBST洗板6次，取步骤C中扩增的噬菌体，稀释四个数量梯度(分别为109，101Q，10n，IO12Pfu),加入包被好的孔中，室温作用I小时。用0.5%TBST洗板6次，加入I: 5000稀释HRP-M13抗体，作用I小时。用0.5% TBST洗板6次，加入OPD显色液，显色30分钟后加入2M H2SO4终止反应。选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔吸收值，记录结果。以OD值高于阴性对照2.1倍作为阳性克隆。
[0035]E.阳性噬菌体单链DNA的提取及测序:取500 μ I上述噬菌体贮液，加200 μ lPEG8000/NaCl放置10分钟，HOOOrpm离心10分钟，弃上清，沉淀重悬于100 μ I碘化物缓冲液中，加250 μ I乙醇，室温作用10分钟，HOOOrpm离心10分钟，弃上清，用70%乙醇洗沉淀，短暂真空干燥。沉淀重悬于30μ1 TE(IOmMTris-HCl,ImMEDTA)中，取上述溶液测序。本次测序由金维智生物科技有限公司完成。
[0036](2)将得到的测序结果翻译，选取Elisa阳性值高(0.834,0.717)且核苷酸序列一致的序列得到结合肽CPU-312-03，并送至宁波康贝生化有限公司合成并标记荧光探针，其核苷酸序列为Seq N0.2，氨基酸序列为Seq N0.1。
[0037]实施例2
[0038]用计算机模拟转铁蛋白受体TfR与结合肽的结合:
[0039]用zDock对接软件建立出转铁蛋白受体TfR与结合肽的模型,然后用discoverystudio2.5(DS2.5)软件模拟转铁蛋白受体TfR与结合肽的结合情况，转铁蛋白受体TfR与结合肽形成的复合物模型如图1，其中条形部分表示转铁蛋白受体TfR，球形部分表示结合肽。图2为用软件模拟出的转铁蛋白受体TfR与结合肽相互作用的氨基酸残基。结果显示结合肽包裹在与转铁蛋白受体TfR结合的结合区域，其中转铁蛋白受体TfR的533，559位谷氨酸(GLU533，GLU559)，538，560，562 位天冬氨酸(ASP538，ASP560，ASP562)，与结合肽的精氨酸(ARG4)，组氨酸(HIS6)之间紧密相互作用。[0040]实施例3
[0041]荧光酶标仪检测细胞对耦连FITC结合肽和FITC的摄取实验:
[0042]取对数生长期的HepG2细胞(肝癌细胞)，用适量0.25%胰酶溶液消化，轻摇使消化液均匀作用于细胞，当成片细胞圆缩、呈单个细胞状态时，迅速加入适量含10%小牛血清的RPM1-1640培养基，用吸管轻轻吹打使成单细胞悬液；每孔加入8X IO4个细胞于24孔板中，并加500 μ I含10%血清的RPM1-1640培养基，于37°C、含5% CO2的恒温培养箱中培养24小时至单层细胞状态；于检测前lh，2h，3h，4h分别加入500μ I含10%小牛血清、50um耦连FITC结合肽的RPM1-1640培养基，每个时间点3个复孔，置于37°C、5% CO2恒温培养箱中培养；同时以FITC和L02细胞(正常肝细胞)作为阴性对照，用荧光酶标仪检测荧光(λ ex = 485nm, Aem = 528nm)。检测荧光时吸出上述培养基，用PBS洗涤2次。实验结果如图3和图4所示，图3中CPU-312-03-FITC系列为H印G2细胞摄取耦连FITC结合肽测得的时间(h)-荧光强度值(AU)曲线，FITC系列为HepG2细胞摄取FITC测得的时间(h)_荧光强度值(AU)曲线。从图3中可以看出前者的荧光强度高于后者，说明FITC和多肽耦连后，可通过转铁蛋白受体介导细胞对CPU-312-03-FITC的内吞作用，与细胞对FITC的非特异性的内吞作用相比，摄取量大大提高。图4中HepG2系列为HepG2细胞摄取耦连FITC结合肽测得的时间(h)-荧光强度值(AU)曲线，L02系列为L02细胞摄取耦连FITC结合肽测得的时间(h)-荧光强度值(AU)曲线，2h之后，高表达转铁蛋白受体TfR的H印G2细胞荧光强度值明显高于低表达转铁蛋白受体TfR的L02细胞荧光强度值，转铁蛋白受体TfR表达水平提高可提高细胞对结合肽的摄取，说明该短肽具有与高表达转铁蛋白受体TfR肿瘤细胞的靶向结合力，并且能将异硫氰酸荧光素(FITC)靶向细胞。[0043]实施例4
[0044]荧光显微镜观察细胞对耦连FITC结合肽和FITC的吞噬实验:
[0045]取对数生长期的!fepG2细胞(肝癌细胞)，用适量0.25%胰酶溶液消化，轻摇使消化液均匀作用于细胞，当成片细胞圆缩、呈单个细胞状态时，迅速加入适量含10%小牛血清的RPM1-1640培养基，用吸管轻轻吹打使成单细胞悬液，每孔加入8 X IO4个细胞于24孔板中，并加500μ I含10%血清的RPM1-1640培养基，于37°C、含5% CO2的恒温培养箱中培养24小时至单层细胞状态，每孔加入500 μ I含10%小牛血清、50um耦连FITC结合肽的RPM1-1640培养基，3个复孔，置于37°C，5% CO2恒温培养箱中培养；同时以FITC和L02细胞(正常肝细胞)作为阴性对照。4h后吸出上述培养基，用PBS洗涤2次，用荧光显微镜观察并拍照。实验结果如图5、图6、图7所示，图5为HepG2细胞对耦连FITC结合肽的吞噬情况，图6为H印G2细胞对FITC的吞噬情况，图7为L02细胞对耦连FITC结合肽的吞噬情况，说明在相同时间相同浓度的情况下，耦连FITC结合肽更容易被H印G2细胞摄取，该结合肽能与转铁蛋白受体TfR相互作用而使细胞吞噬的FITC更多。
[0046]以上实验结果表明，本发明所述的转铁蛋白受体TfR特异性结合肽CPU-312-03，能与转铁蛋白受体TfR及高表达转铁蛋白受体TfR的细胞结合，并且能将FITC靶向细胞，有转运物质靶向细胞的能力。对以转铁蛋白受体TfR为靶点的肿瘤靶向药物的开发，脑源性疾病的靶向治疗和以转铁蛋白受体为目标的肿瘤发生发展的预测、诊断具有重要意义。
[0047]上述为示例性的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，本领域的研究及技术人员应该理解其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的各种形式和细节的改变、 修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种转铁蛋白受体TfR特异性结合肽，其特征在于:所述结合肽的氨基酸序列如SeqN0.1。
2.如权利要求1所述的一种转铁蛋白受体TfR特异性结合肽，其特征在于:所述结合肽的核苷酸序列如Seq N0.2。
3.如权利要求1所述的转铁蛋白受体TfR特异性结合肽在制备靶向肿瘤药物中的应用。
4.如权利要求3所述的转铁蛋白受体TfR特异性结合肽在制备靶向肿瘤药物中的应用，其特征在于所述的转铁蛋白受体TfR是肿瘤表面高表达转铁蛋白受体TfR。
5.如权利要求1所述的转铁蛋白受体TfR特异性结合肽在制备透血脑屏障药物中的应用。
6.如权利要求1所述的转铁蛋白受体TfR特异性结合肽在转铁蛋白受体TfR检测中的应用。
【文档编号】G01N33/68GK103897033SQ201410123564
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2014年3月31日 优先权日:2014年3月31日
【发明者】刘煜, 甘牡丹, 顾梦月, 邵明, 叶靖宇 申请人:中国药科大学