一种检测家族性糖皮质激素抵抗相关基因突变的试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学领域，设及医学诊断和生物技术，设及一种检测家族性糖 皮质激素抵抗相关基因突变的体外诊断试剂盒，是一种应用于新一代测序平台技术的一种 家族性糖皮质激素抵抗相关基因突变的试剂盒。 技术背景
[0002] 家族性糖皮质激素抵抗（FamilialGlucoco;rticoidResistance,FGR)是一种遗 传性内分泌疾病，由NR3C1基因突变导致，W全身性、局部或祀器官特异性的糖皮质激素抵 抗为特征。
[0003] 糖皮质激素受体（glucoco;rticoidrecepto;r，GR)由NR3C1基因编码正常情况下， GR与糖皮质激素结合后可调节糖皮质激素应答基因的表达，产生相应的生物学效应。当该 基因发生致病突变时，导致GR活性受损，组织对糖皮质激素不敏感，下丘脑-垂体-肾上腺 轴（HPA)负反馈性活性增强，促肾上腺皮质激素（ACTH)分泌增加。
[0004] 原发性糖皮质激素抵抗多为家族性，W血浆皮质醇水平升高而没有化Shing综合 征表现、下丘脑-垂体-肾上腺轴对地塞米松抵抗W及GR亲和力缺陷为特征；常伴随有盐 皮质激素过多所致的高血压、低钟血症、代谢性碱中毒等。运些患者全身症状相对较重、家 族史明显，是研究GR基因结构与糖皮质激素抵抗关系的最合适人群。在运一领域最早、最 具有启发性意义的结果即源自对家族性糖皮质激素抵抗的研究一大部分的家族性糖皮质 激素抵抗患者存在着NR3C1基因突变所致的GR功能缺陷。化rley等[1引最先研究了 3个家 族性糖皮质激素抵抗患者的NR3C1，发现一处D641V点突变；先证者是此突变的纯合子，表 现出严重的糖皮质激素抵抗，而其他的杂合子亲属症状轻微。其后，相继有学者[1621引研 究报道了NR3C1 基因突变如 2023-2024+2delGAGT、2317G>A(V729I)及 2373T>Ga747M) 等，可导致家族性糖皮质激素抵抗。另外，在一些非家族性的、散发的原发糖皮质激素抵抗 患者中，也有许多研究发现存在NR3C1基因突变。Ruiz等[19]在2例散发的原发糖皮质激 素抵抗患者发现NR3C1有杂合的错义突变R477H和G679S。Karl和Kino等巧0, 21]还研 究了表现为化Shing病的糖皮质激素抵抗患者，发现NR3C1的一处杂合的I559N错义突变， 而且证实运种突变GR可抑制野生型GR的反式激活作用，因此杂合状态即可导致严重的糖 皮质激素抵抗。Witchel等巧2]分析了青春期前多毛、闭经或月经过少、表现有糖皮质激素 抵抗的患者，发现了N363S的错义突变和外显子9a未翻译区的一处多态性。Mendonca等 巧3]研究了 1例合并严重低钟血症的女性假两性崎形、实验室检查示糖皮质激素抵抗的患 者，发现其为NR3C1基因1844T>C(V571A)突变的纯合子；运一发现也说明，糖皮质激素抵 抗的女性患者还可表现为出生前或出生后的男性化征象。
[0005] 对于家族性糖皮质激素抵抗的鉴别诊断传统的方法主要依靠生化检查和影像学 检查。运些手段存在很大的缺点：
[000引 1.检查种类多；
[0007] 2.灵敏度和特异度低；
[0008] 3.易受药物和精神状况等因素的影响；
[0009] 4.检测时间要求苛刻；
[0010] 基因诊断的优势在于：
[0011] 1.方便，安全，快捷：仅抽取2-4毫升血；
[0012] 2.任何时间都可W检查；
[001引 3.不限制饮食，服药，任何身体状况都可W检测；
[0014] 4.相比反复，多项传统检查，更为经济；
[0015] 5.发病前，疾病极早期诊断的唯一方式；
[0016]6.源头确诊，一次检测，终身受益。
[0017] 基因检测可发现致病突变，有助于早期诊断及鉴别诊断。由于FGR的临床表现和 生化检查结果均具有很大差异性，因此部分患者通过生化检查结果仍难W明确诊断或进行 鉴别诊断，可能导致漏诊、误诊。基因检测作为一种简便的诊断方法，可发现致病突变，帮助 临床明确诊断，给予早期临床干预，改善预后。
[0018] 其次，有助于指导家系筛查。由于该病为常染色体显性遗传病，患者常有明显家族 史，因此，应对存在致病突变患者的相关亲属进行基因筛查。并对筛查出的致病基因携带 者，进一步行临床筛查：对确诊的患者，早期进行干预；对无症状的致病基因携带者，应定 期随访，密切监测相关指标。
[0019] 运一切都掲示了基因诊断在临床上有巨大的应用前景。
[0020] 近年，大规模DNA平行测序平台（massivelyparallelDNAsequencing plat化rm)已经发展为主流的测序技术，运项测序技术的出现不仅令DM测序费用降到了 W前的百分之一，还让基因组测序运项W前专属于大型测序中屯、的"特权"能够被众多研究 人员分享。
[0021] 但是直接使用大规模DNA平行测序平台检测的成本目前仍然令个人难W承受。本 发明可W同时把多个甚至几十病人的家族性糖皮质激素抵抗相关基因精确的选择性捕获， 然后用于大规模测序平台，可W极大地降低基因诊断的成本，使之广泛应用于临床成为可 能。
[002引参考文献：
[0023] [l]We;rner S，Thor細M，Gustafsson JA，et al. Glucoco;rticoid receptor abnormalities in fibroblasts from patients with idiopathic resistance to dexamethasone diagnosed when evaluated for adrenocortical disorders. J Clin Elndocrinol Met油.1992:75 (4) :1005-1009.
【发明内容】
[0024] 本发明的目的是，提供一种检验家族性糖皮质激素抵抗相关基因突变的目标捕获 再测序的试剂盒。该试剂盒提高了基因捕获的通量和基因平行测序的通量，操作简便、成本 低。
[0025] 为实现上述目的，本发明采用捕获目的NR3C1基因全部外显子片段W及邻近50bp 的非编码区的探针；用于扩增待测片段的通用引物；测序接头序列；缓冲液dNTP高保真聚 合酶；链霉素磁珠。本发明采用的技术方案是：一种新的目标捕获再测序方法，包括W下步 骤：
[0026]A.设计并制备用于捕获家族性糖皮质激素抵抗相关基因突变的探针。并将运些探 针结合在磁珠、薄膜或者玻片上。探针序列见序列表。
[0027]B.将待测基因DNA样品分别片段化至200-40化P，然后将末端补平，加入的ATP使 片段两端引入粘性末端。
[0028]C.分别加入Illumina公司Nextera⑥DNASamplePrepKit中设计好的一端 带有标签序列的接头序列片段，加入连接酶，使每个片段都与的一对接头连接，形成新的片 段。
[0029]D.调节反应溫度激活DNA聚合酶，用一对Illumina公司Nex化ra?Index Kit-PCRprimers通用引物，对步骤C所得不同基因组完成连接的片段序列混合后进行PCR 扩增反应；
[0030]E.将步骤d所得全部样品的PCR扩增反应产物与步骤a所设计的捕获探针杂交， 然后经过多次洗脱纯化反应，得到待测片段。
[003。F.将待测片段通过illumina公司Miseq测序仪的标准方案进行大规模平行测序。
[0032] G.将得到的测序结果同标准数据库进行比较，得到诊断结果。
[0033] 为实现上述技术方案，步骤A所述的捕获探针是脱氧核糖核酸值NA)，或是核糖核 酸（RNA)组成，但不仅限于DNA和RNA。探针为120bp的与目标互补的片段组成。探针可W 是结合在磁珠上的，也可W结合在载玻片上，但不仅限于运些介质。链霉素磁珠材质是侣儀 钻系永磁合金或是领铁氧体、钦铁棚永磁材料、钦铁棚永磁材料、橡胶磁，但不仅限于运些 材质。
[0034] 其中，步骤A所述的捕获探针，包括覆盖基因NR3C1全部编码外显子片段和两端 50bp范围内的序列。运些探针W叠瓦式设计，片段长度为50bp-180bp，最优为75bp;片 段长度为60bp-200bp，最优为SObp;片段长度为65bp-220bp，最优为85bp;片段长度为 7化p-24化P，最优为90bp;探针之间重叠部分为5-20bp，最优为Sbp;目标区碱基的探针覆 盖度为1X至10X，最优为3X。
[0035] 本发明的主要优点在于：
[0036] 1.本发明可W在一次测序反应中同时进行多个不同来源样本全部家族性糖皮质 激素抵抗相关基因的检测；全部序列直接测出，准确率可W达到99. 99%。
[0037] 2.本发明的试剂盒可W-次完成1-48个样品的平行捕获，提高了捕获效率，极大 地降低了样品准备的成本。
[0038] 3.本发明的试剂盒可W-次完成1-1152个样品的全部家族性糖皮质激素抵抗相 关基因，近4000条序列的平行检测，充分利用设备的高通量特性，极大降低了每个样品的 测序成本。
[0039] 4.本发明的试剂盒可W-次反应同时分辨错义、插入和缺失突变。大大增加了临 床检出率和准确性。
[0040] 5.本发明的检测方法步骤简单，减少重复操作的环节，因而避免了复杂操作过程 中存在的诸多不确定引物，提高了检测准确率和稳定性。<