Rsv-特异性结合分子的制作方法
【专利说明】
[0001] 本申请是2009. 10. 06提交的CN 200980162731. 3,题为"RSV-特异性结合分子" 的分案申请。
技术领域
[0002] 本发明涉及生物学和医学领域。
[0003] 发明背景
[0004] 呼吸道合胞病毒（RSV)为属于副粘病毒家族的感冒病毒。RSV为毒性的、容易传染 的并且是2岁以下儿童下呼吸道疾病最常见的病因。在一个RSV感染季上至98%的日托 儿童将会被感染。0.5%和3. 2%之间的RSV感染儿童需要住院治疗。报道美国医院每年 接收大约90, 000例，4500例死亡。由于RSV而住院治疗的主要风险因素为早产、慢性肺疾 病、先天性心脏病、受损的免疫力，在其他情况下健康的为小于6周的年龄的儿童中。除了 充足营养形式的维持疗法和氧疗法外，对RSV阳性毛细支气管炎没有可用的有效治疗。抗 病毒疗法诸如利巴韦林未被证明在RSV感染中有效。一种单克隆抗体，帕利珠单抗（也称 为Synagis)，注册用于对RSV感染的预防。帕利珠单抗为针对RSV融合蛋白（F蛋白）遗传 设计（人源化）的单克隆抗体。RSV的F蛋白为病毒膜蛋白并且负责附着后病毒粒子与宿 主细胞的融合。另外，F蛋白促进相邻细胞通过形成合胞体的感染并且认为其功能取决于 所述蛋白质最初的寡聚结构。然而，帕利珠单抗并不总是有效的。因此，本领域有针对RSV 的替代和/或补充抗体以及疗法的需求。
【发明内容】
[0005] 本发明的一个目的为提供针对RSV的改进的抗体或所述抗体的功能等同物。另 外的一个目的为提供针对RSV的补充的抗体，其结合已有的RSV-特异性抗体，提供协同效 应。另一个目的为提供针对RSV F蛋白的人或人源化抗体或功能等同物，其针对不同于已 知RSV-特异性抗体所针对的表位。
[0006] 因此，本发明提供分离的、合成的或重组的抗体或能够特异性结合呼吸道合胞病 毒的功能部分、衍生物和/或类似物，并且其包括：
[0007] -重链⑶R1序列，其包括与序列KLSIH至少70%相同的序列，和/或
[0008] -重链CDR2序列，其包括与序列GYEGEVDEIFYAQKFQH至少70%相同的序列，和/ 或
[0009] -重链⑶R3序列，其包括与序列LGVTVTEAGLGIDDY至少70%相同的序列，和/或
[0010] _轻链⑶R1序列，其包括与序列RASQIVSRNHLA至少70%相同的序列，和/或
[0011] -轻链CDR2序列，其包括与序列GASSRAT至少70%相同的序列，和/或
[0012] _轻链^1?3序列，其包括与序列1^50551至少70%相同的序列。
[0013] 本发明提供命名为"AM22"的抗体，其具有如图2所述的重链和轻链序列。尤其关 乎AM22抗原-结合特性的AM22的⑶R序列也在图2中描述。抗体AM22完全为人的，能够 特异性结合RSV (图3)并且因此优选用于人个体的预防和/或治疗用途。
[0014] 如上所述唯一已有的临床使用抗-RSV抗体为帕利珠单抗。其为针对RSVF蛋白抗 原位点中表位的人源化单克隆抗体。人源化抗体还包含鼠抗体的一部分并且虽然相比完全 鼠抗体其免疫原性特性减弱，但在应用于人时还可能出现人源化抗体的副作用。然而本发 明人成功地获得和培养产RSV-特异性抗体的人B细胞，以提供人RSV-特异性抗体，其具有 作为完全人序列结果的强烈降低的"即使有的"免疫原性活性。如实施例所示，根据本发明 的抗体具有相比帕利珠单抗更优的特性（图1和表1)。本发明人已表明通过肌内注射给予 本发明抗体随后用RSV-X鼻内激发（challenge)的棉鼠（Sigmodon hispidus)具有比给予 帕利珠单抗随后用RSV-X激发的棉鼠更低的病理学指数（图4C和表2)。本文所用的病理 学指数为用以区分肺损伤的三个独立标志的得分总数。这三个标志为支气管和细支气管上 皮肥大、支气管和细支气管周围的炎症（支气管和细支气管周炎）和肺泡中的炎症（肺泡 炎）。另外，通过TCID50 (50%组织培养感染剂量）测定法测定的，用本发明抗体肌内注射 且随后RSV-X激发的棉鼠具有比给予帕利珠单抗随后用RSV-X激发的棉鼠更低的肺病毒效 价。因此，AM22优于帕利珠单抗。
[0015] 除了帕利珠单抗外，还已知一些其他的RSV-特异性抗体。W0 2008/147196公开 了 RSV结合分子，即抗体D25、AM14、AM16和AM23的序列。如本申请实施例1所详述的，RSV 特异性抗体AM22获自与抗体D25、AM14、AM16和AM23相同的供体。然而很明显的是，AM22 比获自相同供体的所有其他抗体更有效地识别RSV。AM22的IC 5(I值，1. 15ng ml-1，比帕利 珠单抗、D25、AM14、AM16或AM23更低。因此，使用AM22用于RSV-相关病症的治疗和/或 预防比使用其他的RSV特异性抗体更有优势。相比其他抗体，获得类似的效果只需要更少 的AM22抗体。因此，给予个体更少的AM22用于RSV-相关病症的治疗和/或预防。或者， 相比其他抗体，用类似量的AM22可以获得更有效的RSV-相关病症的治疗和/或预防。
[0016] 此外，本发明的RSV-特异性抗体识别不同于如前公开的RSV结合分子的表位。 AM22与之前鉴定的抗体（W02008/147196)类似，能够结合RSV F蛋白（图3A)。然而， AM22不结合单体RSV F蛋白（图3B的左和右组）。与AM22相反，已知抗体帕利珠单抗和 AM16 (W02008/147196和图3B中公开）能够结合F蛋白的单体形式。重要的是表达抗原特异 性B细胞受体（BCR)的AM22B细胞系不识别F蛋白的重组形式（图3C)。因此AM22结合与 帕利珠单抗、D25、AM23和AM16不同的F蛋白表位。当重组F蛋白在包含具有8个HIS-标 签（ILZ-8xHIS)的异亮氨酸拉链三聚基序的载体中表达时，AM22识别该三聚体，其为构象 依赖型结构（图3D)。相反AM14不识别F蛋白的单体形式或所述ILZ-8xHIS F蛋白。因 此AM22结合同样与AM14不同的F蛋白表位。此外人们发现AM22不妨碍D25或帕利珠单 抗结合RSV感染的H印2细胞。因此相比D25、AM14、AM16、AM23和帕利珠单抗，AM22结合不 同的F蛋白表位。因此，本发明的RSV-特异性抗体或其功能等同物优选与已知的RSV-特 异性抗体，诸如帕利珠单抗、D25、AM14、AM16和AM23联用。通过将本发明的抗体与已知的 RSV-特异性抗体联用，在同样的疗法期间可以识别两个或更多不同的RSV表位。因此获得 对RSV更强的免疫原性应答。此外，可通过已知的RSV-特异性抗体与本发明的AM22抗体 联用而实现对RSV更高的抗体特异性。随着对RSV更强的免疫原性应答和更高的特异性， 所述联用将产生更有效的RSV-相关病症的治疗和/或预防。最后，如通过其约1. 15ng/ml 的低IC5Q值所示，由于相比帕利珠单抗、D25、AM14、AM16和AM23, AM22具有对F蛋白更强 的结合力，因此需要较低的总抗体剂量。
[0017] 因此一个实施方案提供在体外中和测定法中具有小于1. 25ng/ml的IC5Q值的本发 明抗体或功能等同物，该测定法中ffip-2细胞被RSV-A2病毒感染。所述抗体或功能等同物 优选具有小于1. 2ng/ml的IC5(I值，优选在0. 5ng/ml和1. 2ng/ml之间。另外，本发明的抗 体或功能等同物在其中ffip-2细胞被RSV-A2病毒感染的体外中和测定法中优选具有比帕 利珠单抗IC5(I值低至少120倍，更优选至少130倍的1C5(|值。所述抗体或功能等同物优选 具有约1. 15ng/ml的IC5Q值。因此本发明的RSV-特异性抗体或其功能等同物与至少一种 已有的RSV-特异性抗体联用可以实现更有效的RSV-相关病症的治疗和/或预防。
[0018] 抗体的功能等同物在此定义为抗体的功能部分、衍生物或类似物。抗体的功能等 同物优选为人工结合化合物，包括抗体的至少一个CDR序列。
[0019] 抗体的功能部分定义为具有与所述抗体在类型上而不必要在数量上相同的至少 一种特性的部分。所述功能部分能够（虽然不一定以相同的程度）结合与所述抗体相同的 抗原。抗体的功能部分优选包括单一结构域抗体、单链抗体、单链可变片断（scFv)、Fab片 段或F(ab'）2片断。
[0020] 抗体的功能衍生物定义为已经过改变而使得产生的化合物的至少一种特性（优 选抗原结合特性）在类型上而不必要在数量上基本相同的抗体。通过许多途径提供衍生 物，例如通过保守的氨基酸取代，氨基酸残基由通常具有相似特性（大小、疏水性等等）的 另一个残基取代而使得整体功能很可能并不严重受影响。
[0021] 本领域技术人员能够很好地生成类似的抗体化合物。其例如利用肽库或噬菌体展 示库完成。所述类似物基本上具有所述抗体的至少一种在类型上而不必要在数量上相同的 特性。
[0022] 本发明的抗体优选为人抗体。使用人抗体用于人的预防和治疗减少了由于人个体 中对非-人序列的免疫反应而产生的副作用的可能性。在另一实施方案中本发明的抗体、 功能部分、衍生物或类似物为人源化抗体。通过将非-人高变结构域引入人抗体而产生人 源化抗体并且因此相比完全非-人抗体，减弱了免疫原性特性。在另一优选实施方案中，本 发明的抗体、功能部分、衍生物或类似物为嵌合抗体。这种情况下，目的序列，例如目的结合 位点可包含在本发明的抗体或功能等同物中。
[0023] 如技术人员熟知的，抗体的重链为装配免疫球蛋白分子的两类链中较大的链。重 链包括恒定区和可变区，可变区参与抗原结合。抗体的轻链为装配免疫球蛋白分子的两类 链中较小的链。轻链包括恒定区和可变区。其可变区与重链可变区一起参与抗原结合。
[0024] 互补-决定区（⑶R)为重链可变区和轻链可变区中的高变区。重链和连接的抗体 轻链的CDR共同形成抗原结合部位。
[0025] 因为本发明提供了以下理解，即图2中所述的CDR序列提供所需的结合特性，技术 人员完全能够生成包含至少一种改变的CDR序列的变体。例如，应用保守的氨基酸取代。而 改变图2中所述的至少一种CDR序列以生成相比AM22具有至少一种改变的特性的变体抗 体或其功能等同物也是可能的。优选，提供包含CDR序列的抗体或功能等同物，该CDR序列 与图2中所述CDR序列至少70%相同而使得AM22的良好结合特性至少部分维持或甚至得 到改进。优选改变图2中所述的CDR序列使得得到的抗体或功能等同物相比AM22包含至 少一种改进的特性，例如改善的稳定性和/或结合亲和力。优选维持结合特异性（同样，而 不必全部）。包含与图2中所述CDR序列至少70%相同的氨基酸序列的变体抗体或其功能 等同物也因此在本发明的范围内。用于改变氨基酸序列的各种方法是本领域中可得到的。 例如，人工合成具有所需CDR序列的重链或轻链序列。优选，例如利用随机或定点-诱变突 变编码CDR序列的核酸序列。
[0026] 抗原和抗体之间结合的亲和常数和特异性的测定优选用以测定预防、治疗、诊断 的功效以及利用本发明抗-RSV抗体的研宄方法。"结合亲和力"通常指分子（例如抗体） 的单一结合位点和其结合配体（例如抗原）之间总的非共价相互作用的力。除非另外指 出，如此处所用的，"结合亲和力"指反映结合对（例如抗体和抗原）成员间1 :1相互作用 的固有结合亲和力。亲和力通常可由计算为比值的平衡离解常数（Kd)表示。参 见例如Chen，Y.，等.，（1999) J. Mol Biol 293:865-881。可通过本领域已知的常见方法 测定亲和力，例如表面胞质共振（SPR)测定法，诸如IBIS Technologies BV(Hengelo，the Netherlands)的 BiaCore 或 IBIS-iSPR 仪器，或液相测定法，诸如 Kinexa。
[0027] 根据优选的实施方案，本发明的抗-RSV抗体对RSV F蛋白的表位具有结合亲 和力，其包括小于 1 X 1(T2M、1 X 1(T3M、1 X 1(T4M、1 X 1(T5M、1 X 1(T6M、1 X 1(T7M、1 X 1(T8M、 1 X 10_9M、1 X 10_1qM、1 X 10_nM、1 X 10_12M、1 X 10_13M、1 X 10_14M 或小于 1 X io_15m 的离解常 数（Kd)。在一实施方案中，抗-RSV抗体具有小于10_7M、小于5X1(T 8M、小于1(T8M、小于 5X 1(T9M、小于 1(T9M、小于 5X 10^1、小于 10^1、小于 5X l(TnM、小于 l(TnM、小于 5X 1(T12M、 小于 1(T12M、小于 5X1(T13M、小于 1(T13M、小于 5X1(T14M、小于 1(T14M、小于 5X1(T15M 或小于 1(T15M 的 Kd。
[0028] 本发明进一步提供分离的、合成的或重组的抗体或其功能部分、衍生物和/或类 似物，其包括：
[0029] -重链⑶R1序列，其包括具有与序列KLSIH至少70%序列同一性的序列，和/或
[0030] _重链^1?2序列，其包括具有与序列6￥￡6￡￥0￡正