新的诱导型应激行为动物模型的制作方法
【专利说明】新的诱导型应激行为动物模型
[0001] 本发明涉及一种产生诱导型应激动物模型的方法，所述方法包括遗传修饰非人脊 椎动物以表达在下丘脑-垂体-肾上腺轴细胞中可以通过光激活的一种或多种蛋白，其中 可以通过光激活的蛋白能够诱导（i)从下丘脑前区（rostral hypothalamus)的室旁核中 的神经元释放促皮质素释放激素（CRH)和/或精氨酸-加压素（AVP) ;(ii)从垂体前叶中 的促肾上腺皮质激素细胞释放促肾上腺皮质激素；和/或（iii)从肾上腺皮质中的细胞释 放糖皮质激素。本发明进一步涉及通过本发明的方法获得的应激动物模型以及所述动物模 型在筛选用于预防、改善或治疗应激和/或应激相关疾病的化合物中的用途。此外，本发明 还涉及一种筛选用于预防、改善和/或治疗应激和/或应激相关疾病的化合物的方法以及 在鱼中分析应激行为的方法。
[0002] 在本说明书中，引用包括专利申请和制造商的使用手册在内的许多文件。虽然不 认为与本发明的专利性相关，但通过引用将这些文件的整体内容加入本文。更具体地，所有 引用的文件均援引加入本文，与具体并单独地表明每个单独的文件援引加入本文相同。
[0003] 应激是生物通过激活整体上称作应激应答的一套生理和行为应答来抵消的受威 胁的稳态状态（Johnson et al.，1992)。应激应答包括两个系统。负责中间反应的交感-肾 上腺髓质系统以及负责能量重新分配和应激应答终止的下丘脑_垂体-肾上腺（HPA)轴 (de Kloet et al.，2005)。对应激应答，下丘脑前区的室旁核（PVN)中的神经元将促皮质 素释放激素（CRH)和精氨酸-加压素（AVP)释放入下丘脑-垂体门脉循环。垂体前叶中这 些信号的受体结合触发促肾上腺皮质激素（ACTH)从促肾上腺皮质激素细胞释放入血液。 然后ACTH刺激肾上腺皮质中的细胞分泌糖皮质激素。糖皮质激素是HPA-轴的最终效应子 (de Kloet et al.，2005)，具有周围和中枢神经系统中的革巴标（Munck et al.，1984)，包括 首先触发应激应答的下丘脑中的细胞，因此形成抑制CRH和ACTH释放的负反馈（Dallman et al.，1994)。生理应激相关物包括免疫系统、心血管功能和代谢中的改变（Munck et al.，1984, Sapolsky et al.，2000)，而行为应激相关物包括增加的认知和集中注意力，生 殖行为减少，以及抑制食欲和进食（Chrousos and Gold, 1992)。
[0004] 虽然对于动物的短期存活至关重要，但是应激应答的不足或过度激活可以是有害 的，并且肥胖、抑郁和痴呆已与应激应答障碍有关（Raber，1998)。
[0005] 尽管其具有重要性，但是完全功能应激应答系统的开发和负责应激应答障碍的分 子机制仍不确定。因此，在动物模型中精确地控制并检测应激应答的能力在测试和开发应 激相关病症的药物中是非常宝贵的。目前，仍缺少良好的以高通量方式测试应激障碍的动 物模型。目前慢性应激的小鼠模型的产生是非常劳动密集型的，并且方案和所得的表型 根据进行实验的实验室变化很大。具体地，特异性靶向HPA轴的动物模型利用基因敲除或 过量表达，并且不提供时间控制。例如，由于CRH在应激应答调节中的中心作用及其与情 感病症的关系，因此大量工作已集中于产生具有受损的CRH信号的小鼠模型（Muller and Holsboer 2006)。但是，全面敲除CRH的小鼠未显示应激诱导的行为受损，这可能表明其 他CRH样分子在介导应激应答中的作用或者在这些突变体中存在补偿机制（Weninger et al. 1999)。在另一方面，CRH受体I(CRHRl)或CRH受体2 (CRHR2)全面缺陷小鼠表现出焦 虑和受损的应激应答（Bale and Vale 2003 ;Smith et al. 1998 ;Timpl et al. 1998)。相 似地，CRH全面过量表达的小鼠表现出HPA轴失调以及慢性应激样自主神经和生理改变 (Dirks et al.2002;Groenink et al.2002)。但是，因为CRH和CRH受体在脑中的多个部 位中表达，这些研宄不可以区分CRH的下丘脑神经内分泌功能与其在通过额外的下丘脑受 体部位调节不同行为中的作用。
[0006] 为了克服这个问题，已产生前脑特异性的CRH过量表达小鼠（Lu et al. 2008)以 及边缘系统特异性的CRHRl敲除小鼠（Muller et al. 2003)。最近在特定神经元群体中 CRHRl的祀向缺失鉴定了 CRHRl在谷氨酸能和多巴胺能神经元中的不同作用（Refojo et al. 2011)。虽然这些研宄已对理解CRH功能作出了重要贡献，但是事实上一个重要限制是 这些基因操作不允许时间控制。甚至在特定细胞类型中，基因功能的敲除或过量表达长期 组成型发生。这可以触发补偿机制，以不会正常发生的方式改变神经回路。为了模仿急性、 重复或甚至长期暴露于人群体中发生的应激并与抑郁有因果关系，需要其中仅在特定细胞 群体中可以时间控制CRH活性的动物模型。
[0007] 相似地，到目前为止不存在可诱导的垂体或肾上腺皮质功能失活的方法。
[0008] 因此，尽管已将大量精力投入到阐明应激应答的机制，但是到目前为止不存在使 得能够在体内简单、时间控制并非侵入性分析应激行为的动物模型。因此，仍然需要提供这 类动物模型和测试方法，例如用于药物发现。
[0009] 本申请权利要求书中所表征的实施方案解决了这种需要。
[0010] 因此，本发明涉及一种产生诱导型应激动物模型的方法，所述方法包括遗传修饰 非人脊椎动物以表达在下丘脑-垂体-肾上腺轴细胞中可以通过光激活的一种或多种蛋 白，其中可以通过光激活的蛋白能够诱导（i)从下丘脑前区的室旁核中的神经元释放促皮 质素释放激素（CRH)和/或精氨酸-加压素（AVP) ;(ii)从垂体前叶中的促肾上腺皮质激 素细胞释放促肾上腺皮质激素；和/或（iii)从肾上腺皮质中的细胞释放糖皮质激素。
[0011] 如本文所用，术语"诱导型应激动物模型"指其中当需要时研宄者可以激活应激的 动物。按照本发明，如下文详述的，所述动物表达可以通过光激活的一种或多种蛋白。所述 蛋白的光激活启动沿下丘脑-垂体-肾上腺（HPA)轴的信号传导，因此模仿在动物中观察 到的天然存在的应激应答。
[0012] 在不同脊椎动物中存在负责能量重新分配和应激应答终止的下丘脑-垂体-肾上 腺（HPA)轴中的差异是本领域公知的。例如，在硬骨鱼类中，肾间腺（inter-renal gland) 产生皮质类固醇（皮质醇为主要终产物），因此它们的应激轴常称作下丘脑-垂体-肾间 (HPI)轴（Wendelaar Bonga, 1997)。按照本发明，这些变化意图落在术语HPA下，即使在每 种情况下未明确讨论。因此，当提到HPA时，还包括HPI。
[0013] 按照本发明，所述动物是遗传修饰的非人脊椎动物。所述非人脊椎动物可以是任 何非人脊椎动物。优选地，所述非人脊椎动物为非人哺乳动物、鸟、鱼或蛙。甚至更优选地， 所述非人哺乳动物选自啮齿动物、狗、猫科动物、灵长类、兔、猪和反刍动物；所述鸟选自鸡、 火鸡、雉鸡、鸭、鹅、鹌鹑以及包括鸵鸟、鸸鹋和食火鸟在内的平胸类鸟；所述鱼选自斑马鱼、 青鏘、鳟鱼、鞋鱼、金枪鱼或鲱鱼；而所述娃选自非洲爪蟾（Xenopus)属。
[0014] 如本文所用，术语"遗传修饰非人脊椎动物"指改变所述非人脊椎动物的遗传组 成。按照本发明，这类改变指引入编码可以通过光激活的一种或多种蛋白的核酸序列，从而 其可以转录并翻译为相应的（功能）蛋白。
[0015] 本领域已知许多不同的用于修饰非人脊椎动物基因组的策略，按照本发明全部均 可以采用。例如，通过用于靶向基因修饰的同源重组（HR)技术或者通过使用基因捕获或转 座子介导的诱变，可以将编码可以通过光激活的一种或多种蛋白的核酸序列作为转基因引 入基因组。
[0016] 为了产生传统的转基因动物，将编码可以通过光激活的一种或多种蛋白的核酸序 列注射入各动物的受精卵。将胚胎植入代孕母亲的子宫，并且一些后代会表达各核酸序列。 这种常规的转基因方法提供相对简单和便宜的优势，同时可以实现高水平的基因表达。用 这种方法，整合的位点是随机的，因此不允许基因组的靶向修饰。
[0017] 除了转基因方法，通过同源重组进行基因修饰也是可能的。最初将核酸序列装配 入特别设计的基因靶向载体，从而待插入的序列两侧是靶序列的基因组片段，其用作同源 区以开始同源重组。通常，然后用基因靶向载体转染ES细胞，分离重组ES细胞克隆，随后将 其注射入胚泡以通过嵌合体的生殖系传播突变的等位基因并建立突变系。（Hasty P，Abuin A，Bradley A.，2000,In Gene Targeting:a practical approach, ed. AL Joyner, pp. 1-35. Oxford:Oxford University Press ；Nagy A，Gertsenstein M, Vintersten K，Behringer R., 2003. Manipulating the Mouse Embryo. Cold Spring HarbourjNew York:Cold Spring Harbour Laboratory Press)〇
[0018] 此外，通过将锌指-或TAL-核酸酶连同待插入的序列以及与靶序列同源的侧翼区 引入卵母细胞，最近的方法使得能够在卵母细胞中通过同源重组来基因靶向（参见例如WO 2011/051390 和 WO 2011/154393)。
[0019] 为了仅在特定细胞类型中或在特定发育阶段研宄基因功能，可以产生条件突变 体。
[0020] 如在目前的情况下，当目标是条件基因激活时，编码待激活的基因（即可以通过 光激活的一种或多种蛋白）的核酸序列包含另一序列，例如编码抗性标记的基因，两侧是 位点特异性DNA重组酶的两个重组酶识别位点（RRS)。排列这个额外序列的存在，从而其防 止例如通过移码或多腺苷酸化信号的存在表达待激活的基因。然后重组导致两侧为RRS的 额外序列的缺失，因此导致在表达重组酶的细胞/组织中表达待激活的基因。
[0021] 条件突变体需要产生两个转基因系：一个系包含如上文所述的两侧为RRS的 片段，通过在ES细胞中基因靶向获得；以及在一种或多种细胞类型中表达相应的重组 酶的第二转基因系。通过杂交这两个系产生条件突变体，从而根据第二转基因系中重组 酶表达的模式，革G基因失活和激活以空间和时间限制方式发生（Nagy A, Gertsenstein Mj Vintersten K,Behringer R. 2003. Manipulating the Mouse Embryo, third edition ed. Cold Spring Harbour,New York: Cold Spring Harbour Laboratory Press ； Torres RMj Klihn R. 1997. Laboratory protocols for conditional gene targeting. 0xford:0xford University Press)〇
[0022] 作为高通量方法，基因捕获是用来实现将所关注的核酸序列插入细胞基因组中预 先表征的基因座的另一方法。已开发的示例性基因捕获技术是基于以前引入基因座的盒的 置换，例如 Baer and Bode 2001 (J. Curr Opin Biotechnol. 2001 ; 12 (5))中描述的重组酶 介导的盒交换（RMCE)或 Cesari et al.2004(Genesis 2004 ;38(2))中描述的 Flp-RMCE 或 例如WO 2011/064262中描述的方法。
[0023] 此外，将突变引入基因组的有力方法是转座子介导的掺入诱变，其已变为无脊椎 动物中非常宝贵的基因组工具，并且还已获得在脊椎动物如鱼中诱变的重要性。
[0024] 术语"转座子"指可以在基因组内移动（转置）的DNA片段。基因不仅可以通过 转座子插入而失活，转座子还可以将所关注的转基因引入基因组。与上文所述的方法相似， 转座子也可以携带表达转基因必需的调节元件，因此允许所述基因的成功表达。此外，转座 子可以或可以不编码催化其在基因组内重新定位和/或复制必需的酶转座酶。当转座子不 编码其转座酶时，在本身不表达相关转座酶的细胞中可能需要反式表达所述酶。此外，转座 子包含其调动所需要的序列，即包含转座酶结合位点的末端重复序列。
[0025] 转座子可以源自细菌或真核转座子；并且转座子可以源自I类或II类转座 子。II类或DNA介导的转座元件优选用于基因转移应用，因为这些元件的转座不包 括可以将不期望的突变引入转基因的反转录步骤（I类或反转录元件的转座中所涉及 的）（Miller, A. D.，1997,''Development and applications of retroviral vectors". Retroviruses:843 (Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York,) ；Verma, I. M. and Somia, N. , 1997, 〃Gene therapy ? promises, problems and prospects". Nature 389:239)。
[0026] 已设计病毒和非病毒技术以促进转基因穿透生物膜。当转座子用于插入诱变筛选 时，转座子载体常包含4个主要类别的构建体以快速鉴定突变的基因。这些包含报道基因， 其应当根据整合的遗传背景表达。在增强子捕获中，报道物的表达需要存在基因组顺式调 节子以作用于整合的构建体内的衰减启动子。启动子捕获根本不含启动子。这些载体仅 在外显子读框内或接近表达的基因的启动子下游时表达。在PolyA捕获中，标记基因缺少 PolyA信号，但是包含剪接供体（SD)位点。因此，当整合入内含子时，可以合成融合转录物， 其包含标记和捕获基因的下游外显子。基因捕获（或外显子捕获）也缺少启动子，但是在 标记基因之前装有剪接受体（SA)。如果载体整合入表达的基因，并且发生报道物和上游外 显子之间的剪接，则发生受体激活。基因捕获和PolyA捕获盒可以组合。在这种情况下，用 启动子改良PolyA捕获部分的标记，从而载体还可以捕获下游外显子，并且可以获得捕获 基因的上游和下游融合转录物。上述构建体还提供通过利用例如LacZ或荧光蛋白作为标 记蛋白可视化突变基因的空间和时间表达模式的可能性。
[0027] 在脊椎动物基因组中使用转座子的里程碑是产生睡美人（SB)元件（Ivies，Z. et al.，1997:''Molecular reconstruction of Sleeping Beauty, a Tcl-Iike transposon from fish, and its transposition in human cells". Cell 91(4):501)〇 睡美人车专座 在不同脊椎动物类别的细胞中有效（Izsvak，Z.et al.，2000:〃Sleeping Beauty, a wide host-range transposon vector for genetic transformation in vertebrates^. J Mol Biol. 302(1) :93 ；Lu,B.et al.,2007:"Generation of rat mutants using a coat color-tagged Sleeping Beauty transposon system". Mamm Genome 18(5):338; Luo, G. et al. , 1998:''Chromosomal transposition of a Tcl/mariner-like element in mouse embryonic stem cells'Proc Natl Acad Sci USA 95 (18) : 10769 ；Horie, K. et al. , 2003:^Characterization of Sleeping Beauty transposition and its application to genetic screening in mice". Mol Cell Biol 23(24) :9189)。将期望的多核苷酸 位点特异性靶向入DNA序列的转座子系统的进一步开发描述于例如WO 2004/070042、TO 2004/069995 和 TO 2004/069994。
[0028] 为了产生转基因斑马鱼，现有技术方法利用分离自青鏘系统的转座子 To 12 (Kawakami K. (2007) )〇
[0029] 优选地，通过同源重组或转座子介导的诱变将编码可以通过光激活的一种或多种 蛋白的核酸序列插入受体非人脊椎动物的基因组。
[0030] 可以将编码可以通过光激活的一种或多种蛋白的核酸序列插入受体非人脊椎动 物的基因组，从而所述核酸序列在非人脊椎动物的基因组中存在的内源调节序列的控制之 下。或者，可以将编码可以通过光激活的一种或多种蛋白的核酸序列连同确保它们表达所 需的调节序列插入非人脊椎动物的基因组。优选地，将编码可以通过光激活的一种或多种 蛋白的核酸序列可操作地连接至允许在脊椎动物细胞中表达的表达控制序列。这类调节序 列是本领域技术人员公知的，并且包括但不限于确保转录起始的调节序列、内部核糖体进 入位点（IRES) (Owens, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98 (2001)，1471-1476)、病毒 2A 肽（Tang et al. J Neurosci. (2009)29(27):8621-9)以及任选存在的确保转录终止和转录物稳定 的调节元件。确保转录起始的转录元件的非限制性实例包括翻译起始密码子，增强子如 SV40-增强子，绝缘子和/或启动子，例如巨细胞病毒（CMV)启动子、SV40-启动子、RSV-启 动子（劳斯肉瘤病毒）、IacZ启动子、gailO启动子、人延伸因子I a -启动子、CMV增强子、 CaM-激酶启动子或苜蓿银纹夜蛾多核型多角体病毒（AcMNPV)多面体启动子。按照本发明 特别优选的启动子序列包括在下丘脑-垂体-肾上腺轴细胞中表达的基因的启动子，例如 参与编码应激控制激素的基因的表达的启动子，如促肾上腺皮质激素释放因子（CRH)、精 氨酸加压素（AVP)、下丘泌素（Hcrt)等的启动子；在主要应激控制区下丘脑的室旁核中表 达的转录因子的启动子，例如 orthopedia(Otp)、single-mined I (Siml)、Nkx2、Fezf2 等； 在垂体促肾上腺皮质激素细胞中特异性表达的基因的启动子（参见例如Liu et al. Mol Endocrinol. 2003May ;17 (5) :959-66);参与类固醇生成并在肾上腺中特异性表达的基因 的启动子，包括类固醇生成因子I (SFl)、细胞色素p450侧链切割（P45〇SCC)、类固醇生成急 性调节蛋白（StAR)和30-羟基类固醇脱氢酶（3b-HSD);以及例如也称作MC2R的ACTH受 体的启动子