一种基因重组长效人促肾上腺皮质激素及其制备方法
【专利说明】-种基因重组长效人促肾上腺皮质激素及其制备方法 所属技术领域
[0001] 本发明采用基因工程、分子生物学等方法，制备出保留了人促肾上腺皮质激素 (ACTH)促进糖皮质激素产生的作用并且在血液中不易被代谢的基因重组长效ACTH。
【背景技术】
[0002] 血液当中存在多种降解蛋白质的酶类，天然存在的野生型人ACTH的体内半衰期很 短，只有约15分钟。ACTH在血液中的降解主要是由血液中的蛋白酶引起的，我们在分析ACTH 结构当中的血液蛋白酶降解位点的基础上，构建了野生型W及定点突变的多种ACTH- 祀T30a原核表达质粒，从中筛选出不易被蛋白酶降解的ACTH点突变体。ACTH是一种多肤，分 子量只有4.化D，在工程菌中不易单独表达纯化;所W我们在ACTH cDNA的5 '端连接一段编 码6个组氨酸的组氨酸标签化is化g)W及一段多肤连接物（简称Linker,核巧酸序列共计 144bp，表达5.3kD的多肤）的核巧酸序列，表达的融合蛋白不但可W抑制发酵阶段降解，同 时提高ACTH在裂解液中的溶解度，还可W用Μ柱初步纯化带有组氨酸标签的蛋白。为了在 多肤表达W后去除组氨酸标签，我们在化sTag-Linker与ACTH序列之间加入一段肠激酶 化K)底物"天冬氨酸一天冬氨酸一天冬氨酸一天冬氨酸一赖氨酸化DDDK)"的编码核巧酸序 列（简称邸St)。运样得到的融合序列简称为巧isTag-Linker-EKst-ACTH(融合核巧酸序列 共计28化P，表达的融合蛋白约10.6kD)"。因为肠激酶的切割位点恰好在D孤DK氨基酸序列 之后，工程菌中表达出来的带有组氨酸标签的ACTH融合蛋白在基因重组肠激酶 (recombinant EK)的作用下可W去除全部的化sTag-Linker肤链和孤孤K序列，得到不带有 多余氨基酸残基的ACTH多肤。
[0003] 采用柱层析方法分离纯化出野生型W及各种点突变的ACTH多肤W后，通过动物体 内实验W及小鼠肾上腺皮质瘤Y1细胞体外实验，筛选出保留ACTH促进糖皮质激素产生作用 并且在血液中不易被代谢的基因重组长效人ACTH。经过与野生型人ACTH对比，我们发现： ACTH的第5位谷氨酸突变为天冬氨酸化5D)不但可W保留天然ACTH的生物学活性，而且在血 液中比野生型更加稳定，可W作为长效ACTH应用。
[0004] 本专利说明书描述一种保留了天然ACTH促进糖皮质激素产生作用的在血液中不 易被代谢的突变型ACTH化抓)及其制备工艺。
【发明内容】
[0005] 1.发明的目的
[0006] 制备高纯度的、保留了天然ACTH促进糖皮质激素产生的生物活性的、在血液中不 易被降解的基因重组长效人促肾上腺皮质激素 (ACTH)。
[0007] 2.发明的技术方案 [000引见附图1。
[0009] 3.发明的有益效果
[0010] 本发明所制备的基因重组长效人ACTH，因其不但具备天然野生型ACTH的生物学活 性而且在血液中降解较慢，所W可W降低患者接受ACTH注射给药的剂量和次数，降低成本。
[0011] 另外，医药市场上现有流通的ACTH是从猪的脑垂体中提取，可能携带动物病毒。本 发明所采用的基因工程制备方法，不但可W获得高纯度的基因重组长效人ACTH，并且在制 备过程当中不使用动物材料，所W基本上消除了传播动物病毒的隐患。
【具体实施方式】
[0012] 1 .ACTH突变体的设计、原核表达体系构建W及及表达纯化 [001引 1. 1ACTH突变体的设计
[0014] ACTH的活性区域是氨基(N)端的1-24肤段，簇基末端的第25-39肤段即使被去除或 代谢掉依然具有活性，所W我们针对ACTH的1-24肤段设计点突变位点，不但要使其不易被 血液中的蛋白酶降解，还要保留ACTH的活性。我们利用化tDB蛋白酶数据库分析了人ACTH中 可能的酶切位点（见表1)，在此基础上设计了多种氨基酸点突变ACTH多肤，包括本发明专利 所描述的第5位谷氨酸突变为天冬氨酸的ACTH化5D)。（参见"说明书核巧酸和氨基酸序列 表"）
[001引表1 .ACT肿的血液蛋白酶切割位点
[0016] 1.2ACTH原核表达体系的构建及其表达纯化
[0017]我巧达了野生型(WT)ACTH、ACT肥4(具有活性的氨基末端1-24肤段似及人工设 计的ACTH化加），后者与野生型仅相差1个氨基酸，采用同样的表达和分离纯化方法进行制 备，具体如下：
[001引 1.2.1构建表达载体
[0019] 一方面，用Bam化、Sail双酶切携带组氨酸标签化is化g)的祀T30a空白质粒；另一 方面WACTH为模版，设计分别包含上述两个酶切位点W及邸St核巧酸序列的引物，PCR扩增 出结构为"BamHl酶切位点-EKst-ACTH-Sal 1酶切位点"的融合片段，然后用BamHl、Sal 1双酶 切。用T4连接酶将切得片段邸st-ACTH连接到前述切开的pET30a质粒上，构建出化sTag- Linker-EKst-ACTH-祀T30A质粒（其中的Linker是HisTag与ACTH之间的连接序列，核巧酸序 列长度为123bp，表达出的Linker肤链包含41个氨基酸）dACTH化加)表达质粒的构建，是W 构建好的ACTH(WT)质粒为模板，利用引入突变位点的引物，用重叠 PCR的方法扩增出E5D突 变目的片段，再按照前述方法将其连接到pET30a载体上。构建好的化sTag-Linker-邸st- ACTH-祀T30A全质粒环形示意谱图如附图2a所示；BamHl及Sail双酶切鉴定结果参见附图 2b。构建好的ACTH(WT)及ACTH化5D)的测序结果参见附图3及附图4。在上述实验中所用到的 扩增引物如表2所示。
[0020] 表2.PCR扩增引物表
[0021] 1.2.2诱导表达
[0022] 将构建好的载体采用热转化的方法(42°C，45秒）导入化21-DE3工程菌株。37°C恢 复比后接种到LB培养板上，37°C培养过夜后挑取单克隆菌落，接种到250mL LB培养基中，37 °C振荡培养至0D值为0.4~0.6之间时，加入ImM的IPTG，并将溫度降至25°C诱导表达化。
[0023] 1.2.3菌体破碎
[0024] 菌液在10000rpm，4°C下离屯、15min，弃去上清，加入菌体漂洗液（lOmM Tris-HCl， lOmM抓ΤΑ, lOOmM化Cl)洗涂Ξ次。按照每克湿菌加10ml裂解液的比例，加入菌体裂解液 (50mM Tris-Cl，300mM NaCiaOmM咪挫，ImM PMSF'pH 8.0)。
[00巧]因为N末端的化sTag-Linker提高了 ACTH的溶解度，表达的ACTH主要存在于裂解液 的上清液当中，所W1200化pm离屯、15min后，弃去包涵体沉淀，保留上清液用于下一步分离。
[0026] 1.2.4分离纯化
[0027] 1.2.4.1M 柱纯化
[0028] Μ柱用2倍柱体积20%乙醇清洗，再用2倍柱体积去离子水冲洗。更换流动相为平 衡缓冲液(50mM化is-HCl、300mM化ClUOmM咪挫，pH 8.0)，平衡5个柱体积。加样后，更换 流动相为漂洗液巧OmM化is-Cl、300mM化Cl、30mM咪挫，pH 8.0)，漂洗20个柱体积。更换流 动相为洗脱液巧OmM Tris-Cl、300Mm化Cl、250mM咪挫，pH 8.0)，弃去最初3血洗脱液后，收 集洗脱组分，每管ImL，收集10管，洗脱组分当中的ACTH融合蛋白条带如附图5所示。
[00 巧]1.2.4.2 脱盐
[0030] lOmL合并后的洗脱组分在1倍柱体积的肠激酶切缓冲液（20mM Tris-HCl，50mM NaCl，2mM CaCl2，pH 6.0)中透析平衡。
[0031] 1.2.4.3肠激酶酶切
[0032] 向透析过的样品中加入基因重组肠激酶(每0.5mg目的蛋白加入1U肠激酶），37°C， 在肠激酶酶切缓冲液中（20mM Tris-Cl，50mM化Cl，2mM CaC12，pH 6.0)切割16h，切得的 ACTH经Western-Blot鉴定，如附图6所示。
[0033] 1.2.4.4 超滤浓缩
[0034] 10血样品用分子量截留为3kD的超滤管(Amicon叫tra-15 3K)在25°C，4000g离屯、 30min，浓缩后样品体积约60化L。
[0035] (注:此步骤的替代方法是将样品在聚乙二醇溶液中透析，可用于工艺放大。）
[0036] 1.2.4.5CM弱阳离子柱层析纯化
[0037] CM-cellulose(Sigma-Al化ich)离子交换层析柱(40 X 1cm)，用5个柱体积的抑3.5 的0.05M醋酸-醋酸钢平衡缓冲液冲洗CM-cellulose层析柱(Sigma-Al化ich)，控制流速为 Iml/min。
[0038] 浓缩后的样品用平衡缓冲液稀释到1ml，用0.4微米滤膜过滤后加样，控制流速为 Iml/min，1.5个柱体积后用抑6.0的0.5M醋酸-醋酸钢缓冲液洗脱，控制流速Iml/min。待流 过22