度设2个平行复孔，盖好封板膜，37°C水平放 置1. 5小时。洗涂液重复洗板3遍后，加入HRP标记的亲和素，室溫（20±5°C )避光放置 45分钟。洗涂液重复洗板5遍，在吸水纸上尽量拍干残留液滴；每孔加入100 μ 1 TMB，室溫 (20±5°C )避光放置3min海孔加入100 μ 1 2Ν H2SO4终止液终止底物反应，酶标仪450nm 处读取0D值。分析抗体阻断PD1与PDL1相互作用的活性。
[0110] 结果显示，SG001抗体和BMS01阳性抗体都能够阻断hPDLl与hPDl-FC结合， 并呈剂量依赖性；SG001抗体半数抑制剂量为1. 47 ± 0. 227 μ g/mU显著优于阳性抗体 BMS01 (10. 62 + 0. 536 μ g/mL)，P<0. 0001。结果如图 6 所示。
[0111] 实施例7抗体阻断PD1与PDL2相互作用
[0112] 将PDL2蛋白（北京义翅神州生物技术有限公司）稀释于包被缓冲液中，浓度为 1 μ g/mL，W 100 μ 1/孔的量加入到ELISA板各个孔中，4°C包被过夜。洗涂液重复洗板3遍 后，每孔加入200 μ1 1.5%酪蛋白，37°C封闭比。用PBS缓冲液稀释hPDl-FC-Biotin(生 物素 Biotin标记的hPDl-FC蛋白，其中hPDl-FC由实施例1获得，委托嘉喧生物完成标记） 至10 μ g/血，W该溶液稀释待测抗体SG001、BMS01。SG001和BMS01最高浓度为100 μ g/ mU倍比稀释，共设立12个浓度；将该梯度稀释的抗体溶液加入封闭后的化ISA反应孔中， 每孔100 μ 1，每个样品浓度设2个平行复孔，盖好封板膜，37Γ水平放置1. 5小时。洗涂液 重复洗板3遍后，加入HRP标记的亲和素，室溫（20 ± 5°C )避光放置45分钟。洗涂液重复 洗板5遍，在吸水纸上尽量拍干残留液滴；每孔加入100 μ 1 TMB，室溫（20 +5°C )避光放置 3min ;每孔加入100 μ 1 2N H2SO4终止液终止底物反应，酶标仪450nm处读取0D值。分析抗 体阻断PD1与PDL2相互作用的活性。
[0113] 结果显示，SG001抗体和BMS01阳性抗体都能够阻断hPDl-FC-Biotin与PDL2相互 作用，并呈剂量依赖性；SG001抗体和BMS01阳性抗体之间无显著差别。结果如图7所示。
[0114] 实施例8抗体识别猴PD1抗原
[0115] 将猴PD1 (义翅神州）、hPDl-Fc分别包被化ISA板条，lug/ml，4°C过夜；PBST洗涂 后，加入1. 5%的酪蛋白，4°C封闭过夜；加入不同浓度的SG001抗体或者BMS01抗体，37°C 反应2小时；PBST洗涂后，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗人F油二抗（GAH-F油-HRP)，室 溫反应45分钟；PBST重复洗板5遍，在吸水纸上尽量拍干残留液滴；每孔加入100 μ 1 TMB， 室溫（20±5°C )避光放置3min ;每孔加入100 μ 1 2Ν H2SO4终止液终止底物反应，酶标仪 450nm处读取0D值，分析抗体与猴PD1结合能力。
[0116] SG001抗体（图8A)或者BMS01阳性抗体（图8B)均能特异性识别猴PD1蛋白，呈 显著的剂量依赖性；抗体识别猴PD1蛋白活性与识别猴PD1蛋白活性没有显著差别。
[0117] 实施例9抗体体外增强免疫应答
[0118] 取健康人外周血，用淋己细胞分离液（天津市漫贞洋生物制品科技有限责任公司） 分离外周血单个核细胞（PBMC)，进一步采单核细胞分离试剂盒（Miltenyi公司）从PBMC 中分离单核细胞；调整细胞浓度，按2X 10^孔接种96孔细胞培养板，培养体系为1640培 养基，含10%胎牛血清、25叫/111161-5〔尸度1〇1^6邑611(1公司）和50叫/1111比-4度1〇1^6邑611(1 公司）；37°C，5% 0)2,常规培养；每3天更换一次新鲜培养基，培养7天，诱导树突状细胞 值C)。
[0119] 实验第7天，取另外一份健康人血，分离PBMC ;进一步使用CD4阳性T细胞（CD4+T) 分选试剂盒（eBioscience)从分离的PBMC中分离出CD4+T细胞；调整细胞浓度，按2X 10^ 孔接种前述诱导DC细胞的培养板中。分别加入SG001抗体和BMS01阳性抗体，浓度梯度为 0.016、0.08、0.4、2、10、50μg/ml，设置3个复孔；实验中设置阴性组（只有CD4叮、DCW及 CD4叮联合DC)。
[0120] 37°C，5% C〇2,常规培养5天后收获上清，测定上清中IFN-丫表达水平。
[0121] 结果显示（图9)，单纯CD4+T细胞、DC细胞W及CD4叮联合DC细胞的培养上清中， IFN-丫表达呈本底水平；在加入不同浓度梯度抗体后，IFN-丫表达显著增加，且具有剂量 依赖性；SG001抗体和BMS01阳性抗体之间没有显著差别。
[0122] 实施例10抗体体内增强免疫应答
[0123] 取健康人外周血，用淋己细胞分离液（天津市漫贞洋生物制品科技有限责任公司） 分离外周血单个核细胞（PBMC);用1640培养基（不含血清）将PBMC浓度调成为5X106/ ml，尾静脉注射NPG小鼠（免疫缺陷型小鼠，维通达公司产品），每只200 μ 1，建立人PMBC 移植小鼠的移植物抗宿主排斥（GVHD)模型；实验设置Ξ组，分别给予SGOOl抗体、BMSOl阳 性抗体和生理盐水，抗体给药剂量为150 μ g/只，一周给药2次，给药2周；分析抗PD1抗体 在体内增强免疫反应的生物学功能；每五天测量一次体重，记录小鼠的存活时间并计算生 存率。
[0124] PMBC移植小鼠体重早期逐渐上升，到20天后体重开始下降，小鼠产生了 GV皿反 应，随后小鼠开始出现死亡（图10)。生理盐水对照组中位生存时间为41天，SG001抗体、 BMS01阳性抗体组的中位生存时间分别为36天和39天，小鼠存活率降低（SG001 VS NC，P =0. 0044 ;BMS01 VS NC, P = 0. 5240)，生存时间缩短，提示GV皿效应加剧；相比BMS01阳性 抗体组，SG001抗体组小鼠平均生存时间更短，提示GV皿效应更为显著（SG001 VS BMS01， P = 0. 0827)。实验结果提示，SG001抗体W及BMS01阳性抗体均可W增强体内免疫反应， SG001抗体活性略优于BMS01阳性抗体。
【主权项】
1. 一种分离的抗人程序性死亡受体-1 (Human Program Death IReceptor，hPD_l)抗 体或其抗原结合片段，其重链可变区⑶R1序列如SEQ ID NO: 1所示，⑶R2序列如SEQ ID N0:2所示，CDR3序列如SEQIDN0:3所示；和/或轻链可变区的CDR1序列如SEQIDN0 :4 所示、CDR2序列如SEQ ID NO :5所示，CDR3序列如SEQ ID NO :6所示，或者所述重链或轻链 的⑶R序列与SEQ ID NO : 1-6所示序列具有至少70 %的同源性且保留相应母体序列生物 活性的变体序列，或所述重链或轻链的CDR序列为SEQ ID NO :1-6所示序列经删除、替换和 /或添加一个或多个氨基酸残基后获得的保留相应母体序列生物活性的变体序列。2. 如权利要求1所述的抗hPD-Ι抗体或其抗原结合片段，其包含上述重链⑶R1、⑶R2 和 CDR3 和轻链 CDR1、CDR2 和 CDR3。3. 如权利要求1或2所述的抗hPD-Ι抗体或其抗原结合片段，其重链可变区序列如SEQ ID NO: 7所示；和/或轻链可变区序列如SEQ ID NO:8所示，或者是与SEQ ID NO :7-8所示 序列具有至少70%的同源性且保留相应母体序列生物活性的变体序列，或是SEQ ID NO: 7-8所示序列经删除、替换和/或添加一个或多个氨基酸残基后获得的保留相应母体序列 生物活性的变体序列。4. 如权利要求1-3任一项所述的抗hPD-Ι抗体或其抗原结合片段，其重链氨基酸序列 如SEQ ID NO: 13所示；和/或轻链氨基酸序列如SEQ ID NO: 11所示，或者是与SEQ ID NO: 13或11所示序列具有至少70%的同源性且保留相应母体序列生物活性的变体序列，或是 SEQ ID NO :13或11所示序列经删除、替换和/或添加一个或多个氨基酸残基后获得的保 留相应母体序列生物活性的变体序列。5. 如权利要求1-4任一项所述的抗hPD-Ι抗体或其抗原结合片段，其为全长抗体，优选 地，其为IgGl或者IgG4同种型的全长抗体。6. 如权利要求1-5任一项所述的抗hPD-Ι抗体或其抗原结合片段，其为抗原结合片段， 优选地，其为Fab片段、Fab' 2片段或单链抗体。7. -种组合物，其包含权利要求1-6任一项所述的抗hPD-Ι抗体或其抗原结合片段。8. -种核酸分子，其编码权利要求权利要求1-6任一项所述的抗hPD-Ι抗体或其抗原 结合片段。9. 如权利要求8所述的核酸分子，其序列如SEQ ID NO :9或10所示，或者是与SEQ ID NO :9或10具有至少70 %同源性且仍编码具有本发明的抗体或其抗原结合片段的活性的变 体分子，或是与序列如SEQ ID NO :9或10所示的核酸分子完全互补或在中度至高度严格条 件下杂交的核酸分子。10. 如权利要求8或9所述的核酸分子，其序列如SEQ ID NO : 12或14所示，或者是与 SEQ ID NO :12或14具有至少70%同源性且仍编码具有本发明的抗体或其抗原结合片段的 活性的变体分子，或是与序列如SEQ ID NO : 12或14所示的核酸分子完全互补或在中度至 高度严格条件下杂交的核酸分子。11. 一种表达载体，其包含权利要求8-10任一项所述的核酸分子。12. -种宿主细胞，其包含权利要求11所述的表达载体。13. -种生产权利要求1-6任一项所述的抗体或其抗原结合片段的方法，其包括步骤： 将权利要求12所述的宿主细胞在适合所述抗hPD-Ι抗体或其抗原结合片段表达的培养条 件下表达，任选地，将表达的抗体或其抗原结合片段进行纯化。14.权利要求1-6任一项所述的抗体或其抗原结合片段在制备用于调控哺乳动物包括 人的免疫应答的试剂中的用途。
【专利摘要】本发明涉及抗人程序性死亡受体1抗体及其制备方法和用途。具体而言，本发明涉及利用天然抗体库筛选平台筛选获得的一株新型抗人程序性死亡受体1抗体，其能够特异性识别人PD-1分子，阻断PD-1/PD-L1以及PD-1/PD-L2相互作用，提高免疫应答水平。
【IPC分类】A61K39/395, A61P37/04, C07K16/28, C12P21/02, C12N15/13
【公开号】CN105669864
【申请号】CN201510981105
【发明人】王立燕
【申请人】杭州尚健生物技术有限公司
【公开日】2016年6月15日
【申请日】2015年12月23日