一种促甲状腺激素受体蛋白质、基因序列及其试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及疾病诊断领域，特别涉及促甲状腺激素受体蛋白质。
【背景技术】
[0002] 促甲状腺激素受体（TSHR)是存在于甲状腺滤泡细胞膜上的一种G蛋白偶联受体。 在正常的生理情况下，TSHR通过与促甲状腺激素（TSH)的结合来调节甲状腺滤泡细胞的功 能和生长。促甲状腺激素受体抗体（TRAb)是自身免疫甲状腺疾病、格雷氏（Graves)病甲 状腺机能亢进和部分原发性粘液性水肿患者检测的重要指标。其中Graves病是一种以甲 亢、弥漫性甲状腺肿和突眼为特征的自身免疫性疾病。而TRAb是引起Graves病甲亢和甲 亢复发的重要原因之一。因此对于TRAb的检测至关重要，我们通过TSHR来检测患者体内 的TRAb的含量，从而对其患甲状腺疾病的风险进行评估。TSHR不仅介导TSH的生理作用， 而且是一种重要的自身抗原，其相应的自身抗体在自身免疫性甲状腺疾病的发生过程中起 着重要作用。
[0003] 由于TSHR基因突变和免疫系统的作用，体内出现抗TSHR抗体（TSHR Ab，TRAb)。 依抗体与TSHR结合后引起的变化不同，TSHR Ab可以分为TSHR刺激抗体（TSHR SAb)和 TSHR抑制抗体（TSHR IAb)。前者促甲状腺滤泡细胞增生和功能亢进，后者抑制TSHR作用 导致甲状腺滤泡细胞萎缩和功能低下。
[0004] 目前临床上检测体外TRAb都基于放射免疫或酶联免疫技术，随着灵敏度和精确 度更高的化学发光技术在体外诊断中的应用，生产出能适用于化学发光封闭系统的抗原原 料变得尤其重要。
【发明内容】
[0005] 本发明提供了一种促甲状腺激素受体蛋白质，所述蛋白质的序列为SEQ ID NO: 1。 所述蛋白质能与TRAb特异性的结合，特别是应用于化学发光系统中，其与化学发光系统的 配合使用显著的提高了检测的灵敏度和精确度。
[0006] 在一个具体的实施方式中，所述蛋白质为在真核表达系统中表达而获得的蛋白 质。由于真核表达系统获得的蛋白质的被修饰水平和/或构象能够更接近产生于人体的促 甲状腺激素受体，因此，使用在真核表达系统表达获得的蛋白质来与TRAb结合，进行临床 检测的灵敏度和精确度高于原核表达系统获得的蛋白质。
[0007] 在一个具体的实施方式中，所述蛋白质为在哺乳动物表达系统中表达而获得的蛋 白质。
[0008] 在一个具体的实施方式中，所述蛋白质为结合标记物的蛋白质；优选自纳米磁珠 包被的蛋白质、生物素及生物素衍生物化的蛋白质和荧光素标记的蛋白质。其中包被可分 直接包被和间接包被，间接包被方式包括但不限于通过FITC+抗FITC抗体体系、链霉亲和 生物素体系。
[0009] 在一个具体的实施方式中，生物素衍生物可以选自Sulfo-NHS-Biotin、 Sulfo-NHS-LC-Biotin、Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin、NHS-PEG4-Biotin、NHS-PEG12-Biotin、 NHS-Biotin、NHS-LC-Biotin、NHS-LC-LC-Biotin、Sulfo-NHS-SS-Biotin、NHS-SS-Biotin、 NHS-SS-PEG4_Biotin、NHS-Chromogenic Biotin、NHS-Iminobiotin、PEP-Biotin、 TFP-PEG3-Biotin、Maleimide-PEG2-Biotin、以及 Maleimide-PEGl 1-Biotin ;
[0010] 荧光素可以选自异硫氰酸荧光素、6-羧基荧光素、四乙基罗丹明、四甲基异硫氰酸 罗丹明、藻红蛋白、多甲藻叶绿素蛋白、以及碘化丙啶。
[0011] 本发明还提供了一种促甲状腺激素受体蛋白质的基因序列，所述基因序列为通过 表达获得如上所述的任意一种蛋白质的基因序列中的至少一种。
[0012] 本发明最后提供了一种用于检测促甲状腺激素受体抗体的试剂盒，所述试剂盒包 括如上所述任意一种蛋白质。例如，所述蛋白质可以为浓度0. 1-5 %的包被磁球的重组蛋白 质，或10-200 y g/L的生物素（Biotin)化的重组蛋白质，或10-200 y g/L的标记的FITC的 重组蛋白质。
[0013] 在一个具体的实施方式中，所述试剂盒中还包括携带有标记示踪物的蛋白A。例 如，携带有标记示踪物的蛋白A为ABEI标记的蛋白A，其浓度可以为0. 1-lmg/L。利用化学 发光法可以显著地提高产品的灵敏度和特异性。其中，蛋白A是一种金黄色葡萄球菌细胞 壁蛋白质，能特异性地与人和哺乳动物抗体（主要是IgG)的Fc区结合。
[0014] 在一个具体的实施方式中，所述试剂盒中还包括携带有标记示踪物的抗人IgG和 抗人IgM。例如，抗人IgG和抗人IgM可以为抗人IgG标记的ABEI (0. 1-lmg/L)和抗人IgM 标记的ABEI (0. 1-lmg/L)。抗IgG抗体的Fab片段（抗原结合片段）能与IgG抗体的Fc片 段（结晶片段）结合。抗IgM抗体的Fab片段（抗原结合片段）能与IgM抗体的Fc片段 (结晶片段）结合。
[0015] 在一个具体的实施方式中，所述标记示踪物可以选自吖啶酯、叮啶酯酸-NHS酯、 吖啶酸丙磺酸钠盐、9-吖啶羧酸、鲁米诺、鲁米诺钠盐、N-(4-氨丁基）-N-乙基异鲁米诺、光 泽精、3, 3'，5, 5' -四甲基联苯胺丙磺酸钠、3, 3'，5, 5' -四甲基联苯胺、异鲁米洛、多聚异鲁 米诺、多聚吖啶酯、氧化葡聚糖、氨化葡聚糖、以及羧基化葡聚糖。
[0016] 在一个具体的实施方式中，所述试剂盒中还包括BSA缓冲液。
[0017] 在一个具体实施例中，所述试剂盒可以包含链霉亲和素（SA)包被的磁球，其浓度 可以为 〇? l_5mg/mL。
[0018] 在一个具体实施例中，所述试剂盒可以包含羊抗FITC多克隆抗体包被的磁球，其 浓度为 〇? l-5mg/mL。
[0019] 在一个具体实施例中，所述试剂盒可以包含低点校准品（TRAb 30-100ng/mL)和 高点校准品（TRAb 500-1500ng/mL)。
【具体实施方式】
[0020] 下面结合实施例对本发明做以下详细说明。
[0021] 本发明提供了一种促甲状腺激素受体蛋白质，所述蛋白质的序列为SEQ ID NO: 1。 所述蛋白质通过真核系统表达得到，所述真核系统优选哺乳动物表达系统，以下给出本发 明得到促甲状腺激素受体蛋白的获取过程。
[0022] 1.主要试剂与设备
[0023] PCR 所用试剂（包括 Taq 酶，buffer，dNTP)，T4 连接酶、DNA Marker、蛋白 Marker 购自全式金生物技术有限公司；EcoR I、Xba I和Kpn I等限制性内切酶、小牛肠碱性磷酸 酶（CIAP)购自Takara(宝生物工程（大连）有限公司）；胶回收试剂盒及质粒提取试剂盒 购自life technology公司；氨节青霉素等购自BBI公司；PCR引物及重组质粒测序由华 大基因公司或Invitrogen公司完成；所用一抗、二抗及ECL显色剂均购自Snata Cruzs公 司；G418的配制：G418溶于10mL蒸馏水，搅拌使其完全溶解，过滤除菌后，以1 mL分装至 1. 5mL的离心管中，然后于-20°C保存。细胞冻存液：以DMEM培养基：胎牛血清：二甲基亚 砜（DMS0) = 7:2:1的比例配制细胞冻存液，4°C保存。Ni柱蛋白纯化试剂盒购自康为世纪， 其余试剂由深圳市新产业生物医学工程股份有限公司提供。
[0024] ABI Veriti PCR仪购自ABI，水平电泳仪RDY-SP1Z购自上海山富，恒温摇床 C0S-2102C购自上海比朗，超净工作台BSC-100011 A2购自上海博迅实业有限公司，离心机 购自Sigma，倒置显微镜购自奥林巴斯，垂直电泳仪购自BioRad，转膜仪购自BioRad，凝胶 成像仪805购自上海山富，C0 2培养箱购自Thermo scientific ;其余设备由深圳市新产业 生物医学工程股份有限公司提供。
[0025] 2.细胞株、菌株和质粒
[0026] Human TSHR(hTSHR，人促甲状腺激素受体，也就是来源于人的促甲状腺激素受体） cDNA购自OriGene公司，质粒pcDNA?3. 1/His A及GripTite?293MSR细胞、相应的培养基 购自life technology公司；感受态细胞Trans5 a购自北京全式金公司。
[0027] 3.通过分子克隆技术构建表达hTSHR重组蛋白的动物细胞表达载体
[0028] 由