一种n-甲基靛红酸酐快速标记多糖的制备方法
【专利说明】一种N-甲基靛红酸酐快速标记多糖的制备方法
[0001]
技术领域
[0002]本发明属于荧光标记技术领域，具体涉及一种N-甲基靛红酸酐快速标记多糖的制备方法。
技术背景
[0003]在生命科学中，多糖是不可或缺的生物大分子，但因其缺少发光基团，因此不易于检测，故妨碍了它的研宄。荧光标记物可以通过化学方法将其荧光发光基团结合到糖链分子上，从而使多糖带有荧光基团，便于使用常规检测手段可以对多糖进行检测，有利于进一步对其作用机理进行研宄。
[0004]根据文献报道，放射性同位素常用于标记多糖，以此来示踪多糖的生物活性，进而研宄其作用机理。但是，因放射性同位素会造成实验生物体产生不良反应，不便于应用在多糖的活性研宄。然而，荧光标记物可以通过化学方法将其荧光发光基团结合到糖链上，使多糖具有一定的荧光性。结合到多糖上的荧光基团具有激发和发射波长的特点，因此使用常规的荧光检测器便可以检测和示踪多糖。且有文献报道，荧光标记后的多糖其生物活性与原多糖没有明显差异，且还能直接对其进行检测。目前国内对于多糖的荧光标记物主要为异硫氰酸荧光素(FITC)，FITC主要标记糖胺聚糖和脂多糖，并非所有的多糖都可标记。
[0005]基于上述现状，本发明以N-甲基靛红酸酐为荧光标记物，对多糖的羟基特异性进行标记，反应条件温和、反应时间短、标记物分离纯化简单。荧光标记后的多糖，可以使用常规的荧光检测器进行检测，便于对多糖的功能和机制进行研宄。
【发明内容】
[0006]本发明提供了一种N-甲基靛红酸酐快速标记多糖的制备方法。用荧光标记物标记多糖，使得多糖可以方便的用荧光检测器进行检测，从而便于对多糖的功能和机制进行研宄。
[0007]本发明的技术方案:
(1)样品处理:用0.lmol/L、PH 8.0的硼酸盐缓冲液和5~10mL浓度w/v为50%的二甲基亚砜溶液溶解配制成40~80mg/mL多糖溶液；所述多糖溶液为阿拉伯胶溶液或麦芽糊精溶液；
(2)荧光标记储备液的制备:N-甲基靛红酸酐用二甲基亚砜溶解配制成20mg/mL溶液；
(3)将步骤(2)得到的荧光标记储备液加入到步骤(I)得到的多糖溶液中，35°C下孵化15~20min，荧光标记物N-甲基靛红酸酐与多糖的质量比为1:50_1:60 ；
(4)荧光标记多糖的分离:采用有机溶剂沉淀法，即将步骤(3)反应后的溶液加入无水乙醇，利用多糖醇沉的性质将多糖分离，荧光标记多糖溶液与无水乙醇的体积比为I:4~1:8,醇沉的多糖6000Xg离心10~20min，离心得到的上清液与无水乙醇体积比为1:2~1:4，再次醇沉离心；
(5)荧光标记多糖的纯化:将两次得到的沉淀混合，用蒸馏水复溶，使用砂芯过滤装置过滤以除去未与多糖反应的水不溶性N-甲基靛红酸酐和杂质，滤液冻干，即可得到荧光标记多糖。
[0008]本发明的有益效果:
1、本发明所选用的荧光标记物N-甲基靛红酸酐与其他荧光标记物相比(如FITC、尼罗红等)价格低廉。
[0009]2、本发明荧光标记物N-甲基靛红酸酐与多糖的反应条件温和、反应时间短、荧光标记多糖分离纯化方法简单。
[0010]3、荧光标记后的多糖，可以使用常规的荧光检测器进行检测，便于对多糖的功能和机制进行研宄。
【附图说明】
[0011]图1为焚光标记阿拉伯胶与阿拉伯胶在360nm处激发的焚光光谱；
图2为荧光标记麦芽糊精与麦芽糊精在360nm处激发的荧光光谱；
图3为激光共聚焦显微镜观察的荧光标记麦芽糊精在微胶囊中的分布；
图4为微胶囊中荧光标记麦芽糊精的荧光强度。
【具体实施方式】
[0012]实施例1
(I)样品处理:用0.lmol/L,PH 8.0的硼酸盐缓冲液5~10mL和浓度w/v 50%的二甲基亚砜溶液溶解配制成40~80mg/mL阿拉伯胶溶液。
[0013](2)荧光标记储备液的制备:N-甲基靛红酸酐用二甲基亚砜溶解配制成20mg/mL溶液。
[0014](3)将配制好的荧光标记储备液按照荧光标记物N-甲基靛红酸酐与阿拉伯胶的质量比1:50的比例加入到阿拉伯胶溶液中35°C下孵化15min。
[0015](4)荧光标记多糖的分离:N-甲基靛红酸酐标记的阿拉伯胶用有机溶剂沉淀法进行分离，向标记后的多糖溶液中加入无水乙醇，利用多糖醇沉的性质将多糖分离，荧光标记多糖溶液:无水乙醇体积比1:4，醇沉的多糖6000Xg离心10~20min，离心得到的上清液:无水乙醇体积比1:2~1:4,再次醇沉离心。
[0016](5)荧光标记多糖的纯化:将两次得到的沉淀混合，用蒸馏水复溶，使用砂芯过滤装置过滤以除去未与多糖反应的水不溶性N-甲基靛红酸酐和杂质，滤液冻干，即可得到荧光标记阿拉伯胶。
[0017]实施例2
(I)样品处理:用0.lmol/L,PH 8.0的硼酸盐缓冲液5~10mL和w/v 50%的二甲基亚砜溶液溶解配制成40~80mg/mL麦芽糊精溶液。
[0018](2)荧光标记储备液的制备:N-甲基靛红酸酐用二甲基亚砜溶解配制成20mg/mL溶液。
[0019](3)将配制好的荧光标记储备液按照荧光标记物N-甲基靛红酸酐与麦芽糊精的质量比1:55的比例加入到麦芽糊精溶液中35°C孵化18min。
[0020](4)荧光标记多糖的分离:N-甲基靛红酸酐标记的阿拉伯胶用有机溶剂沉淀法进行分离，向标记后的多糖溶液中加入无水乙醇，利用多糖醇沉的性质将多糖分离，荧光标记多糖溶液:无水乙醇体积比1:6，醇沉的多糖6000Xg离心10~20min，离心得到的上清液:无水乙醇体积比1:2~1:4,再次醇沉离心。
[0021](5)荧光标记多糖的纯化:将两次得到的沉淀混合，用蒸馏水复溶，使用砂芯过滤装置过滤以除去未与多糖反应的水不溶性N-甲基靛红酸酐和杂质，滤液冻干，即可得到荧光标记麦芽糊精。
[0022]实施例3
(I)样品处理:用0.lmol/L,PH 8.0的硼酸盐缓冲液5~10mL和w/v 50%的二甲基亚砜溶液溶解配制成40~80mg/mL麦芽糊精溶液。
[0023](2)荧光标记储备液的制备:N-甲基靛红酸酐用二甲基亚砜溶解配制成20mg/mL溶液。
[0024](3)将配制好的荧光标记储备液按照荧光标记物N-甲基靛红酸酐与麦芽糊精的质量比1:60的比例加入到麦芽糊精溶液中35°C孵化20min。
[0025](4)荧光标记多糖的分离:N-甲基靛红酸酐标记的阿拉伯胶用有机溶剂沉淀法进行分离，向标记后的多糖溶液中加入无水乙醇，利用多糖醇沉的性质将多糖分离，荧光标记多糖溶液:无水乙醇体积比1:8，醇沉的多糖6000Xg离心10~20min，离心得到的上清液:无水乙醇体积比1:2~1:4,再次醇沉离心。
[0026](5)荧光标记多糖的纯化:将两次得到的沉淀混合，用蒸馏水复溶，使用砂芯过滤装置过滤以除去未与多糖反应的水不溶性N-甲基靛红酸酐和杂质，滤液冻干，即可得到荧光标记麦芽糊精。
[0027](6)荧光标记微胶囊的制备:麦芽糊精(含部分N-甲基靛红酸酐标记的麦芽糊精)与变性淀粉溶于60°C蒸馏水，再加入已溶有乳化剂油脂，经高压均质、喷雾干燥，得到荧光标记微胶囊。
[0028](7)观察:将得到的荧光标记微胶囊平铺于载玻片上，保证颗粒分散。使用激光共聚焦显微镜在405nm激发波长下观察微胶囊中麦芽糊精的分布情况。
【主权项】
1.一种N-甲基靛红酸酐快速标记多糖的制备方法，其特征是: (1)样品处理:用0.lmol/L、PH 8.0的硼酸盐缓冲液和5~10mL浓度w/v为50%的二甲基亚砜溶液溶解配制成40~80mg/mL多糖溶液； (2)荧光标记储备液的制备:N-甲基靛红酸酐用二甲基亚砜溶解配制成20mg/mL溶液； (3)将步骤(2)得到的荧光标记储备液加入到步骤(I)得到的多糖溶液中进行孵化； (4)荧光标记多糖的分离:采用有机溶剂沉淀法，即将步骤(3)的荧光标记多糖溶液加入无水乙醇，利用多糖醇沉的性质将多糖分离，第一次离心得到的上清液与无水乙醇体积比为1:2~1:4，再次醇沉离心； (5)荧光标记多糖的纯化:将两次得到的沉淀混合，用蒸馏水复溶，使用砂芯过滤装置过滤以除去未与多糖反应的水不溶性N-甲基靛红酸酐和杂质，滤液冻干，即可得到荧光标记多糖。
2.根据权利要求1所述的一种N-甲基靛红酸酐快速标记多糖的制备方法，其特征是:所述多糖溶液为阿拉伯胶溶液或麦芽糊精溶液。
3.根据权利要求1所述一种N-甲基靛红酸酐快速标记多糖的制备方法，其特征在于:步骤(3)中荧光标记物N-甲基靛红酸酐与多糖的质量比为1:50~1:60。
4.根据权利要求1所述一种N-甲基靛红酸酐快速标记多糖的制备方法，其特征在于:步骤(3)中所述的孵化条件为:35°C下孵化15~20min。
5.根据权利要求1所述一种N-甲基靛红酸酐快速标记多糖的方法及分离纯化工艺，其特征在于:步骤(4)中第一次离心多糖醇沉时荧光标记多糖溶液与无水乙醇体积比为1:4~1: 8，醇沉的多糖 6000 X g 离心 10~20min。
【专利摘要】一种N-甲基靛红酸酐快速标记多糖的制备方法，属于荧光标记技术领域。本发明以荧光标记物N-甲基靛红酸酐标记多糖，其方法为：N-甲基靛红酸酐储备液与多糖溶液在35℃条件下孵化15~20min，并通过有机溶剂沉淀法对荧光标记多糖进行分离纯化，该反应反应条件温和、反应时间短、荧光标记多糖分离纯化方法简单。荧光标记后的多糖，可以使用常规的荧光检测器进行检测，便于对多糖的功能和机制进行研究。
【IPC分类】G01N33-52, G01N21-64
【公开号】CN104535754
【申请号】CN201410748956
【发明人】涂宗财, 李如一, 石燕, 王辉, 杨文华, 李雪, 常海霞
【申请人】南昌大学
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2014年12月10日