Braf基因检测物在制备acth型垂体腺瘤分子病理诊断及分型产品中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及BRAF基因检测物在制备ACTH型垂体腺瘤分子病理诊断及分型产品中 的应用，属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 垂体瘤(Pitu;Ua巧adenomas)是人体最常见的神经内分泌性肿瘤，也是最常见的 脑肿瘤之一(发病率占第2位）。按其不同的内分泌特性，可分为泌乳素型、生长激素型、促肾 上腺皮质激素型，促甲状腺激素型、无激素型W及混合型等若干亚型。肿瘤通过异常分泌各 种激素，导致患者出现不孕不育、肢端肥大、Cushing综合症、甲亢等显著的内分泌素乱症 状。垂体瘤发病隐匿，生长缓慢，当患者出现临床症状前往就诊时，肿瘤往往已体积巨大，呈 侵袭性生长，压迫邻近重要解剖结构，导致患者出现垂体功能低下、双眼视力下降和烦神经 麻搏等神经功能缺失症状，严重影响患者的生活质量，甚至危及生命。
[0003] 促肾上腺皮质激素(ACTH)型垂体腺瘤系由垂体腺中的促肾上腺皮质激素细胞分 泌大量的ACTH，促进肾上腺分泌大量的皮质醇，最终导致内源性血皮质醇增多症，继而产生 一系列的代谢素乱和病理变化，特称之为库欣病(Cushing' S diease)，数量占 ACTH依赖性 库欣综合征的85 %。库欣病是一种严重的内分泌疾病，极少自行缓解，若不及时诊治，病死 率很高。该病患者主要表现为向屯、性肥胖，高血压，屯、血管疾病，代谢素乱综合征，骨质疏松 等。虽然库欣病的分子发病机制已被广泛研究，但ACTH产生过剩的致病遗传机制仍然不明 确。目前垂体瘤的临床治疗W手术切除为主，药物和立体定向放疗为辅，但只有少数患者通 过运些方法获得治愈，大多数经治病例在较短的症状缓解期后出现肿瘤复发。因此临床上 隧待新的治疗方法。此外，发现ACTH型垂体腺瘤可呈现截然不同的影像学表现及临床表型： 部分肿瘤体积微小，且病灶呈弥散状分布，手术前定位非常困难;而部分肿瘤体积巨大，同 时向周边侵袭性生长，手术中极难获得肿瘤全切除。推测它们可能分属于ACTH型垂体瘤两 种不同的亚型，对其应该采取不同的临床治疗策略。目前尚无特异性的分子诊断标记物可 将它们进行鉴别诊断。
【发明内容】
[0004] 本发明的一个目的是提供检测BRAF基因是否发生突变的物质的新用途。
[0005] 本发明提供了检测BRAF基因是否发生突变的物质在制备检测或辅助检测待测 ACTH型垂体腺瘤患者肿瘤亚型的产品中的应用。
[0006] 上述应用中，所述BRAF基因的核巧酸序列为序列1。
[0007] 上述应用中，所述检测BRAF基因是否发生突变的物质包括如下1)或2)或3):
[000引1)扩增所述BRAF基因的引物；
[0009] 2)含有所述1)的PCR试剂组；
[0010 ] 3)含有所逝）或所述2)的试剂盒；
[001。 所述扩增所述BRAF基因的引物为引物对1和/或引物对2;
[001 ^ 所述引物对1由序列2所示的单链DNA和序列3所示的单链DNA组成；
[001 ；3 ] 所述引物对袖序列4所示的单链DNA和序列5所示的单链DNA组成。
[0014] 本发明的另一个目的是提供一种检测BRAF基因是否发生突变的物质。
[0015] 上述物质中，所述检测BRAF基因是否发生突变的物质包括如下1)或2)或3):
[0016] 1)扩增所述BRAF基因的引物；
[0017] 2)含有所逝）的PCR试剂组；
[0018] 3)含有所述1)或所述2)的试剂盒；
[0019] 所述扩增所述BRAF基因的引物为引物对1或引物对2;
[0020] 所述引物对1由序列2所示的单链DNA和序列3所示的单链DNA组成；
[0021] 所述引物对2由序列4所示的单链DNA和序列5所示的单链DNA组成。
[0022] 本发明还有一个目的是提供一种检测或辅助检测待测ACTH型垂体腺瘤患者肿瘤 亚型的试剂盒。
[0023] 本发明提供的检测或辅助检测待测ACTH型垂体腺瘤患者肿瘤亚型的试剂盒包括 上述物质中的引物对1或引物对2。
[0024] 上述试剂盒还包含数据处理装置;所述数据处理装置内设模块;所述模块具有如 下功能:根据待测患者肿瘤组织中的BRAF基因是否发生突变确定所述待测患者为ACTH型垂 体腺瘤突变型还是ACTH型垂体腺瘤野生型，若待测患者肿瘤组织中的BRAF基因发生突变， 则待测患者为或候选为ACTH型垂体腺瘤突变型;若待测患者肿瘤组织中的BRAF基因未发生 突变，则待测患者为或候选为ACTH型垂体腺瘤野生型；
[00巧]所述BRAF基因的序列如序列表中序列1所不；
[0026] 所述ACTH型垂体腺瘤突变型患者的BRAF基因全长或部分片段序列与序列表中序 列1所示的BRAF基因全长或部分片段不完全一致；
[0027] 所述ACTH型垂体腺瘤野生型患者的BRAF基因全长或部分片段序列与序列表中序 列1所示的BRAF基因全长或部分片段完全一致；
[0028] 所述BRAF基因的部分片段序列为序列表中序列1的第19200-19609位或序列表中 序列1的第19221-19444位。
[0029] 上述应用或物质或试剂盒中，ACTH垂体腺瘤的两种亚型：肿瘤午夜血清皮质醇浓 度大于22ug/dl为野生亚型，野生亚型的肿瘤体积小，且病灶呈弥散状分布；肿瘤午夜血清 皮质醇浓度小于或等于22ug/dl为突变亚型，突变亚型的部分肿瘤体积巨大，同时向周边侵 袭性生长。突变亚型为BRAF基因野生型发生突变得到的基因。
[0030] 上述应用或物质或试剂盒中，所述突变共有两种突变方式:第1种突变方式为将序 列表中序列1所示的BRAF基因的第19324位核巧酸分子由A突变为T(杂合突变）；第巧中突变 方式为将序列表中序列1所示的BRAF基因的第19324位核巧酸分子由A突变为T(纯合突变）。 [0031 ]本发明的最后一个目的是提供一种检测或辅助检测待测ACTH型垂体腺瘤患者肿 瘤亚型的方法。
[0032]本发明提供的检测或辅助检测待测ACTH型垂体腺瘤患者肿瘤亚型的方法是检测 待测患者肿瘤组织中的BRAF基因是否发生突变，根据待测患者肿瘤组织中的BRAF基因是否 发生突变确定所述待测患者为ACTH型垂体腺瘤突变型还是ACTH型垂体腺瘤野生型，
[0033] 若待测患者肿瘤组织中的BRAF基因发生突变，则待测患者为或候选为ACTH型垂体 腺瘤突变型；
[0034] 若待测患者肿瘤组织中的BRAF基因未发生突变，则待测患者为或候选为ACTH型垂 体腺瘤野生型；
[0035] 所述ACTH型垂体腺瘤突变型患者的BRAF基因全长或部分片段序列与序列表中序 列1所示的BRAF基因全长或部分片段不完全一致；
[0036] 所述ACTH型垂体腺瘤野生型患者的BRAF基因全长或部分片段序列与序列表中序 列1所示的BRAF基因全长或部分片段完全一致。
[0037] 上述方法中，所述检测待测患者肿瘤组织中的BRAF基因是否发生突变的方法为如 下A)或B):
[003引 A)直接测序；
[0039] B)用能够扩增所述BRAF基因的引物扩增所述待测患者的基因组DNA。
[0040] 上述方法中，所述扩增所述BRAF基因的引物为引物对1和/或引物对2;
[0041 ] 所述引物对1由序列2所示的单链DNA和序列3所示的单链DNA组成；
[0042] 所述引物对2由序列4所示的单链DNA和序列5所示的单链DNA组成。
[0043] 本发明的实验证明：BRAF基因突变为ACTH型垂体腺瘤所特有，其他类型的垂体腺 瘤中未见该基因突变，可作为ACTH型垂体腺瘤一个特异性的分子病理诊断标记物。根据 BRAF基因是否突变可进一步将ACTH垂体腺瘤分为两种亚型，即BRAF突变型(BRAF基因突变） 和野生型(BRAF基因未突变），前者平均体积偏小，侵袭度小，午夜血清皮质醇浓度小于或等 于22ug/dl;后组平均体积偏大，侵袭度大，午夜血清皮质醇浓度大于22ug/dl。因此可W通 过检测BRAF基因是否突变判断ACTH垂体腺瘤的不同亚型，从而及时采取不同的临床治疗策 略。
【具体实施方式】
[0044] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0045] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0046] 实施例UBRAF基因是否突变在辅助鉴定ACTH型垂体腺瘤亚型中的应用
[0047] 对9例ACTH型垂体腺瘤的肿瘤与自身血样本DNA进行全外显子测序对比分析(测序 仪为Illumina化seq 2500)，结果在2例肿瘤中出现BRAF基因突变，肿瘤体积小，另外7例肿 瘤中的服AF基因为野生型，肿瘤体积大；因此将ACTH垂体腺瘤分为两种亚型:ACTH垂体腺瘤 野生型和ACTH垂体腺瘤突变型。
[004引将9例样本经Sanger验证排除假阳性后，在另外149例ACTH型垂体腺瘤（来源于复 旦大学附属华山医院，患者均知情同意）中进行BRAF基因基因型检测，共149例样本的检测 方法具体如下：
[0049] 首先根据BRAF基因（核巧酸序列为序列表中序列1)设计用于扩增其的引物对，共2 对引物对，每对引物对均能扩增BRAF基因部分片段(其中引物对1的扩增产物为序列表中序 列1的第19200-19609位；引物对2的扩增产物为序列表中序列1的第19221-19444位），引物 对具体序列如下：
[0050] 引物对l:lPrimer 化rward:5'-AGTAACTCAGCAGCATCTCAGG-3'（序列2);lPrimer Reverse: 5 ' -ACACATTTCAAGCCCCAAAA-3 '（序列3);
[0051] 引物对2:2Primer Forward:5'-GGCCAAAAATTTAATCAGTGGA-3'（序列