专利名称：活体外-活体内生产马铃薯微瘤的一种有效工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及活体外一活体内生产马铃薯微瘤的一种有效工艺。
在本发明申请之前，我们的匈牙利文专利申请(编号为1160/84)(尚未公开)提出一种工艺，采用植物组织培养基大量生产马铃薯的不被病毒和菌苗侵染的繁殖物质，该工艺包括在活体外营养介质中培养并繁殖马铃薯的芽尖组织细胞，然后芽生根即诱导微瘤形成，将这些活体生根的植物移植于温室中在母体植物体内生长或于活体外诱导瘤的形成。母体植物从这些微瘤中进一步生长，从而从这些籽苗，或小瘤中可得到繁殖物质，或者将微瘤作为繁殖物质。籽苗或瘤的形成可通过影响母体植物中的patatine合成而引导。
在上述专利申请中我们详细讨论了于活体外生产马铃薯繁殖物质的先有技术，发现虽有一些有价值的部分结果可供采用，但是没有一种复杂体系能够成功地用于大规模生产一种合适的繁殖物质。
用于马铃薯这种植物的特性，使大量繁殖马铃薯繁殖物质稍有些困难。
用传统工艺繁殖的马铃薯的增殖率较低(最高为每年10～12倍)，所以传统的栽培品种的维护需要8～12年。
目前市面上有的马铃薯栽培品种易受不同的真菌、细菌及病毒疾病的感染，传统的栽培品种的维护只能在这样的国家里才能实现，在那里由于有利的生态学因素使得感染水平很低。
马铃薯繁殖物质的含水量约为90%，故其运输和储存需要特殊条件。在一给定情况下，运输费用可能高于马铃薯在产地的价格。
在我们的匈牙利文专利申请(编号为1160/84)中所述的工艺可用来排除上述困难。采用此工艺可得到较高的增殖率，栽培品种维护所需时间可减少至1～2年，生产出健康的繁殖物质，通过微瘤的繁殖可将运输和保存的费用大大降低。
根据这项较早的工艺，马铃薯繁殖物质必须在实验室或温室中生产。因为投资和维护费用高-在两种情况下均如此-所以该工艺的效益依赖于单位面积上繁殖物质的产量。建温室比建实验室要昂贵。
在实验室生产的植物的移植需要温室中良好的技术水平(精确的土壤加热设施，湿度调节，额外照明)。记住，从实验室移植到温室的植物必须使其经济地生长，在微瘤生产的情况下，只有最佳使用温室才能保证这一点。
根据我们的较早的工艺，每平方米可生产400～800个(pcs)微瘤。这一事实限制了用于生产微瘤的温室使用面积的分配。
我们已经找到一种新方法来显著增加单位面积上微瘤生产效率。根据本发明所提出的工艺-此工艺不能从已知的先有技术中明显得出-可使较早的那项工艺的效率至少增加300～500%。
本发明的主题是，由已知组织培养方法生产的无病的被繁殖植物在无菌实验室环境下被植根于活体外液体培养基中，当该植物发育出根时，将营养培基改换为含有抗赤霉素化学试剂的培基，以便诱导瘤块产生，而植物就置于这种介质中培养。瘤块诱导产生后，用促进生根的化学试剂处理植物，然后将它们植根于温室中固体培养基中。通过周期性有规则地降低赤霉素水平至细胞分裂素含量的水平可限制植物的营养生长，并从根部收集产生的微瘤，然后用生根激素处理植物后，将其重新植根于固体培养基中，周期性有规则地用抗赤霉素的化学试剂处理，然后再次收集产生的微瘤。
本发明所述工艺可以实现用已知方法从组织培养基中生产无病植物。该无病毒和无疾病植物可用任何已知组织培养方法繁殖。用组织培养基繁殖的植物植根于液体培养基中。生根期过后-植物有了邻根-将生根培养基改换为用于诱导瘤块的培养基，其主要是MS培养基(MurashigeandSkoogPhysiol.Plant.15.473-397/1962/)，其中无机氮源含量不同(这里为原始数据的10%)，并且植物的氮需求由诱发过程中外加入有机氮源(谷氨酰胺，天门冬酰胺)保证。在诱发培养基中蔗糖的浓度高于MS培养基中的用量，较优浓度为40g/l蔗糖。
诱发培养基含高浓度的细胞分裂素，平均5～10毫克/升为合适。用于诱发瘤块的培基主要是不同的抗赤霉素。这些化学试剂是香豆素(氧杂萘邻酮)及其衍生物氯-胆碱-氯化物(ccc)，最好用二氯-乙酰-六甲叉-亚胺。最后这种具有限制生长和解毒效果。在植物中它对于瘤块的诱发具有一定效果，此效果是通过降低赤霉素相对于细胞分裂素的水平来实现的，它还对植物的细胞膜结构具有有益影响。根据本发明的工艺，采用浓度为6～20毫克/升的二氯-乙酰-六甲叉-亚胺。
植物培养于18～20℃诱发介质中，8小时光照，10～14天。
诱发后，马铃薯瘤块于温室中固体培基中发育。在移植至温室之前将诱发培养基从根部洗去，为促进生根和防止植物感染根紧张病(Rhizoctonia)，将植物浸于一种液体中，其含0.05毫克/升吲哚乙酸和0.2%Previcur-N(即丙基-氮-13-二甲基-氨基-丙基/-氨基甲酸酯盐酸盐)。
移植约过三周温室中的植物生根以后，每周给植物用一种溶液喷洒一次，其含10毫克/升的香豆素和/或5～10毫克/升二氯-乙酰-六甲叉-亚胺，如此，植物保持很小但它们的生理状态适于瘤块形成。必要的话，可将植物掐断以防止进一步生长。
在移植到温室中之后(约1.5至2月以后)，将植物簇从土壤中移出，从根部收集大于0.5cm的瘤块。以这种方式培养的植物第一次可收获约每平方米1000个瘤块。
在移出植物和瘤块时根部可能会受损伤。植物簇再次浸入含0.05毫克/升的吲哚乙酸和0.02%的Prericur-N的溶液，然后植入原土壤或新土壤。生根期过后，重复早先的处理(10毫克/升香豆素和/或6毫克/升二氯-乙酰-六甲叉-亚胺)。3～4周后，可移去植物和瘤块，用上述溶液处理，再次移植植物。第二批瘤块每平方米有2000～3000块。当植物移植4个月后，将它们移去抛弃。用上述方法处理过的植物可生产每平方米2500～4000株瘤块(数量取决于栽培品种)，而且这个数量比以前那种方法高3～4倍。
所收集的瘤块栓化两周，在散射光和70%湿度下，分级，并于2～5℃下贮存。
本发明所采用的工艺每年可重复2.5次，这意味着微瘤生产效率比先前那种工艺提高4-5倍。
下例示范本项发明实例“Somogy Gyongye”马铃薯栽培品种按已知方法用组织培养基繁殖。得到适当的植物数量以后，将苗植根于液体培基中。生根两周后，将该液体培基改换为另一种能诱发瘤块的液体培基，其成份为Murashige和Skoog(MS)基础培基，1/10浓度，NH4NO3(硝酸钾)，20毫克/升谷氨酸，40克/升蔗糖，5毫克/升苄基腺嘌呤，25毫克/升香豆素和6毫克/升二氯-乙酰-六甲叉-亚胺。植物培养于这种培基中以诱发瘤块10天，8小时200勒克司/平方米照明，18℃。诱发以后，将植物簇从培养瓶中移出，用自来水冲洗植物并抖动以移去多余的水量，并浸入含0.08毫克/升吲哚乙酸和0.2% Previcur-N溶液中，然后植入泥炭混合物，50簇植物/平方米。生根后，植物的小脊形成(2厘米)，从移植后的第二个星期开始用含有10毫克/升香豆素和6毫克/升二氯-乙酰-六甲叉-亚胺的溶液喷洒植物，每周一次。生根后-1.5～2个月以后-生长茂盛的植物簇从生长床的土壤中移出。大于0.5厘米的瘤块用专用梳或手工收集。将移出的植物簇上的泥炭和土壤抖掉，然后浸入含有0.08毫克/升吲哚乙酸和0.2%Previcur-N的溶液，再植入原土壤并浇灌。继续用含10毫克/升香豆素和6毫克/升二氯-乙酰-六甲叉-亚胺的溶液喷洒。3～4周后重复移去和植根过程。植物可被掐断以保持适当小的尺寸。这些没有根的插条可用作进一步的繁殖和得到瘤块。
以此种方法诱发和生长的“SomogyGyongye”植物在4个月中可达3500株微瘤/平方米。
权利要求
1.一种用于从活体外由组织培养基繁殖并生根于液体培基的植物中生产马铃薯微瘤的工艺，其特征在于，瘤块形成是在活体外于生根的植物上诱发的，所诱发的植物植根于温室中固体培养基中，瘤块在温室中发育，通过周期性有规则地喷洒抗赤霉素试剂来限制植物茎杆的生长，收集发育好的微瘤后，将植物重新植回土壤，进一步限制茎杆的生长，在植物的植被期期间，周期性重复移去和再植回的过程。
2.权利要求1中所述的工艺，其特征在于瘤块形成是用MS基础培养基诱发，其含有1/10浓度NH4NO3(硝酸铵)和KNO3(硝酸钾)，20毫克/升谷氨酸，40克/升蔗糖，5毫克/升苄基腺嘌呤，25毫克/升香豆素和6毫克/升二氯-乙酰-六甲叉-亚胺。
3.权利要求1中所述的工艺，其特征在于在植入温室中以前用一种促进生根的化学试剂处理植物，如果需要的话，用一种防止感染根紧张病的试剂处理植物。
4.权利要求3中所述的工艺，其特征在于，这种处理是用含吲哚乙酸和-如果需要的话-丙基-氮-(3-二甲基-氨基-丙基)-氨基甲酸酯盐酸盐溶液完成的。
5.在权利要求1至3中任何一项所述工艺，其特征在于，所移植植物用香豆素和/或二氯-乙酰-六甲叉-亚胺处理。
6.权利要求1中所述工艺，其特征在于收集完微瘤后，在移植之前，再次用一种溶液处理植物，该溶液含有能促进生根的化学试剂以及，如果需要的话，可含有另一种能防止感染根紧张病的化学试剂。
7.权利要求1中所述工艺，其特征在于移植的植物用香豆素和/或二氯-乙酰-六甲叉-亚胺来处理。
8.权利要求1至7中任何一项所述工艺，其特征在于在植物生长期间可重复数次移去植物，收集微瘤，和重新植入植物的过程。
全文摘要
本发明涉及一种在活体外-活体内生产马铃薯微瘤的有效工艺，即在活体外瘤块产生是在活体外生根的植物上诱发的，这些植物被植入温室，用抗赤霉素试剂处理植物以限制茎秆的生长，收集微瘤，移植植物，适当处理后，可周期性收集植物生长期所产生的微瘤。
文档编号A01G7/00GK1035844SQ88101458
公开日1989年9月27日 申请日期1988年3月19日 优先权日1988年3月19日
发明者芬雷克·福林, 佐里塔·奥斯瓦特, 乔瑟夫·巴罗特 申请人:诺沃特拉德公司