F快速标记Cys-Annexin V的方法及其应用
【技术领域】
[0001 ] 本发明属于阳Τ显像领域，具体设及一种1中快速标记切S-Annexin V的方法及其应 用。
【背景技术】
[0002] 细胞调亡(Apoptosis)又称程序性细胞死亡（Programmed Cell Death,PCD)，是不 同于坏死和意外死亡的、由基因调控的细胞主动性死亡过程。作为细胞生命周期中的重要 组成部分，细胞调亡的过程中伴随着一系列的生物分子及细胞形态学的改变。其中，细胞膜 脂质双层中的憐脂酷丝氨酸(PS)由细胞膜内层翻转至外层，进而暴露于细胞表面，是细胞 调亡早期事件，发生在调亡细胞形态学的改变之前，也是调亡级联反应的初始事件。的外 翻作为调亡细胞被吞隧细胞识别的标志，将会进一步引起胞浆的皱缩、染色质的浓集及核 内DNA降解等现象。因此，外翻的PS作为调亡检测的祀点，具有较高的时效性，可早期检测细 胞调亡。目前，在利用检测外翻的PS来获知细胞调亡情况的技术中，正电子断层显像 (positron emission tomogra地y，阳T)是常用的技术手段之一，其主要是利用iiC、i3N、i5〇 或1中等放射性核素标记的、可与PS特异性结合的物质作为显像剂，通过显像剂在代谢中聚 集与分布的呈像，来获知细胞调亡的情况，从而达到诊断的目的。
[0003] 在可与PS特异性结合的物质中，WAnnexin V作为PET显像剂的相关技术具有良好 的应用前景。Annexin V(膜联蛋白V，又称Annexin A5和AnxA5)是一种人体内源性蛋白，属 于化依赖性憐脂结合蛋白家族，含有319各氨基酸，包括70-80个氨基酸重复单元，分子量 约为35kD。研究表明，Annexin V与PS特异性结合的亲和力高达l(T9mol/L，其在被放射性核 素标记、进而作为PET显像剂进行体内细胞调亡的显像时，可实时监测体内调亡的发生并且 可实现细胞调亡的活体无创显像，因此，已成为监测活体细胞调亡领域的研究热点。在对 Annexin V进行正电子核素标记的技术中，1^1中标记Annexin V的"F-SFB-AnnexinV最为常 见。但是，由于"F-SFB-Annexin V是通过功能基团（"F-SFB)连接Annexin V中赖氨酸残基 上的氨基，进而标记上放射性核素的，而一分子的Annexin V蛋白中含有21个赖氨酸残基， 因此，isF-SFB标记在Annexin V上的位置是不确定的，甚至标记上的个数也不确定。另外， Annexin V中的一些赖氨酸残基处在Annexin V与PS结合的活性区域附近，i8F-SFB与该处的 赖氨酸残基连接则会影响Annexin V与PS的亲和性。运些均会导致1中-SFB-Annexin V在细 胞调亡显像时特异性较低。
[0004] 为实现对Annexin V的定位标记，且不影响Annexin V与PS的亲和性，进而提高 Annexin V调亡显像的特异性，现有技术中出现了对Annexin V进行修饰，研究新的Annexin V蛋白变体的相关技术。例如，2008年Li，Xuehe等用isF-FBABM对N端接一个半脫氨酸的 Annexin V蛋白进行标记，研究结果显示，Annexin V经上述修饰后不影响其与PS结合的亲 和力，但是"F-FBABM与蛋白的标记率比较低，仅为37 %，无法实现更为高效标记。
[0005] 为解决上述问题，中国专利文献CN104193820A中公开了一种1中标记切S-Annexin V的方法及其应用，其中采用1中定位标记的辅助基团是N-[2-(4-[i8F]氣苯甲酯氨基）乙基] 马来酷亚胺(i8F-F肥Μ)标记切s-Annexin V，然而isF-FBEM合成步骤复杂，合成时间长达2小 时左右，而且由于标记的辅助基团1SF-F邸Μ的脂溶性大，导致其不易溶于蛋白溶液中，不利 于该标记辅基与蛋白溶液中的切s-Annexin V进行反应，影响切s-Annexin V的标记，使得 所述Cys-Annexin V的标记率低，标记所用时间长，效率低。
【发明内容】
[0006] 因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中的1中定位标记切S-Annexin V的标记率低，标记时间长，效率低的缺陷，从而提供一种标记率高、标记时间短、效率高的 1申快速标记切s-Annexin V的方法与应用。
[0007] 为此，本发明提供了一种"F快速标记切S-Annexin V的方法，采用"F-Al-NOTA- Maleimide标记Cys-Annexin V。
[000引所述的方法，包括如下步骤：
[0009] (1)取含"F的溶液，加入含有A1C13的缓冲溶液和含有NOTA-maleimide的溶液，混 合均匀，于80-100°C下加热5-20min，即得含有所述i8F-Al-NOTA-Maleimide的溶液，然后进 行纯化，备用；
[0010] (2)取步骤（1)中纯化后的所述"F-Al-NOTA-Maleimide溶液，加入到含Cys- Annexin V的缓冲溶液中，混合均匀得到反应液，将所述反应液置于35-37Γ下水浴反应至 生成具有如i8F-A1-N0TA-切S-Annexin V所示结构的标记产物。
[0011] 所述"F-A1-N0TA-切s-Annexin V也可W表示为"F-A1F-N0TA-切s-Annexin V。 [0012]优选的，所述的方法，包括如下步骤：
[OOU] (1)取含"F的溶液，加入含有A1C13的缓冲溶液和含有NOTA-maleimide的溶液，混 合均匀，于90°C下加热lOmin，即得含有所述标记前体i8F-Al-N0TA-Maleimide的溶液，然后 进行纯化，备用；
[0014] (2)取步骤（1)中纯化后的所述1 8F-A 1 -NOTA-Ma 1 e imi de溶液，加入到含Cy S - Annexin V的缓冲溶液中，混合均匀得到反应液，将所述反应液置于36°C下水浴反应20- 40min，即得如"F-A1-N0TA-切s-Annexin V所示结构的所述标记产物。
[0015] 所述步骤（1)中，将制备的所述i8F-Al-N0TA-Maleimide溶液采用制备型HPLC法进 行纯化，色谱条件为：制备型反相C18柱，W含质量浓度为0.05%-0.3%Ξ氣乙酸和质量浓 度为5 % -20 %的乙腊溶液为流动相进行洗脱，流速为1.5-5血/min，检测波长为210-230皿， 收集出峰时间为8-13min下流出的组分，即为纯化后的所述i8F-Al-N0TA-Maleimide溶液。
[0016] 优选的，所述步骤（1)中，还包括将制备的所述18F-Al-N0TA-Maleimide溶液采用制 备型HPLC法纯化的步骤，色谱条件为:制备型反相C18柱，W含质量浓度为0.1%Ξ氣乙酸的 质量浓度为10 %的乙腊溶液为流动相进行洗脱，流速为2mL/min，检测波长为220nm，收集出 峰时间为12.34min下流出的组分，即为纯化后的所述i8F-Al-N0TA-Maleimide溶液。
[0017] 所述的方法，所述步骤(1)中，加入的所述含1中的溶液、所述含有A1C13的缓冲溶液 和所述NOTA-Maleimide溶液的体积比例为1:1:1，其中所述NOTA-Maleimide的浓度为3- lOmg/mL，所述含有A1C13的缓冲溶液中A1C13的浓度为5-15mg/mL。
[001引所述的方法，所述步骤（2)中，所述1咕-41-^了4-]\1曰16；[1111(16溶液与所述〔73- Annexin V溶液的体积比为1:1-10，所述切s-Annexin V的浓度为0.2-20mg/mL，所述"F-A；L- NOTA-Ma 1 e imi de溶液的放射性活度为1 -1 OOOMBq/mL。
[0019]优选的，所述含有A1C13的缓冲溶液中A1C13的浓度为lOmg/mL所述NOTA- Maleimide的浓度为7mg/ni;所述Cys-Annexin V的浓度为lOmg/mL。
[0020] 优选的，所述18F-Al-N0TA-Maleimide溶液的放射性活度为500MBq/mL。
[0021] 所述的方法，所述含有AICI3的缓冲溶液为醋酸盐缓冲液、憐酸盐缓冲液或巧樣酸 盐缓冲液中的一种或几种的混合液;所述含切s-Annexin V的缓冲溶液为水、醋酸盐缓冲 液、憐酸盐缓冲液或巧樣酸盐缓冲液中的任意一种或几种的混合液；所述含N0TA- maleimide的溶液为乙腊、乙醇或水。所述含A1C13的缓冲溶液抑值为3-5,抑值优选为4。所 述含Cys-Annexin V的缓冲溶液抑值为6-8，pH值优选为7。
[0022] 优选的，所述含有A1C13的缓冲溶液为乙酸钢-乙酸缓冲液，浓度为0.2-0.5mol/L， pH值在3-5范围内。
[0023] 所述NOTA-maleimide的中文名称为马来酷亚胺基乙基酷胺单1，4,7-Ξ氮杂环壬 烧-1，4,7-Ξ乙酸。
[0024] 所述的方法，还包括采用缓冲液调节混合均匀的所述i8F-Al-N0TA-Maleimide和含 切s-Annexin V的溶液的混合液即反应液的抑值至5-9的步骤。优选的，所述缓冲液为憐酸 盐缓冲液或巧樣酸盐缓冲液中的一种或两种的混合液。
[0025] 本发明提供了一种由上述的方法制备得到的标记产物i8F-A^N0TA-切s-Annexin V。
[0026] 本发明提供了一种所述的iSp-Al-NOTA-切s-Annexin V在制备阳T显像剂中的应用
[0027] 本发明还提供了一种阳T显像剂，包括标记产物"F-A1-N0TA-切s-Annexin V。
[0028] 本发明技术方案相比现有技术，具有如下优点：
[00巧](1)本发明所述的"F快速标记Cys-Annexin V的方法，采用"F-Al-NOTA- Maleimide标记切s-Annexin V，首先，Annexin V的Ξ维结构显示，其N-端和C-端都位于分 子膜结合点的对面，在重组过程中对Annexin V的两端进行修饰并不影响重组蛋白在 Escherichia colli的表达或折叠，也不改变其与膜PS结合的亲合性，因此，在Annexin V的 C-末端添加1个半脫氨酸得到的切s-Annexin V，其与PS结合的亲合性并未受到影响，与此 同时，经过修饰得到的切s-Annexin V可与所述标记前体1中-4^側了4-]\1曰16；[1]11(16的基团实 现高选择性的连接，Cys-Annexin V的C端的游离琉基与所述标记前体"F-Al-NOTA- Maleimide上的双键发生特异性连接，可较好的保证正电子显像核素1中的定位标记，避免了 标记位置、标记数量的不确定带来的显像特异性低的问题，同时显著提高了标记率，大大缩 短了标记时间，提高了标记效率，解决了现有技术中的正电子显像核素1中定位标记Cys- Annexin V的标记率低，标记时间长，效率低的问题；
[0030] 虽然现有技术中i8F-F邸M-切s-Annexin ￥，1中斗邸1也是定位标记切3-4]1]1糾;[]1￥ 半脫氨酸上游离的琉基，但是从"F离子到isF-FBEM-切s-Annexin V的标记时间大约120分 钟，而本发明从1中离子到i8F-A1-N0TA-切S-Annexin V的标记时间约为60分钟，与现有技术 相比，本发明的标记时间大大缩短，操作