专利名称：钾诊断/测定试剂盒及钾浓度测定方法
技术领域：
本发明涉及一种钾诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定钾浓 度的方法，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。
背景技术：
血清钾三个决定性水平的临床意义低于参考值下限，表现低钾血 症，其原因有肾小管疾病，高醛固酮症，胰岛素过多症，代谢性碱中 毒，利尿剂治疗、胰岛素治疗糖尿病酮症时钾离子转移至细胞内等。 高于参考值上限，可能由肾小球疾病、肾功能衰弱、糖尿病酮症中毒、
肾上腺皮质功能减退等。当血钾高达7. 5 mmol/L或以上时病人将出现 心律失常，应考虑确定适当的治疗方案。血清钾超过10 mmol/L时， 即可发生心室纤颤，心脏停搏而死亡。高钾使心脏停跳于舒张期。
目前钾测定常用的方法有同位素稀释质谱法、中子活化法、火焰 光度计法、化学测定法、离子选择电极法、原子分光光度法、酶动力 学法。
火焰光度法1950年开始使用并一直沿用至今的火焰光度法检测 血清、尿液、脑脊液及胸腹水的Na+和K+，是一种发射光谱分析法。测 定方法分为内标准法和外标准法两种。外标准法操作误差较大， 一般 不采用。现在主要使用内部标准法，即标本及标准液采用加进相同浓 度的内部标准元素锂或铯进行测定。操作时，将含锂的溶液作为稀释
液，同时测定K、 Na和Li的浓度，以标本与标准液的Na/Li与K/Li 比值，计算Na、 K浓度。由于血清稀释倍数大，血清蛋白质粘性的影 响几乎可忽略不计。
化学测定法主要利用复环王冠化合物如穴冠醚或球冠醚，亦称为 冠醚，均为离子载体进行测定，由于大环结构内有空穴，分子内部氧 原子有未共用电子对可与金属离子结合，根据空穴大小，可选择性结 合不同直径的金属离子，从而可达到测出离子浓度的目的。测定血清 K， 一般采用普通冠醚阴离子染料进行比色定量。
离子选择电极法ISE法是采用灵敏的特定专用电极，在专用仪器 上进行血清和尿等体液的K+、 Na+的测定，因标本用量少，快速准确， 几乎有取代其他方法的趋势。其仪器测定原理是离子选择电极与参比 电极组合浸泡在待测标本溶液中，进行检测。目前已有的电极种类为
① 玻璃膜电极，感应材料为玻璃薄膜的有pH电极、K+电极和Na+电极；
② 固相膜电极，由难溶性金属物质加压成型，以固体膜或单日膜作为 感应膜的电极有C1—电极和F—电极；(D液态膜电极，将环氧树脂或内装 聚氯乙稀为感应膜的Ca"电极；④用缬氨霉素膜制成的K+电极。上述 电极均有一定的寿命，因为电极使用一段时间就会自动老化，有效期 长短不一。
原子分光光度法原子分光光度法可用于检测血清K+、 Na+，操作 繁杂，误差较大，不及火焰光度法简便。
钾测定的决定性方法是同位素稀释质谱法及中子活化法。冊0推荐 的方法是火焰光度计法。目前离子选择电极法应用较为普遍，但是电
极成本昂贵。
酶测定法和火焰光度计法或离子选择电极法均有较好的一致性，且 抗干扰性强，稳定性好，弥补了生化分析仪不能同时测定钾钠的不足。 有较好的分析性能，易于自动化，在临床化学分析中必定取代火焰光 度计法成为常规分析项目。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提出一种利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，监测 还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得 以测定钾浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的钾诊 断/测定试剂盒，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自 动生化分析仪上进行钾浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而 可以得到切实的推广应用。
本发明钾浓度测定方法原理如下
色氨酸+水色氨酸酶丙酮酸+氨离子+吲哚 丙酮酸+还原型辅酶乳酸脱氢酶L-乳酸+辅酶
这种方法利用需要钾离子激活的色氨酸酶(tryptophanase ; EC 4丄99.1)酶(偶)联乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase ; EC l丄1.27 ; EC l丄1.28)酶促反应连续监测法/速率比色法。色氨酸酶酶解色氨酸 反应产生丙酮酸，再通过(偶)联合乳酸脱氢酶的作用，最终将还原 型辅酶(在340nm处有吸收峰)氧化成为辅酶(在340nm处没有吸收 峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度下降的速度，通过
测量340nm处吸光度下降的速度，可以测算钾的浓度大小。
实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考 虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明钾诊断/测定
试剂盒较为理想
缓冲液 100mmol/L
稳定剂 50 mmol/L
还原型辅酶 0.25 mmol/L
色氨酸酶 12000 U/L
乳酸脱氢酶 12000 U/L
色氨酸 10mmol/L
本发明的钾诊断/测定试剂盒可以是单剂，包括
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、色氨酸、色氨酸酶、乳酸脱氢 酶。
试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成 液体试剂，直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂 试剂1
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、色氨酸。 试剂2
缓冲液、稳定剂、色氨酸酶、乳酸脱氢酶。 还原型辅酶、色氨酸、色氨酸酶、乳酸脱氢酶在试剂1或试剂2中 的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用; 也可以配制成液体试剂，直接使用。
还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂: 试剂1
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶。
试剂2
缓冲液、色氨酸。 试剂3
缓冲液、稳定剂、色氨酸酶、乳酸脱氢酶。 还原型辅酶、色氨酸、色氨酸酶、乳酸脱氢酶在试剂l、试剂2或
试剂3中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶 解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
无论是单剂、双剂还是三剂，本发明测定钾浓度的方法，其还原型 辅酶可以是NADPH、 NADH或thio- NADH中的一种。
具体实施例方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。 实施例一
本实施例的钾诊断/测定试剂为单试剂，包括
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmd/L 稳定剂 50 mmol/L
还原型辅酶 0.25 mmol/L
12000 U/L
乳酸脱氢酶 12000 U/L
10 mmol/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂； 使用前，加入纯净水，复溶后使用。
在全自动生化分析仪上设定温度37"C，反应时间10分钟，起始 吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测钾样 品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时 间大约O分钟左右，检测时间5分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化 分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出钾的浓 度大小。 实施例二
本实施例的钾诊断/测定试剂为双试剂，包括-
试剂1
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 10Ommol/L 稳定剂 50 mmol/L
还原型辅!
0.25 mmol/L
20 mmol/L
试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 50 mmol/L
色氨酸酶 24000 U/L
乳酸脱氢酶 24000 U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37。C，反应时间10分钟，起始
吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测钾样 品与试剂1、试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为负反应(下降反 应)，延迟时间大约l分钟左右，检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化 分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出钾的浓 度大小。 实施例三
本实施例的钾诊断/测定试剂为三试剂，包括-试剂1
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 10Ommol/L
稳定剂 还原型辅酶
50 mmol/L 0.25 mmol/L
试剂2
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液
100 mmol/L
12 mmol/L
试剂3
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂
乳酸脱氢酶
50 mmol/L 30000 U/L 30000 U/L 试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。 测定钾浓度时，在全自动生化分析仪上设定温度37°C，反应时
间10分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长 405nm，被测钾样品与试剂1、试剂2、试剂3的体积比例为4/40/5/5， 反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约l分钟左右，检测时间 2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化 分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出钾的浓 度大小。
申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他各种还原 型色原体组合均能达到本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实 施例类同，不另一一例举。
总之，实验证明，采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分 析仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好，便于推广应 用。
权利要求
1.一种利用酶比色法及酶联法技术的钾浓度测定方法，其方法原理如下id="icf0001" file="A2006100968950002C1.gif" wi="118" he="16" top= "49" left = "36" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="no"/>将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，测算出钾的浓度大小测定结果。
2. —种钾诊断/测定试剂盒，主要成分包括缓冲液 20-500 mmol/L稳定剂 1——50 mmol/L还原型辅酶 0.1——0.35 mmol/L色氨酸酶 1000——80000 U/L乳酸脱氢酶 1000——80000 U/L 色氨酸 1——50mmol/L其特征在于试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用； 也可以配制成液体试剂，直接使用。
3. 根据权利要求2所述钾诊断/测定试剂盒，其特征在于 由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、色氨酸、色氨酸酶、乳酸脱氢酶 组成单剂试剂。
4. 根据权利要求2所述钾诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、色氨酸、色氨酸酶、乳酸脱氢酶组成双剂试剂；试剂l，由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、色氨酸、 组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、色氨酸酶、乳酸脱氢酶组成。 还原型辅酶、色氨酸、色氨酸酶、乳酸脱氢酶在试剂1或试剂2中 的位置可以不限。
5. 根据权利要求2所述钾诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、色氨酸、色氨酸酶、乳酸脱氢酶 组成多剂试剂；试剂l，由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶组成；试 剂2，由缓冲液、色氨酸组成；试剂3,由缓冲液、稳定剂、色氨 酸酶、乳酸脱氢酶组成。还原型辅酶、色氨酸、色氨酸酶、乳酸脱 氢酶在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。
6. 根据权利要求2所述钾诊断/测定试剂盒，其特征在于还包括稳 定剂1^000 mmol/L或0.1%-100°/。体积比。所述稳定剂为硫酸 铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、 乙二醇(Ethyleneglycol)及防腐剂中的至少一种。
全文摘要
本发明涉及一种利用酶比色法及酶联法技术的钾诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定钾浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括缓冲液、还原型辅酶、色氨酸、色氨酸酶、乳酸脱氢酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度下降的速度，从而测算出钾的浓度大小。采用本发明完全可以通过紫外/可见光分析仪器得出所需的测定结果。
文档编号G01N33/84GK101169431SQ20061009689
公开日2008年4月30日 申请日期2006年10月24日 优先权日2006年10月24日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司