。确保转录终止的调节元件的非限制性实例包括V40-poly_A位点、tk-poly-A 位点或SV40、IacZ或AcMNPV多面体多腺苷酸化信号，其包括在编码可以通过光激活的一种 或多种蛋白的核酸序列的下游。额外的调节元件可以包括翻译增强子，编码分泌信号的核 苷酸序列，或者根据所用的表达系统，能够指导表达的多肽至细胞室的信号序列。所有上述 序列是本领域公知的。
[0031] 此外，可以将编码可以通过光激活的一种或多种蛋白的核酸序列连同选择标记插 入非人脊椎动物的基因组。选择标记的实例包括提供对新霉素、氨苄西林、潮霉素等的抗性 的标记，并且是本领域公知的。
[0032] 编码可以通过光激活的一种或多种蛋白的核酸序列可以包含在能够指导 所述核酸序列的复制和表达的表达载体中。包含上述调节元件的合适的表达载体 是本领域已知的，例如 Okayama-Berg cDNA 表达载体 pcDVl (Pharmacia)、pRc/CMV、 pcDNAl、pcDNA3 (Invitrogen)、pSPORTl (GIBC0 BRL)、Gateway 质粒（Invitrogen)或 PGEMHE(Promega)。为了在斑马鱼中转基因，核酸序列可以例如利用T〇12试剂盒中的载体 如本领域所述进行表达，例如 Kwan et al. (Dev Dyn. 2007 Nov ;236(11) :3088-99)。
[0033] 用于产生遗传修饰的非人脊椎动物的核酸序列可以设计用于直接引入，例如注 射，或者通过电穿孔（利用例如 Multiporator (Eppendorf)或 Genepulser (BioRad))、 PEI (Polysciences Inc. Warrington, Eppelheim)、Ca2+介导的转染或通过脂质体（例如： 〃Lipofectamine〃（Invitrogen))、非脂质体化合物（例如：〃Fugene〃（Roche))、脂质体、口莖 菌体载体或病毒载体（例如腺病毒、反转录病毒、慢病毒）引入细胞。此外，还可以使用杆 状病毒系统或者基于痘苗病毒或Semliki Forest病毒的系统。
[0034] 按照本发明，核酸序列包括DNA，如cDNA或者包括外显子和内含子序列的基因组 DNA，以及RNA，优选mRNA。优选地，编码可以通过光激活的一种或多种蛋白的核酸序列为 cDNA。
[0035] 在本文中可交换地称作可光激活的蛋白或光激活蛋白的可以通过光激活的蛋白 是通过暴露于光来激活其功能的蛋白。光激活蛋白的非限制性实例包括微生物视蛋白、光 门控通道和光激活腺苷酸环化酶。
[0036] 诸如channelrhodopsin和盐细菌视紫红质的微生物视蛋白已成功地用于幼体斑 马鱼以触发逃避反应（Douglass et al.，2008)，控制心功能（Arrenberg et al.，2010)，鉴 定不同组的控制游泳的神经元（Arrenberg et al.，2009)，以及负责眼运动的神经元的革巴 向操作（Schoonheim et al.，2010)。Channelrhodopsin和盐细菌视紫红质为光门控离子 通道，其在光激活时允许神经元去极化/超极化，分别在480nm和570nm处具有最大吸收。
[0037] 已报道在脊髓神经元中表达的光门控通道（LiGluR)诱导尾跳动（Wyart et al.，2009)。LiGluR是基因编码的谷氨酸通道，其以可光调节方式打开，当分别在500nm和 380nm处的可逆光致异构化是打开和关闭。
[0038] 与膜电压调节物一起，还已报道另一类光激活蛋白，其调节广泛存在的第二信使 分子环腺苷酸（cAMP)。在单细胞鞭毛虫小眼虫（Euglena gracilis)中光激活腺苷酸环化 酶（PACa )对于光回避非常重要。这种酶包含BLUF型光受体结构域（使用黄素腺嘌呤二核 苷酸的蓝光传感器），使得其对蓝光敏感（Iseki et al.2002)。光激活之后，在HEK293细胞 中PACa亚基的表达提高cAMP水平。此外，据显示光诱导的cAMP增加足以触发细胞内途 径。这在非洲爪蟾卵母细胞中通过cr-通道引起的光诱导的血浆膜电导增加证实，cr-通 道依赖于PKA (cAMP依赖性蛋白激酶A)激活（Schroder-Lang et al.，2007)。已报道PAC a 在果幡（Drosophila)中调节多动、严寒和梳毛（Schroder-Lang et al.，2007)，以及在秀 _隐杆线虫（Caenorhabditis elegans)调节运动行为（Weissenberger et al.，2011) 〇 此外，最近已报道具有较低黑暗活性、较高光活性和比PACa小的来自细菌贝氏硫细菌 (Beggiatoa)的新PAC (bPAC)，并且成功用于大肠杆菌（E. coli)、非洲爪蟾卵母细胞和果幡 (Stierl et al.，2011)。bPAC 在 450nm 的波长下可激活。
[0039] 暴露于光以激活所述蛋白可以通过本领域公知的方式来完成。例如，由于它们 身体的大小和透明性，可以将幼体斑马鱼或青鏘简单地暴露于光，优选在如上文所示的各 波长下，以便激活光激活蛋白。或者，当采用较大且不透明的动物如小鼠或大鼠时，可以通 过本领域公知的方法在表达光激活蛋白的细胞附近植入光纤，例如Wang et al. 2011或 Anikeeva et al.2011〇
[0040] 按照本发明，下丘脑-垂体-肾上腺轴的细胞包括下丘脑的室旁核（PVN)中的神 经内分泌细胞、垂体前叶中的促肾上腺皮质激素细胞和肾上腺皮质中的类固醇生成细胞。
[0041] 如下文详细描述的，可以通过光激活的蛋白能够诱导特定激素和糖皮质激素的释 放。在这个上下文中，诱导释放包括诱导从细胞释放现有激素和/或糖皮质激素以及诱导 表达或形成并释放所述新形成的激素和/或糖皮质激。换句话说，光激活蛋白可以诱导释 放或者可以诱导生物合成并随后释放所述激素和/或糖皮质激素。
[0042] 按照本发明，光激活蛋白诱导（i)从下丘脑前区的室旁核中的神经元释放促皮质 素释放激素（CRH)和/或精氨酸-加压素（AVP);和/或（ii)从垂体前叶中的促肾上腺皮 质激素细胞释放促肾上腺皮质激素（ACTH);和/或（iii)从肾上腺皮质中的细胞释放糖皮 质激素。关于从下丘脑前区的室旁核中的神经元释放CRH和/或AVP，释放这两种激素之一 足以介导应激应答，但是按照本发明，还考虑并优选诱导这两种激素的释放。可以从肾上腺 皮质的细胞释放的糖皮质激素包括例如人和鱼中的皮质醇以及啮齿动物中的皮质酮。
[0043] 技术人员知道怎样选择合适的光激活蛋白以成功地诱导各激素或糖皮质激素的 释放。例如，并且如下文所附实施例所示，利用编码ACTH前体的pome基因的启动子可以在 垂体细胞中特异性地表达光激活腺苷酸环化酶（PAC)如贝氏硫细菌光激活腺苷酸环化酶 (bPAC)。这种方法确保在表达PAC的垂体细胞中产生cAMP，反过来这对于这些垂体细胞中 的CRH受体信号转导非常重要，最终导致动物模型中皮质醇水平的升高。更详细地，促肾上 腺皮质激素细胞中cAMP的增加导致Ca 2+的内流和伴随的Ca2+介导的ACTH释放。cAMP信号 对于许多激素释放过程很重要，因此PAC还可以下丘脑神经内分泌细胞中表达以增加CRH/ AVP释放。
[0044] 按照本发明，已开发精确和非侵入性的应激应答的检测和控制模型。所述模型需 要利用细胞类型特异性启动子特异性地在应激激素生成神经元中表达光激活蛋白如通道 和酶，以便诱导应激应答。因此，实现自由活动的个体中特定神经元群体的光控制。
[0045] 在脊椎动物中，应激应答是通过下丘脑中高度保守的神经内分泌细胞的激活来调 节的，产生应激激素如促肾上腺皮质激素释放激素（CRH) (Charmandari et al. (2005))。一 旦产生，CRH激活垂体促肾上腺皮质激素细胞以通过G-蛋白偶联受体和随后的cAMP介导 的信号释放促肾上腺皮质激素（ACTH) (Arzt and Holsboer (2006))。
[0046] 作为原理的证据，在本文中斑马鱼用作模型系统，并且产生转基因系，其利用编码 ACTH前体的pome基因的启动子在垂体细胞中特异性地表达光门控腺苷酸环化酶（PAC)。在 这种动物中，当蓝光照明时，获得应激激素皮质醇水平的剂量依赖性升高。此外，利用光，可 以控制并研宄斑马鱼幼体的应激行为。因此本申请提供一种新的动物模型用于（1)研宄应 激行为，例如慢性应激；（2)筛选应激应答的新调节物，（3)在发育期间操作应激水平以获 得早期生活应激动物模型，（4)在动物模型中急性和慢性地控制应激行为，以及（5)测试靶 向应激应答系统的药物。
[0047] 总的来说，这个系统允许在脊椎动物中直接、非侵入性、定量和精确地检测和操作 应激应答。
[0048] 在本发明的方法的一优选实施方案中，可以通过光激活的蛋白选自光激活腺苷酸 环化酶（PAC)、channelrhodopsin 1 和 channelrhodopsin 2〇
[0049] 光激活腺苷酸环化酶及其氨基酸序列以及编码所述蛋白的核酸序列已描述于例 如 Stierl et al. 2011。而且本领域已描述 channelrhodopsin 1 和 channelrhodopsin 2， 例如 Nagel et al. 2002。
[0050] 在本发明的方法的另一优选实施方案中，非人脊椎动物为鱼。
[0051] 最近几十年，鱼已成为有希望的生物医学研宄的脊椎动物模式生物。它们可以在 实验室中容易地操作，并且具有快速的世代时间和大的生殖群。因此，它们为这类相互作用 的分析提供优秀的模型，特别是因为它们的HPI-轴与人中的HPA轴同源。
[0052] 目前本领域中采用的在较大的动物模型如啮齿动物中分析应激应答所需的内分 泌学测量通常是劳动密集型的，并且在不同实验室之间常常是未标准化的。因此，使用较小 的脊椎动物模型如鱼提供一套读出和精确的操作方案，其以多孔形式容易放大用于高通量 筛选和分析。
[0053] 在一甚至更优选的实施方案中，鱼选自斑马鱼和青鏘。
[0054] 斑马鱼（Danio rerio)是在印度和周边国家稻田附近的河流和小溪中天然发现的 淡水硬骨鱼（Engeszer et al.，2007)。斑马鱼的一个特别优点是它们的应激应答系统与 哺乳动物研宄模型享有基础相似性（Wendelaar Bonga, 1997, Alsop and Vijayan, 2009) 〇 在孵化时，幼体斑马鱼发育功能HPI-轴，并且在第4天时，它们整个身体的皮质醇水平 对应激物应答而快速升高（To et al.，2007, Alsop and Vijayan, 2008, Alderman and Bernier，2009)。机械感觉刺激和各种化学物和污染物可以用作应激物，并且可以容易地施 用于斑马鱼的水环境。此外，因为斑马鱼是变温和狭盐性的，温度和盐度改变也可以用作适 合应激应答功能分析的不同应激物。
[0055] 斑马鱼的卵生发育具有重要性，其幼体小且透明的身体以及可用的选择性靶向细 胞应激途径和非侵入性脑成像的大量工具以及神经回路的光遗传学探测为研宄应激轴的 发育和完全功能应激应答提供了极好的机会。
[0056] 与斑马鱼相似，青鏘作为小脊椎动物模型也提供优势，其具有完全测序的基因组 以及适合光操作的半透明幼体。
[0057] 本发明进一步涉及通过本发明的方法获得的应激动物模型。
[0058] 此外，本发明还涉及按照本发明的动物模型在筛选用于预防、改善或治疗应激和/ 或应激相关疾病的化合物中的用途。
[0059] 基本上按照本发明可以测定任何化合物预防、改善或治疗应激和/或应激相关疾 病的潜力。这类化合物包括例如小分子，如有机或无机分子。有机分子涉及或属于具有碳 基础的一类化合物，碳原子通过碳-碳键连接在一起，包括生物实体如蛋白、糖、核酸、月旨 质。术语有机的原始定义涉及化合物的来源，有机化合物是获得自植物或动物或微生物来 源的那些含碳化合物。有机化合物可以是天然或合成的。小有机分子优选具有约500Da或 以下的分子量。无机化合物源自矿物来源，并且包括没有碳原子的所有化合物（除了二氧 化碳、一氧化碳和碳酸盐）。有许多这类化合物的供应商，包括例如Sigma (St. Louis，Mo.)、 Aldrich (St. Louis, Mo. )、Sigma-Aldrich (St. Louis, Mo. )、Fluka Chemika-Biochemica Analytika(Buchs, Switzerland)。此外，待分析的化合物可以通过本领域已知的方法合 成。受试化合物可以包含在不同或结构相似化合物的化合物文库（例如组合化学合成文 库）中，并且可以同时测定文库中的许多受试化合物。任选地，可以将源自不同文库的受试 化合物汇集用于同时评价。文库可以包含分子的随机集合。或者，文库可以包含偏向特定 序列、结构或构象的分子集合。制备包含各种类型分子的不同群体的文库的方法是本领域 已知的（Brenk, R. et al. , Lessons Learnt from Assembling Screening Libraries for Drug Discovery for Neglected Diseases, ChemMedChem 2008, 3, 435 - 444, Quinn J.R.et al. , Developing a Drug-like Natural Product Library, J. Nat. Prod. 2008, 71, 464 -468)。许多文库也是可商购的。
[0060] 筛选它们预防、改善或治疗应激和/或应激相关疾病的潜力的优选化合物包括但 不限于抗抑郁药，例如氟西汀，这是由于应激和抑郁之间的密切联系（Holsboer and Ising 2010;Holsboer et al.1984)，或者镇静剂，如地西泮。
[0061] 按照本发明，术语"应激相关疾病"涉及个体内作为急性或慢性应激的结果发展的 疾病状况。这类应激相关疾病的非限制性实例为心脏病、慢性疲劳、焦虑发作、情绪波动、心 理困扰、抑郁、睡眠问题、高血压、饮食失调、消化性溃疡、免疫功能低下、慢性疼痛、感冒、流 感、病毒感染、酗酒、头痛和偏头痛。
[0062] 本发明进一步涉及一种筛选用于预防、改善和/或治疗应激和/或应激相关疾病 的化合物的方法，所述方法包括（a)向本发明的动物模型给药受试化合物；(b)在步骤（a) 之前、与步骤（a)同时或在步骤（a)之后在所述动物模型中诱导应激；以及（c)分析步骤 (b)中诱导的应激应答，其中与受试化合物不存在下观察到的应激应答相比，在受试化合物 存在下于（c)中观察到的减少的应激应答指示化合物适合作为预防、改善和/或治疗应激 和/或应激相关疾病的化合物。
[0063] 本文关于制备诱导型应激动物模型的方法和这样的动物模型的用途提供的所有 定义和优选实施方案经适当修改后也应用于本发明的这种筛选方法。
[0064] 按照本发明的这种方法，在第一步中向本发明的动物模型给药待测试的化合物。 给药受试化合物的方法是本领域公知的，包括例如肠胃外、直肠、口服、脑池内、静脉内、腹 腔内、皮下、肌肉内、皮内、体表（例如作为散剂、软膏剂、滴剂或透皮贴剂）、鼻内、口腔、鼻 部或支气管内给药。此外，可以将化合物给药入动物模型周围的环境，例如在鱼的情况下给 药入水，或者在其他脊椎动物如实验室啮齿动物如小鼠或大鼠的情况下给药入空气。
[0065] 在步骤（a)中给药受试化合物之前，与步骤（a)中给药受试化合物同时和/或在 步骤（a)中给药受试化合物之后在所述动物模型中诱导应激。在本发明的这种方法的一优 选实施方案中，通过将所述动物暴露于光来诱导应激。更优选地，在本发明的动物模型中诱 导应激是通过将动物模型暴露于特定波长的光刺激来完成的。应激诱导的变化可以通过改 变施用的光刺激来实现，例如使用多个重复的光刺激或单一的长时间光暴露等。
[0066] 诱导应激之后，分析因此在动物中诱导的应激应答。这样的分析涵盖行为测试，例 如尾部悬吊、水迷宫、旷场、光/暗盒选择、高架十字迷宫等，全部是本领域公知的，并且描 述于例如 Prut and Belzung (2003)或 Belzung and Griebel (2001)，或者下文和所附实施 例中描述的任何测试。
[0067] 然后可以将受试化合物存在下观察到的应激应答与受试化合物不存在下观察到 的应激应答进行比较。在与受试化合物不存在下观察到的应激应答相比，在受试化合物存 在下观察到减少的应激应答的那些情况下，所述化合物适合作为预防、改善和/或治疗应 激和/或应激相关疾病的化合物，或者作为开发预防、改善和/或治疗应激和/或应激相关 疾病的化合物的先导化合物。
[0068] 在本发明的方法、动物或用途的一优选实施方案中，所述应激为慢性应激。
[0069] 按照本发明，慢性应激通过应激行为的长期改变和改变的应激激素水平来定义。 慢性应激导致HPA轴的特征性失调并增加包括抑郁在内的各种疾病的易损性（参见例如 Chrousos and Gold(1992))。慢性升高的糖皮质激素水平和升高的中心CRH水平涉及抑郁 相关的HPA高活性（Holsboer 1999 ;Holsboer and Barden 1996 ;Raadsheer et al. 1994)， 因此，在蛋白或DNA水平这些激素水平的持续升高可以用作慢性应激的指示。
[0070] 在核酸水平确定这些激素的表达的方法包括但不限于RNA印迹、PCR、qPCR、 RT-PCR或实时RT-PCR。在氨基酸水平确定这些激素的表达的方法包括但不限于ELISA、蛋 白印迹或者聚丙烯酰胺凝胶电泳结合蛋白染色技术如考马斯亮蓝或银染。在蛋白定量中使 用的还有Agilent Bioanalyzer技术。这样的方法是本领域公知的。
[0071] 此外，本发明涉及一种在鱼中分析应激行为的方法，所述方法包括（i)将鱼置于 游泳室中并将所述鱼暴露于刺激；以及（ii)在应激物的存在或不存在下分析所述鱼的刺 激依赖性行为；其中与应激物不存在下在（ii)中观察到的行为相比，在应激物存在下于 (ii)中观察到的行为改变是应激的指示。
[0072] 虽然按照本发明的方法参考"鱼"，但是在本文中还设想使用许多鱼，因此，术语 "鱼"涵盖使用许多鱼。此外，如本文所用，术语"鱼"涉及幼体（即幼年，非成体）鱼以及成 体鱼。优选地，所述鱼为幼体鱼。
[0073] 游泳室可以是本领域通常采用的任何游泳室，如单隔室或多隔室游泳室。应当理 解当使用多隔室游泳室时，所述隔室是互相连通的。
[0074] 然后将鱼暴露于刺激，所述刺激可以是所关注的任何刺激，如下文描述的优选刺 激。监测暴露于刺激之后鱼的行为（即"刺激依赖性行为"，在本文中也称作"对刺激应答 的行为"）并与其在应激物存在下的行为进行比较。与暴露于应激物之前对刺激应答的行 为相比，暴露于应激物之后对刺激应答的改变的行为，例如运动（例如单位时间内移动的 距离（运动水平））、空间利用（例如在室的某些隔室或部分中花费的时间比例）、摄食动机 等的改变是应激的指示。因