专利名称：钾诊断/测定试剂盒及钾浓度测定方法
技术领域：
本发明涉及一种钾诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定钾浓度的 方法，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。
背景技术：
血清钾三个决定性水平的临床意义低于参考值下限，表现低钾血症， 其原因有肾小管疾病，高醛固酮症，胰岛素过多症，代谢性碱中毒，利尿 剂治疗、胰岛素治疗糖尿病酮症时钾离子转移至细胞内等。高于参考值上 限，可能由肾小球疾病、肾功能衰弱、糖尿病酮症中毒、肾上腺皮质功能
减退等。当血钾高达7.5mmol/L或以上时病人将出现心律失常，应考虑确 定适当的治疗方案。血清钾超过10 mmol/L时，即可发生心室纤颤，心脏 停搏而死亡。高钾使心脏停跳于舒张期。
目前钾测定常用的方法有同位素稀释质谱法、中子活化法、火焰光度 计法、化学测定法、离子选择电极法、原子分光光度法、酶动力学法。
火焰光度法1950年开始使用并一直沿用至今的火焰光度法检测血清、 尿液、脑脊液及胸腹水的Na+和K+，是一种发射光谱分析法。测定方法分为 内标准法和外标准法两种。外标准法操作误差较大， 一般不采用。现在主 要使用内部标准法，即标本及标准液采用加进相同浓度的内部标准元素锂 或铯进行测定。操作时，将含锂的溶液作为稀释液，同时测定K、 Na和Li 的浓度，以标本与标准液的Na/Li与K/Li比值，计算Na、 K浓度。由于血清稀释倍数大，血清蛋白质粘性的影响几乎可忽略不计。
化学测定法主要利用复环王冠化合物如穴冠醚或球冠醚，亦称为冠 醚，均为离子载体进行测定，由于大环结构内有空穴，分子内部氧原子有 未共用电子对可与金属离子结合，根据空穴大小，可选择性结合不同直径 的金属离子，从而可达到测出离子浓度的目的。测定血清K， 一般采用普 通冠醚阴离子染料进行比色定量。
离子选择电极法ISE法是采用灵敏的特定专用电极，在专用仪器上进 行血清和尿等体液的K+、 Na+的测定，因标本用量少，快速准确，几乎有取 代其他方法的趋势。其仪器测定原理是离子选择电极与参比电极组合浸泡 在待测标本溶液中，进行检测。目前已有的电极种类为①玻璃膜电极， 感应材料为玻璃薄膜的有pH电极、K+电极和Na+电极；②固相膜电极，由 难溶性金属物质加压成型，以固体膜或单日膜作为感应膜的电极有Cl—电极 和F—电极；③液态膜电极，将环氧树脂或内装聚氯乙稀为感应膜的C,电 极；④用缬氨霉素膜制成的K+电极。上述电极均有一定的寿命，因为电极 使用一段时间就会自动老化，有效期长短不一。
原子分光光度法原子分光光度法可用于检测血清K+、 Na+，操作繁杂， 误差较大，不及火焰光度法简便。
钾测定的决定性方法是同位素稀释质谱法及中子活化法。WHO推荐的方
法是火焰光度计法。目前离子选择电极法应用较为普遍，但是电极成本昂
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酶测定法和火焰光度计法或离子选择电极法均有较好的一致性，且抗干 扰性强，稳定性好，弥补了生化分析仪不能同时测定钾钠的不足。有较的分析性能，易于自动化，在临床化学分析中必定取代火焰光度计法成为
常规分析项目。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提出一种利用酶循环扩增法(Enzymatic Recycling Method)、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶联法 (Couple Reaction)技术，计量通过酶联反应生成tl引嗒胺色原(Indamine dye)或醌亚胺色原(Quioneiminedye)所导致在400—700nm波长处吸光 度的上升，得以测定钾浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方 法的钾诊断/测定试剂盒，采用该试剂不仅可以在可见光分析仪或半、全自 动生化分析仪上进行钾浓度测定，而且测定速度快、灵敏度大、准确度高， 因而可以得到切实的推广应用。
本发明钾浓度测定方法原理如下
腺苷二磷酸+磷酸烯醇式丙酮酸丙酮酸激酶化+ 腺苷三磷酸
+丙酮酸
丙酮酸+氨离子+还原型辅酶丙氨酸脱氢酶L-丙氨酸+
水+辅酶
丙氨酸+水+氧甘氨酸氧化酶氨离子+丙酮酸+
过氧化氢
过氧化氢+还原型色原体组合过氧化物酶喷嗒胺色原或
醌亚胺色原+水
这个方法应用需要钾离子激活的丙酮酸激酶(pyruvate kinase ; EC 2.7.1.40)联合丙氨酸脱氢酶(alaninedehydrogenase; EC 1.4.1.1)、甘氨酸氧化酶(glycine oxidase; EC 1.4.3.19)及过氧化物酶(peroxidase ; EC 1.1L1.7)酶促反应连续监测法。丙酮酸激酶作为作用酶，功能为将磷酸烯 醇式丙酮酸酶解产生丙酮酸。丙氨酸脱氢酶也作为作用酶，它的酶促作用 使丙酮酸产生丙氨酸；甘氨酸氧化酶作为循环酶可以一再将丙氨酸再次变 回丙酮酸，使丙酮酸不断地被重复循环利用；同时不断地重复循环产生过 氧化氢。过氧化物酶(peroxidase ; EC Lll丄7)作为显色酶，通过和过氧 化氢的作用，使无色的还原型色原体组合氧化成有色的染料，从而可以通 过可见光分析仪器，在400—700nm (根据还原型色原体组合的不同而定) 波长处测定染料一吲嗒胺色原(Indaminedye)或醌亚胺色原(Quioneimine dye) —含量高低的光吸收大小程度/速度，得出氨基酸(氮)浓度大小测
定结果。
实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑， 如下成分关系的本发明钾诊断/测定试剂盒较为理想
缓冲液 稳定剂 过氧化物酶 丙酮酸激酶
甘氨酸氧化酶
磷酸烯醇式丙酮酸
腺苷二磷酸
100mmol/L 500 mmol/L 30000 U/L 10000 U/L 12000 U/L 12000U/L 6 mmol/L 12 mmol/L 20 mmol/L还原型色原体组合 0.1——20 mmol/L
氨离子可以用任何氨盐。
所述还原型色原体组合(Chromogen)可以是下列28个组合中的任何
一个配对组合
3-甲基-2-苯噻唑酮腙 石碳酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
N-乙基""N- (3-硫丙基)-m-噻啶胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙 N,N-双乙基-m-甲苯胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
2.4- 双氯石碳酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙 2,4,6-仨溴-3-羟基-苯磺酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙 3，5-双氯石碳酸磺酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
3.5- 双氯-2-羟基-苯磺酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
仨溴羥基苯甲酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙 双甲基苯胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
2,2，-AZINO-双G-乙基苯噻唑-6-磺酸)3- 甲基-2-苯噻唑酮腙
4- 羥基-3-甲氧基苯甲酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
3- 甲基-乙基-羥基苯胺
4- 氨基抗砒 石碳酸
4-氨基抗砒
N-乙基^N- (3-硫丙基)-m-噻啶胺
4-氨基抗砒 N,N-双乙基-m-甲苯胺
4-氨基抗砒 2，4-双氯石碳酸
4-氨基抗砒
2，4,6-仨溴-3-羟基-苯磺酸
4-氨基抗砒 3,5-双氯石碳酸磺酸
4-氨基抗砒
3,5-双氯-2-羟基-苯磺酸 4-氨基抗砒
N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐
4-氨基抗砒 ， 仨溴羥基苯甲酸
4-氨基抗砒 双甲基苯胺
4-氨基抗砒
N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺 4-氨基抗砒
2,2，-AZINO-双(3-乙基苯噻唑-6-磺酸) 4-氨基抗砒
4-羥基-3-甲氧基苯甲酸4-氨基抗砒 3-甲基-乙基-羥基苯胺
本发明的钾诊断/测定试剂盒可以是单剂，包括 缓冲液、稳定剂、丙酮酸激酶、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶、磷酸烯醇 式丙酮酸、腺苷二磷酸、氨离子、过氧化物酶、还原型色原体组合。试剂 盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂， 直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂 试剂1
缓冲液、稳定剂、还原型色原体组合、磷酸烯醇式丙酮酸、腺苷二 磷酸、氨离子。 试剂2
缓冲液、稳定剂、过氧化物酶、还原型色原体组合、丙酮酸激酶、
丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶。 过氧化物酶、还原型色原体组合、丙酮酸激酶、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸 氧化酶、磷酸烯醇式丙酮酸、腺苷二磷酸、氨离子在试剂1或试剂2中的 位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可
以配制成液体试剂，直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂
试剂1
缓冲液、稳定剂、还原型色原体组合、磷酸烯醇式丙酮酸、腺苷二 磷酸、氨离子 。试剂2缓冲液、稳定剂、还原型色原体组合、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化 酶、过氧化物酶。 试剂3缓冲液、稳定剂、丙酮酸激酶。 过氧化物酶、还原型色原体组合、丙酮酸激酶、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶、磷酸烯醇式丙酮酸、腺苷二磷酸、氨离子在试剂1、试剂2或试 剂3中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使 用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
具体实施方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。 实施例一本实施例的钾诊断/测定试剂为单试剂，包括三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L 稳定剂 500 mmol/L丙酮酸激酶丙氨酸脱氢酶甘氨酸氧化酶过氧化物酶磷酸烯醇式丙酮酸腺苷二磷酸10000U/L12000 U/L12000U/L30000 U/L 6 mmol/L 12 mmol/L 20 mmol/L4-氨基抗砒2 mmol/L石碳酸 10mmol/L 试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使 用前，加入纯净水，复溶后使用。在全自动生化分析仪上设定温度37。C，反应时间IO分钟，测试主波长505nm，测试副波长600nm，被测钾样品与试剂的体积比例为1/25， 反应方向为正反应(上升反应)，检测方法为速率法，延迟时间大约1分钟 左右，检测时间2分钟左右。加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析 仪下，检测主波长505nm吸光度上升的程度/速度，从而测算出钾的浓度大 小。实施例二本实施例的钾诊断/测定试剂为双试剂，包括 试剂l三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 稳定剂磷酸烯醇式丙酮酸 腺苷二磷酸2,4，6-仨溴-3-羟基-苯磺酸訓mmol/L 50 mmol/L 6 mmol/L 12 mmol/L 20 mmol/L0.2 mmol/L试剂2(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L稳定剂 丙酮酸激酶甘氨酸氧化酶过氧化物酶4-氨基抗砒500 mmol/L 10000U/L 12000U/L 12000U/L 30000 U/L0.6 mmol/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37。C，反应时间10分钟，测试主波长546nm，测试副波长600nm，被测钾样品与试剂的体积比例为1/20，反应方向为正反应(上升反应)，检测方法为速率法，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右。加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长546nm吸光度上升的程度/速度，从而测算出钾的浓度大小。实施例三本实施例的钾诊断/测定试剂为三试剂，包括: 试剂1三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 稳定剂磷酸烯醇式丙酮酸 腺苷二磷酸100 rtimol/L 50 mmol/L 6 mmol/L 12 mmol/L 20 mmol/L3-甲基-2-苯噻唑酮腙0.6 mmol/L试剂2三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L稳定剂甘氨酸氧化 过氧化物酶双甲基苯胺500 mmol/L 12000U/L 12000 U/L 30000 U/L 2 mmol/L试剂3三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 100mmol/L稳定剂500 mmol/L10000U/L丙酮酸激酶试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37"C，反应时间10分钟，测试主波长578nm，测试副波长660nm，被测钾样品与试剂的体积比例为1/30，反应方向为正反应(上升反应)，检测方法为速率法，延迟时间大约l分钟左右，检测时间2分钟左右。加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长578nm吸光度上升的程度/速度，从而测算出钾的浓度大小。申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他各种还原型色 原体组合均能达到本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同，不另一一例举。总之，实验证明，采用本发明的测定方法完全可以通过可见光分析仪 器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好，不受内外源物质量污 染。
权利要求
1.一种酶循环扩增法、酶比色法及酶联法技术的钾浓度测定方法，其方法原理如下腺苷二磷酸+磷酸烯醇式丙酮酸 丙酮酸激酶/K+ 腺苷三磷酸 +丙酮酸丙酮酸+氨离子+还原型辅酶 丙氨酸脱氢酶 L-丙氨酸+ 水+辅酶丙氨酸+水+氧 甘氨酸氧化酶 氨离子+丙酮酸+ 过氧化氢过氧化氢+还原型色原体组合 过氧化物酶 吲嗒胺色原或 醌亚胺色原+水将最终反应物置于可见光分析仪下，检测400-700nm处直接反映吲嗒胺色原或醌亚胺色原含量高低的光吸收速度/程度，得出钾浓度大小测定结果。
2. —种钾诊断/测定试剂盒，主要成分包括: 缓冲液 稳定剂 过氧化物酶 丙酮酸激酶 丙氨酸脱氢酶 甘氨酸氧化酶 磷酸烯醇式丙酮酸20-500 mmol/L1-4000 mmol/L500——80000 U/L1000——80000 U/L1000——80000 U/L1000——80000 U/L1- 50mmol/L腺苷二磷酸 1——50 mmol/L氨离子 1- 50mmol/L还原型色原体组合 0.1——20 mmol/L其特征在于试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可 以配制成液体试剂，直接使用。氨离子可以用任何氨盐。3. 根据权利要求2所述钾诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、丙酮酸激酶、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶、磷酸 烯醇式丙酮酸、腺苷二磷酸、氨离子、过氧化物酶、还原型色原体组合 组成单剂试剂。4. 根据权利要求2所述钾诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、丙酮酸激酶、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶、磷酸 烯醇式丙酮酸、腺苷二磷酸、氨离子、过氧化物酶、还原型色原体组合 组成双剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、磷酸烯醇式丙酮酸、腺苷 二磷酸、氨离子、还原型色原体组合组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、 丙酮酸激酶、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶、过氧化物酶、还原型色原 体组合组成。过氧化物酶、还原型色原体组合、丙酮酸激酶、丙氨酸脱 氢酶、甘氨酸氧化酶、磷酸烯醇式丙酮酸、腺苷二磷酸、氨离子在试剂 l或试剂2中的位置可以不限。5. 根据权利要求2所述钾诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、丙酮酸激酶、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶、磷酸 烯醇式丙酮酸、腺苷二磷酸、氨离子、过氧化物酶、还原型色原体组合 组成多剂试剂；试剂l，由缓冲液、稳定剂、磷酸烯醇式丙酮酸、腺苷二磷酸、氨离子、还原型色原体组合组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、 丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶、过氧化物酶、还原型色原体组合组成；试剂3，由缓冲液、稳定剂、丙酮酸激酶组成。过氧化物酶、还原型色原体组合丙酮酸激酶、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶、磷酸烯醇式丙酮酸、腺苷二磷酸、氨离子在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。6. 根据权利要求2所述钾诊断/测定试剂盒，其特征在于还包括稳定剂14000 mmol/L或0.1%-100%体积比。所述稳定剂为硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐剂中的至少一种。7. 根据权利要求2所述钾诊断/测定试剂盒，其特征在于所述还原型色原体组合可以是下列28个组合中的任一个配对组合3-甲基-2-苯噻唑酮腙石碳酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基^N- (3-硫丙基)-m-噻啶胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙 N，N-双乙基-m-甲苯胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙 2，4-双氯石碳酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙 2,4,6-仨溴-3-羟基-苯磺酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙 3,5-双氯石碳酸磺酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙 3，5-双氯-2-羟基-苯磺酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐3-甲基-2-苯噻唑酮腙仨溴羥基苯甲酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙双甲基苯胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙2，2，-AZINO-双(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)3- 甲基-2-苯噻唑酮腙4- 羥基-3-甲氧基苯甲酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙3- 甲基-乙基-齊基苯胺4- 氨基抗砒 石碳酸4-氨基抗砒N-乙基一N- (3-硫丙基)-m-噻啶胺4-氨基抗砒 N，N-双乙基-m-甲苯胺4-氨基抗砒 2，4-双氯石碳酸4-氨基抗砒2，4,6-仨溴-3-羟基-苯磺酸4-氨基抗砒 3,5-双氯石碳酸磺酸4-氨基抗砒3,5-双氯-2-羟基-苯磺酸 4-氨基抗砒N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐4-氨基抗砒仨溴羥基苯甲酸4-氨基抗砒 双甲基苯胺4-氨基抗砒N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺 4-氨基抗砒2，2，-AZINO-双(3-乙基苯噻唑-6-磺酸) 4-氨基抗砒4-羥基-3-甲氧基苯甲酸4-氨基抗砒 3-甲基-乙基-羥基苯胺
全文摘要
本发明涉及一种利用酶循环扩增法、酶比色法及酶联法技术的钾诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定钾浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括缓冲液、磷酸烯醇式丙酮酸、腺苷二磷酸、氨离子、丙酮酸激酶、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶、过氧化物酶、还原型色原体组合及稳定剂；通过一系列的酶促反应，最终将无色的还原型色原体组合氧化成有色的染料，从而可以通过可见光分析仪器，在400-700nm波长处，测定染料含量的高低，进而直接反映出钾浓度的大小。
文档编号G01N21/31GK101329355SQ20071002472
公开日2008年12月24日 申请日期2007年6月21日 优先权日2007年6月21日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司