用于分子分析的胚取样的制作方法
【专利说明】
[0001] 相关申请的夺叉引用
[0002] 本申请要求提交于2013年3月15日的美国临时申请61/786968和提交于2012 年11月5日的美国临时申请61/722399的权益，它们全部内容以引用方式并入本文。
技术领域
[0003] 本公开涉及用于取样分离的胚以鉴定能够发育成具有所需特性的植株的胚的方 法。
【背景技术】
[0004] 在传统的植物育种中，种植基于已知的杂交或自花授粉的植物世代并且随后进行 测试，从而得知品系或品种是否趋于具有市场上期望的特性。这是本领域可认识到并且熟 知的，这些实验可为大规模的。它们涉及从科学家到现场工作人员范围内的大量劳动力以 设计、种植、维护、以及进行实验，可能涉及几千或几万株单个植株。它们也需要可观的土地 资源。实验田或温室可能占据几千英亩土地。当植株萌发、生长、以及产生种子期间（在此 期间可对它们采样用于实验室或田间测试），这不但占据大量土地数月之久，而且之后的大 量种子必须进行单独标记、收获和处理。
[0005] 一个另外的问题是很多实验是无效结果。文献已经报道一些种子公司在实验中弃 去早期任何世代的80-90%的植株。因此，对于大部分种子，供其生长、收获、及收获后处理 所消耗的大量土地、劳动力和材料资源最终被浪费了。
[0006] 时间压力也是一个因素。植物育种方面的显著进步已经施加更多的压力于育种程 序，以较快速地推进植物品系或品种获得更多更好的性状和特性。植物育种者和相关联的 工人因此受到增大的压力以更高效地和更有效地处理这些世代，以及更多更早地选择应继 续进行下一代育种的植株。
[0007]多个当前使用的方案已经加速了植物育种产生的收获，并且具有相当大的成本节 约。例如，用于产生加倍单倍体的方案已经不需要多年的自交以及后续的评估来获得纯合 植株。此外，遗传标记数据的应用以及获取它们的便利性已经允许在消耗大量资源之前从 种群中去除不包含期望特性的植株。此外，近来的案例已经利用在种子阶段基于实验室 的测试，通常称为"籽粒切片"或"种子切片"，其中种子进行非破坏性测试以获取遗传、生 物化学或表型信息（Sangtong，V?等人（2001) Plant Molecular Biology Reporter 19 : 151-158)。测试种子不需要使种子生长成幼苗，从而节省了时间、空间、和工作量。
[0008] 然而，仍可进行进一步改善。具体地，需要甚至在发育更早期分子表征胚的方法， 尤其是作为加倍单倍体方法或利用胚挽救技术的其它方法的一部分。
【发明内容】
[0009] 本公开涉及通过使用胚取样促进植物改善活动的方法。通过本文所述方法，测试 各个分离的胚并仅选择能够发育成具有一个或多个期望特性的植株的那些胚是可能的。这 允许用于植物改善和管理的新的和更有效的方法，产生改善的育种群体。
[0010] 本文提供了分析单子叶植物的分离的胚的方法。在此类方法中，从分离的胚切除 一片盾片组织，其中所述切除不引起胚发芽可能性的显著降低。随后分析该片盾片组织是 否存在指示至少一个遗传性状的一个或多个特性。
[0011] 分离的胚可为未成熟的，并且它可来自玉米、高粱、小麦、稻、大麦、燕麦、裸麦、粟、 甘蔗、黑小麦、或柳枝稷。分离的胚可直接获取自种子，或者它可来源于其它组织。分离的 胚可为新鲜的或冷却的。分离的胚是活的并且能够在切除所述盾片组织片后发芽长成植 株。分离的胚可为任意倍数性的，诸如但不限于单倍体、二倍体、加倍单倍体、非整倍体、四 倍体、六倍体、或八倍体。
[0012] 从分离的胚切除的该片盾片组织在取样后可为冻干的、新鲜的、冷冻的、或冷却 的。
[0013] 该片盾片组织的尺寸可等于或大于单个细胞核。
[0014] 盾片组织的切除可通过本领域已知的任何装置进行，诸如但不限于：钻头、喷水 器、激光、单刀片、一组相对刀片、注射器、芯取样器（取芯工具）、外科手术刀、小直径的线、 小直径的变形钢丝绳、刮刀、和拭子。切除可手动进行或通过自动化方法进行。
[0015] 分离的胚可定位为分生组织向下，其中从分生组织的相对端切片。定位可手动进 行或利用机械运动、致动等以自动化方式进行。自动化可包括使用机器人、视觉系统、或二 者的组合。
[0016] 可分析盾片组织的片的一个或多个特性，所述特性选自：遗传标记、单核苷酸多态 性、简单重复序列、限制性片段长度多态性、单倍型、标签SNP、遗传标记的等位基因、基因、 DNA来源的序列、RNA来源的序列、启动子、基因的5'非翻译区、基因的3'非翻译区、微 RNA、siRNA、QTL、卫星标记、转基因、mRNA、dsmRNA、转录模式、甲基化模式、和倍数性水平。
[0017] 本文提供了分析双子叶植物的分离的胚的方法。在此类方法中，从分离的胚切除 一片子叶组织，其中所述切除不引起胚发芽可能性的显著降低。随后分析该片子叶组织是 否存在指示至少一个遗传性状的一个或多个特性。
[0018] 分离的胚可为未成熟的，并且其可为卡诺拉、大豆、向日葵、苜蓿、或棉花。分离的 胚可直接获取自种子，或者它可来源于其它组织。分离的胚可为新鲜的或冷却的。分离的 胚是活的并且能够在切除所述子叶组织片后发芽长成植株。分离的胚可为任意倍数性的， 诸如但不限于单倍体、二倍体、加倍单倍体、非整倍体、四倍体、六倍体、或八倍体。
[0019] 从分离的胚中切除的该片子叶组织在取样后可为冻干的、新鲜的、冷冻的、或冷却 的。
[0020] 该片子叶组织的尺寸可等于或大于单个细胞核。
[0021] 子叶组织的切除可通过本领域已知的任何装置进行，诸如但不限于：钻头、喷水 器、激光、单刀片、一组相对刀片、注射器、芯取样器（取芯工具）、外科手术刀、小直径的线、 小直径的变形钢丝绳、刮刀、和拭子。切除可手动进行或通过自动化方法进行。
[0022] 可分析子叶组织的片的一个或多个特性，所述特性选自：遗传标记、单核苷酸多态 性、简单重复序列、限制性片段长度多态性、单倍型、标签SNP、遗传标记的等位基因、基因、 DNA来源的序列、RNA来源的序列、启动子、基因的5'非翻译区、基因的3'非翻译区、微 RNA、siRNA、QTL、卫星标记、转基因、mRNA、dsmRNA、转录模式、甲基化模式、和倍数性水平。
【具体实施方式】
[0023] 本文中所列出的每个参考集的公开内容均据此全文以引用方式并入本文。
[0024] 除非上下文另外明确规定，否则如本文和所附权利要求书中所用的单数形式"一 个"、"一种"以及"所述"包括复数涵义。因此，例如，"一株植物（a plant)"的涵义包括多 株此类植物，"一个细胞（a cell)"的涵义包括一个或多个细胞以及它们为本领域技术人员 所知的等同物，诸如此类。
[0025]如本f所用:
[0026] "愈伤组织"是指去分化的增殖细胞块或组织块。
[0027]短语"接触"、"与...接触"或"与...接触放置"可用于指代"直接接触"或"间 接接触"。例如，包含加倍剂的培养基可直接接触单倍体细胞或者包含加倍剂的培养基可通 过滤纸、植物组织、或其它细胞与单倍体细胞分开，从而加倍剂通过滤纸或细胞转移到单倍 体细胞中。
[0028] "二倍体"植物具有两组（基因组）染色体并且染色体数（2n)等于合子的染色体 数。
[0029] "加倍单倍体"或加倍单倍体植物或细胞通过加倍染色体单倍体组发育。获取自自 交任意数目世代的加倍单倍体植物的植物或种子仍可认为是加倍单倍体植物。认为加倍单 倍体植物是纯合植物。如果一株植物是能繁殖的，将认为它是加倍单倍体，即使植物的整个 营养部分不包括具有加倍染色体组的细胞。例如，如果一株植物包含活的配子，将认为它是 加倍单倍体植物，即使它是嵌合的。
[0030]