专利名称：特异性结合epha2受体的抗体的制作方法
特异性结合EPHA2受体的抗体本发明涉及特异性结合EphA2受体的抗体或其表位结合片段。它进一步涉及包含与抗体共价结合的细胞毒剂的缀合物及用于制备此类缀合物的方法。
背景技术：
癌症是一种以源自异常信号转导的不受控制的增殖为特征的疾病。最危险的癌症形式是恶性细胞，其具有通过经由侵入而直接生长入相邻组织中，或者通过转移而植入远距离部位中，从而扩散的能力。转移细胞已经获得了从原发性肿瘤脱离，经由血流或淋巴系统移位到远距离部位并在远距离的且无关的微环境形成集落的能力。现在清楚的是，Eph分子牵涉疾病状态诸如癌症。Eph受体是一种在基因组中最大的独特的受体酪氨酸激酶(RTK)家族，其由与8种膜结合肝配蛋白配体相互作用 的 14 种受体组成，分成两组 A 和 B(Pasquale, E. B.等，2005，Nature Reviews Mol. CellBiol. ,6:462-475)。Eph受体对其配体的结合诱导受体聚簇，激活激酶活性，随后对酪氨酸残基进行胞质域的反式磷酸化，为许多信号传导蛋白质创建对接位点(docking site)(Kullander,K 和Klein, R.，2002，Nature Reviews Mol. Cell Biol.,3:475-486;Noren, N.K.和 Pasquale, E. B.，2004，Cell signal.，16:655-666)。已经在卵巢、乳腺、前列腺、肺、结肠、食管、肾细胞、宫颈癌和黑素瘤中报告了EphA2受体的过表达。提示了 EphA2是恶性细胞的细胞生长和存活的正调节物(Landen，C.N.等,2005, Expert. Opin. Ther. Targets, 9 (6) : 1179-1187)。还已经描述了 EphA2 在癌症中的作用，因为单独的EphA2过表达足以将乳腺上皮细胞转化成恶性表型(Zelinski等，2001，Cancer Res.，61:2301-2306),而且提高对远距离部位的自发转移(Landen, C.N.等,2005, Expert. Opin. Ther. Targets, 9 (6) : 1179-1187)。此外，越来越多的证据提不了 EphA2 牵涉肿瘤血管生成(Ogawa 等，2000，Oncogene, 19:6043-6052; Cheng 等2002, Mol. Cancer Res. , 1:2-11;Cheng 等,2003,Neoplasia, 5(5):445-456;Dobrzanski等，2004，Cancer Res.，64:910-919)。已经显示了 EphA2的磷酸化与其丰度相关联。酪氨酸磷酸化的EphA2被快速内在化，并且注定要进行降解，而未磷酸化的EphA2被证明翻转(turnover)降低，并且因此在细胞表面积累。目前认为此种模型可以促成癌症中高频率的EphA2过表达(Landen，C.N.等，2005, Expert. Opin. Ther. Targets, 9 (6) : 1179-1187)。然而，事实可能更复杂，因为最近的数据似乎指示EphA2激酶依赖性和不依赖性功能在肿瘤进展中的作用(Fang ff. B.，2005, Oncogene, 24:7859-7868)。已经开发出激动性抗体，其促进EphA2酪氨酸磷酸化和内在化，最终导致对肿瘤细胞生长的抑制(Dodge-Zantek 等,1999, Cell Growth&Differ, 10:629-638;WO01/12172,WO 03/094859, WO 2004/014292, WO 2004/101764,WO 2006/023403, WO2006/047637, WO 2007/030642)。申请WO 2006/084226披露了既不提高也不降低EphA2激酶活性，但是能够阻碍肿瘤细胞增殖的抗体。然而，其中没有指示这些抗体阻止肝配蛋白Al结合受体，并且抑制肝配蛋白Al诱导的EphA2磷酸化。WO 2004/092343中已经提出了使用拮抗性抗体，但是其中没有披露实际的抗体。WO 2008/010101中已经描述了作为真实的拮抗剂的识别EphA2的抗体及其人源化变体和缀合物。这些抗体及其衍生物抑制EphA2激酶依赖性肿瘤细胞生长。然而，仍需要可以在癌症疗法中使用的新的且有效的药物。发明概述本发明的一个目的是提供新的药剂，其特异性结合A类Eph受体家族成员，诸如EphA2,并且通过拮抗受体来抑制受体的细胞活性。如此,本发明包括识别EphA2受体,优选地人的，并且发挥所述受体的拮抗剂功能的抗体或其片段。这些抗体缺乏任何激动剂活性。在一个实施方案中，本发明的抗体或其表位结合片段包含至少一条重链和至少一条轻链，所述重链包含三个连续的具有以SEQ ID NO: 1、2、和3代表的氨基酸序列的互补决定区，且其中所述轻链包含三个连续的具有以SEQ ID N0:4、5、和6代表的氨基酸序列的互补决定区。在一个优选的实施方案中，所述抗体或其表位结合片段是人源化的或重修表面 的(resurfaced)。在一个甚至更优选的实施方案中,所述抗体或其表位结合片段的重链包含由SEQ ID NO: 12组成的氨基酸序列，且所述抗体或其表位结合片段的轻链包含由SEQ IDNO: 14组成的氨基酸序列。在又一个实施方案中，所述抗体的重链具有氨基酸序列SEQ ID NO: 18，且所述抗体的轻链具有氨基酸序列SEQ ID NO: 16。在另一个实施方案中，所述抗体或其表位结合片段与细胞毒剂缀合。因此，本发明的一个方面提供了本发明的抗体或其表位结合片段的缀合物，其中所述缀合物包含选自下组的结合的细胞毒剂式(XIII)的化合物
权利要求
1.一种抗体或其表位结合片段，其特异性结合EphA2受体，并且包含至少一条重链和至少一条轻链，其中所述重链包含三个连续的具有以SEQ ID NO: 1、2、和3代表的氨基酸序列的互补决定区，且其中所述轻链包含三个连续的具有以SEQ ID N0:4、5、和6代表的氨基酸序列的互补决定区。
2.依照权利要求I的抗体或其表位结合片段，其中所述单克隆抗体或其表位结合片段是人源化的或重修表面的抗体或其表位结合片段。
3.依照权利要求I的抗体或其表位结合片段，其中所述重链包含由SEQID NO: 12组成的氨基酸序列，且其中所述轻链包含由SEQ ID NO: 14组成的氨基酸序列。
4.依照权利要求I的抗体或其表位结合片段，其中所述重链为(consistin)氨基酸序列SEQ ID NO: 18，且其中所述轻链为氨基酸序列SEQ ID NO: 16。
5.依照权利要求1-4的抗体或表位结合片段的缀合物，其中所述缀合物包含选自下组的细胞毒剂 a)式(XIII)的美登木素生物碱类
6.依照权利要求5的缀合物，其中所述细胞毒剂与所述抗体共价结合。
7.依照权利要求5或6中任一项的缀合物，其中所述细胞毒剂是式(XIII)的美登木素生物碱类。
8.一种用于制备缀合物的方法，包括下列步骤 (i)使任选缓冲的细胞结合剂水溶液与细胞毒性化合物的溶液接触； ( )然后，任选地分开在(i)中形成的缀合物与未反应的试剂和可能存在于溶液中的任何聚集体； 其中所述细胞结合剂是依照权利要求1-4的抗体，而细胞毒剂选自 式(XVII)的化合物
9.通过权利要求8的方法能够获得的缀合物。
10.依照权利要求9的缀合物，所述缀合物具有选自式(XV)和式(XVI)结构的结构
11.权利要求10的抗体-药物缀合物，其中η是4至7。
12.权利要求11的抗体-药物缀合物，其具有式(XV)的结构。
13.一种药物组合物，其含有依照权利要求1-4中任一项的抗体或其表位结合片段，或依照权利要求6、7和8中任一项的缀合物，和药学可接受载体或赋形剂。
14.依照权利要求1-4中任一项的抗体或其表位结合片段，或依照权利要求5、6和7中任一项的缀合物，其作为药物使用。
15.依照权利要求1-4中任一项的抗体或其表位结合片段，或依照权利要求5、6和7中任一项的缀合物用于制备用于治疗癌症的药物的用途。
16.权利要求15的用途，其中所述癌症选自癌，包括膀胱、乳腺、结肠、肾、肝、肺、卵巢、胰腺、胃、宫颈、甲状腺和皮肤癌；包括鳞状细胞癌；淋巴样谱系的造血肿瘤，包括白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、伯基特(Burkitt)氏淋巴瘤；髓样谱系的造血肿瘤，包括急性和慢性骨髓性白血病和前髓细胞性白血病；间质起源的肿瘤,包括纤维肉瘤和横纹肌肉瘤；其它肿瘤,包括黑素瘤、精原细胞瘤、畸胎癌、成神经细胞瘤和胶质瘤；中枢和周围神经系统肿瘤，包括星形细胞瘤、成神经细胞瘤、胶质瘤、和神经鞘瘤；间质起源的肿瘤，包括纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、和骨肉瘤；和其它肿瘤，包括黑素瘤、着色性干皮病、角化棘皮瘤、精原细胞瘤、甲状腺滤泡性癌和畸胎癌。
17.依照权利要求1-4的抗体或其表位结合片段，其中所述单克隆抗体或其表位结合片段的互补位在轻链中包含环LI的Arg35、L2的Tyr54、Arg58和Asp60。
18.依照权利要求1-4的抗体或其表位结合片段，其中所述单克隆抗体或其表位结合片段的互补位在重链中包含环Hl的Thr30、Ala31、Tyr32和Tyr33、H2的Asn52、Tyr54、Asn55 和 Phe57 和 H3 的 Glu99、PhelOO、TyrlOl、Glyl02、Tyrl03 和 Tyrl05。
19.依照权利要求1-4的抗体或其表位结合片段，其中所述单克隆抗体或其表位结合片段包含位置Thr H28处的突变。
20.依照权利要求1-4的抗体或其表位结合片段，其中所述单克隆抗体或其表位结合片段包含所述轻链上的下列少数位置之一处的突变35、26至31、34至37、55、56、57、59和94 至 102。
21.依照权利要求1-4的抗体或其表位结合片段，其中所述单克隆抗体或其表位结合片段包含所述重链上的下列少数位置之一处的突变28、54和57。
22.依照权利要求1-4的抗体或其表位结合片段，其特异性结合人EphA2受体的表位，该人EphA2受体的表位包含来自EphA2受体胞外域的LBD的残基Gly49、Lys50、Gly51、Asp53、Cys70、Asn71、Val72、Met73、Ser74、Gly75、Gln77、Phel08、Prol09、Glyll0、Glylll、Ser 113和Serl 14，或其保守取代形式。
23.依照权利要求6、7和8中任一项的缀合物，其具有高于4的平均DAR，所述DAR用UV分光光度计测量，并通过以下等式DAR=Cd/Ca确定 其中 Cd- [ ( ε Α280Χ Α252) - ( ε Α252χ A280) ] / [ ( ε D252X ￡ Α28θ) - ( ￡ Α252Χ ￡ D28o)] Ca- [Α280-(Cd X ε D280) ] / ε Α280 ε D252=26, 159M-1cm-1 ε D280=5, 180M-1cm-1ε Α280=224, OOOM_1cm_1 ε Α252=82, 880M_1cm_1 A252和A28tl是分别于252和280nm在UV分光光度计上测量的缀合物的吸光度。
24.依照权利要求23的缀合物，其具有4至10或5至8的平均DAR。
25.依照权利要求23的缀合物，其具有5.9至7. 5的平均DAR。
26.—种制品,其包含 a)包装材料， b)依照权利要求1-4中任一项的抗体或其表位结合片段，或依照权利要求6至8和23至25中任一项的缀合物，和 c)所述包装材料内含有的标签或包装插页，其指示所述抗体或其表位结合片段对于治疗癌症是有效的。
全文摘要
本公开内容涉及特异性结合EPHA2受体的抗体或其表位结合片段。它进一步涉及包含与抗体共价结合的细胞毒剂的缀合物及用于制备此类缀合物的方法。
文档编号A61K47/48GK102791737SQ201080054996
公开日2012年11月21日 申请日期2010年9月30日 优先权日2009年10月2日
发明者A.康默康, C.弗洛蒙德, D.塔瓦雷斯, F.帕克, H.布沙尔, I.沙逊, V.米科尔 申请人:赛诺菲