抗人程序性死亡受体1抗体及其制备方法和用图
【技术领域】
[0001] 本发明设及抗人程序性死亡受体1 (Human Program Death IReceptor，hPD-1)抗 体及其制备方法和用途。
【背景技术】
[0002] 程序性死亡受体-1 (Human Program Death 1 Rec巧tor, hPD-l)是一类重要的免 疫负性调控分子（也称"免疫检查点分子")，属于CD28家族成员，该家族成员还包括CD28、 CTLA4、IC0S 和 BTLA 等。
[000引 PD-1是I型跨膜糖蛋白，由细胞外区、跨膜区和胞内区立部分构成。它的细胞膜外 部分是一个免疫球蛋白可变区（IgV)样结构域，胞内部分N-端含有一个免疫受体酪氨酸抑 制基序（immunoreceptor tyrosine based inhibitoiT motif，KIM)，C-端含有一个免疫 受体酪氨酸转换基序（immunoreceptor tyrosine based switch motif, ]；TSM)，其中口SM 是PD-1分子向胞内传递抑制信号的关键基序。与CTLA-4等家族成员W同源二聚体的形式 存在于T细胞表面不同，PD-1 W单体的形式表达于活化的T细胞、B细胞和髓样细胞等细胞 表面。
[0004] PD-1 有两个配体，即 PD-L1 度7-化，CD274)和 PD-L2 度7-DC，CD273)，属于 B7 家 族的跨膜分子。PD-L1广泛分布于成熟的巨隧细胞、B细胞、树突状细胞等造血细胞W及内 皮细胞、膜岛细胞、肥大细胞等非造血细胞表面，而且在多种肿瘤细胞表面均高表达；PD-L2 只在巨隧细胞、树突状细胞及部分B细胞亚类等细胞表面表达。与经典的免疫负性调控分 子细胞毒T淋己细胞相关抗原4(CTLA-4)相类似，PD-1通过与其配体PDLUPDL2相互作用 发挥免疫负调控作用。当PD-1与配体相互作用时，其胞内段口SM发生憐酸化并且招募相 应的憐酸化酶SHP-1和SHP-2,导致下游信号分子去憐酸化从而下调免疫细胞应答水平。免 疫系统的运一负性调控机制是维持机体免疫耐受的关键分子基础。然而，大量的研究表明， PD-1等免疫负性调控分子过度表达及其与受体PD-L1/PD-L2相互作用所诱导的机体免疫 抑制状态在癌症W及HIV、HCV、皿V等慢性感染性疾病发病过程中发挥重要作用。通过阻 断PD-1/PD-L1相互作用，可W逆转免疫抑制，提高免疫系统杀伤病毒和肿瘤细胞的能力； 同时阻断PD-1/PD-L2相互作用，免疫抑制状态逆转效果更好。因此，祀向运类负性调控分 子成为新一代癌症治疗策略，PD1/PDL1通路抑制剂的研究备受关注。特异性阻断PD1/PDL1 信号通路的抗体药物是该领域研究的重点。抗PD1抗体纳武单抗（Nivolumab，化divo,百 时美施贵宝）和化mbrolizum油化eytruda，默克）均获得了 FDA突破性药物资格并获批上 市。其中百时美施贵宝产品纳武单抗于2014年12月获抑A批准上市，用于黑色素瘤临床 治疗；随后在2015年3月，FDA批准该抗体用于治疗鱗状非小细胞肺癌，标志着该类免疫疗 法正式进入实体瘤临床治疗领域。
[0005] 本领域依然存在对特异性阻断PD1/PDL1信号通路的抗体药物的需求。
【发明内容】
[0006] 本发明的第一方面设及一种分离的抗人程序性死亡受体-1 (Human Program Death IRec巧tor，hPD-l)抗体或其抗原结合片段，其重链可变区CDRl序列如SEQ ID N0:1 所示，〔032序列如569 10^:2所示，〔01?3序列如569 10^:3所示；和/或轻链可变区的 CDRl序列如沈Q ID N0:4所示、CDR2序列如沈Q ID N0:5所示，CDR3序列如沈Q ID N0:6 所示，或者所述重链或轻链的CDR序列与SEQ ID NO :1-6所示序列具有至少70%的同源性 且保留相应母体序列生物活性的变体序列，如至少75 %、80 %、85 %、90 %、91 %、92 %的同 源性，或所述重链或轻链的CDR序列为SEQ ID NO: 1-6所示序列经删除、替换和/或添加一 个或多个氨基酸残基后获得的保留相应母体序列生物活性的变体序列，如1、2、3、4或5个 氨基酸残基。
[0007] 在一些实施方案中，所述的抗hPD-1抗体或其抗原结合片段上述重链CDR1、CDR2 和 CDR3 和轻链 CDR1、CDR2 和 CDR3。
[0008] 在一些实施方案中，所述的抗hPD-1抗体或其抗原结合片段的重链可变区序列如 569 10^:7所示；和/或轻链可变区序列如569 10^:8所示，或者与569 10^:7-8 所示序列具有至少70 %的同源性且保留相应母体序列生物活性的变体序列，如至少75%、 80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或99.1%的同源性，或沈9 10側：7-8所示 序列经删除、替换和/或添加一个或多个氨基酸残基后获得的保留相应母体序列生物活性 的变体序列，如1、2、3、4、5、10、15、20、30或50个氨基酸残基。
[0009] 在一些实施方案中，所述的抗hPD-1抗体或其抗原结合片段的重链氨基酸序列 如SEQ ID NO: 13所示；和/或轻链可变区序列如SEQ ID NO: 11所示，或者与SEQ ID NO : 13或11所示序列具有至少70%的同源性且保留相应母体序列生物活性的变体序列，如至 少 75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99. 1%、99. 2%、99. 3%、99. 4%、 99. 5%、99. 6%、99. 7%或99. 8%的同源性，或沈Q ID NO :13或11所示序列经删除、替换 和/或添加一个或多个氨基酸残基后获得的保留相应母体序列生物活性的变体序列，如1、 2、3、4、5、10、15、20、30、50个或100氨基酸残基。
[0010] 在一些实施方案中，所述的抗hPD-1抗体或其抗原结合片段为全长抗体，优选地， 其为IgGl或者IgG4同种型的全长抗体。
[0011] 在一些实施方案中，所述的抗hPD-1抗体或其抗原结合片段为抗原结合片段，优 选地，其为Fab片段、Fab' 2片段或单链抗体。
[0012] 本发明的第二方面设及一种组合物，其包含上述第一方面所述的抗hPD-1抗体或 其抗原结合片段。
[0013] 本发明的第Ξ方面设及一种核酸分子，其编码上述第一方面所述的抗hPD-1抗体 或其抗原结合片段。
[0014] 在一些实施方案中，所述的核酸分子的序列如SEQ ID NO :9或10所示，或者是 与SEQ ID NO :9或10具有至少70%同源性且仍编码具有本发明的抗体或其抗原结合片 段的活性的变体分子，如至少 75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99. 1%、 99. 2%、99. 4%、99. 5%、99. 6%或99. 7%的同源性，或是与序列如沈Q ID N0:9或10所 示的核酸分子完全互补或在中度至高度严格条件下杂交的核酸分子，所述中度严格条件 的一个例子是包括在5XSSC、0. 5% SDSU.OmM邸TA(p册.0)的溶液中预洗；在50-60°C、 5XSSC、过夜的条件下杂交；再于65°C下20分钟用含0. 1% SDS的2X、0. 5X和0. 2X的 ssc各洗涂两次，合适的高严格杂交条件包括上述的条件，所不同的是杂交溫度升高了，例 如达到 60-65°C或 65-70°C。
[0015] 在一些实施方案中，所述的核酸分子的序列如SEQ ID NO :12或14所示，或者是 与SEQ ID NO :12或14具有至少70%同源性且仍编码具有本发明的抗体或其抗原结合片 段的活性的变体分子，如至少 75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99. 1%、 99.2%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或更高的同源性，或是与序列如 SEQ ID NO :12或14所示的核酸分子完全互补或在中度至高度严格条件下杂交的核酸分 子，所述中度严格条件的一个例子是包括在5XSSC、0. 5%SDS、1.0mM邸TA(p册.0)的溶 液中预洗；在50-60°C、5XSSC、过夜的条件下杂交；再于65°C下20分钟用含0. 1% SDS的 2X、0. 5X和0. 2X的SSC各洗涂两次，合适的高严格杂交条件包括上述的条件，所不同的 是杂交溫度升高了，例如达到60-65°C或65-70°C。
[0016] 本发明的第四方面设及一种表达载体，其上述第Ξ方面所述的核酸分子。本发明 的表达载体并无特别限定，只要其能表达本发明要求保护的抗体或其抗原结合片段即可。
[0017] 本发明的第五方面设及一种宿主细胞，其包含上述第四方面所述的表达载体。
[0018] 本发明的第六方面设及一种生产上述第一方面所述的抗体或其抗原结合片段的 方法，其包括步骤：将第五方面所述的宿主细胞在适合所述抗hPD-1抗体或其抗原结合片 段表达的培养条件下表达，任选地，将表达的抗体或其抗原结合片段进行纯化。
[0019] 本发明第屯方面设及上述第一方面所述的抗体或其抗原结合片段在制备用于调 控哺乳动物包括人的免疫应答的试剂中的用途。
[0020] 换言之，本发明利用天然抗体库筛选平台筛选获得一株新型抗hPD-1抗体SG001， 其能够特异性识别人和猴的PD-1分子，阻断PD-1/PD-L1 W及PD-1/PD-L2相互作用，调节 免疫应答，提高免疫应答水平。本发明的抗人PD-1抗体与人PD1特异性结合并表现出良好 的特性。运些特性包括与人PD-1的高亲和力结合，但与CD28、CTLA4、BTLA W及IC0S等其 它CD28家族成员没有交叉反应。
[0021] 在一些实施方案中，本发明设及抗人PD-1抗体或其抗原结合部分，其至少表现出 一项下列性质：
[002引 （1) W 1X 10 7m或更小的Kd与人PD-1结合；
[0023] (2)不显著与 CD28、CTLA4、BTLA W及 IC0S 等结合；
[0024] (3)在MLR实验中增加干扰素丫的表达水平；
[00幼 （4) W 1 X 10 7M或更小的Kd与猴PD-1结合；
[0026] (5)抑制 PD-L1 和 / 或 PD-L2 与 PD-1 的结合；
[0027] (6)刺激免疫应答。
[0028] 本发明的抗人PD-1抗体或其抗原结合部分的优点尤其表现在其阻断PD1/PDL1的 活性相对于现有技术具有显著性的提高，例如与现有技术的BMS01相比，其阻断PD1/PDL1 的活性提高了 6倍（如实施例6和图6所示，SG001抗体半数抑制剂量为1. 47 + 0. 227 μ g/ 血，显著优于阳性抗体BMSOl (10. 62 + 0. 536 μ g/mL