一种es-2肽的季铵化壳寡糖修饰物及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种ES-2肽的季铵化壳寡糖修饰物及其制备方法与应用，属于生物医药技术领域。
【背景技术】
[0002]内皮抑素(Endostatin，ES)是一种内源性的新生血管生成抑制因子，能够有效地抑制新生血管的形成，从而切断肿瘤的营养供给途径和废物代谢途径，起到抑制肿瘤的生长和转移的作用。ES-2肽(IVRRADRAAVP)是ES结构中一个具有明显抗新生血管生成、抗肿瘤活性的短肽段，更容易进入细胞内部，且更容易获得和改造，但是同ES—样，ES-2肽也存在体内半衰期短和稳定性差等缺点，这些缺点大大的限制了ES-2肽进一步的应用。
[0003]壳寡糖是目前发现的自然界存在的唯一一种阳离子多糖，结构明确且有靶向性，经季铵化后能进一步提高其带正电荷的能力。
[0004]N,N, N-三甲基季铵化壳聚糖(TMC)制备过程中，壳寡糖的2_冊2被甲基化后首先生成2-NH( CH3)甚至2-N( CH3) 2，然后才能进一步形成2-N( CH3) 3+季铵基团，因此，水溶性良好的TMC中的自由氨基数量极少(一般〈10% )，导致其对ES-2的结合效率较低、结合物活性保持率差，制约了季铵化壳寡糖对ES-2肽分子进行化学修饰。
[0005]而且，由于ES-2短肽分子量较小，且等电点位10.42，属于碱性蛋白，所以用同带正电荷的季铵化壳寡糖对其进行修饰的难度相较于对其他非碱性蛋白修饰的难度要大的多。
【发明内容】
[0006]针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种ES-2肽的季铵化壳寡糖修饰物及其制备方法。
[0007]由于在肿瘤发生和发展过程中，新生血管的生成会为肿瘤组织提供营养并运走废物，因此如果抑制肿瘤引起的新生血管的生成，就可以起到“饿死肿瘤”的作用;在糖尿病等疾病过程中，新生血管的生成会导致出血等严重反应，对于新生血管的生成的抑制可以明显治疗病人视网膜病变等并发症。因此，本发明的另一个目的是提供该ES-2肽的季铵化壳寡糖修饰物在制备抗新生血管生成和/或抗肿瘤药物中的应用。
[0008]为实现上述目的，本发明采用下述技术方案:
[0009]一种ES-2肽的季铵化壳寡糖修饰物，由ES-2肽分子上的羧基与季铵化壳寡糖(0-HTCC)分子的氨基通过酰胺键结合，结构式如下:
[0010](ES-2)n-C0-NH-0-HTCC；
[0011]式中，n = l?10;ES-2的分子量为1223Da，等电点为10.42;0-HTCC的分子量为100Da以上，自由氨基摩尔含量为不小于20%。
[0012]优选的，所述η= I?5，即一分子O-HTCC与I?5分子ES-2共价结合形成修饰物;0-HTCC的分子量为100Da?1000Da，自由氨基摩尔含量为不小于50%。
[0013]季铵化壳聚糖的分子量会影响所修饰的ES-2肽的活性，若季铵化壳聚糖的分子量过大，会造成严重的空间位阻和构象变化，使小分子的ES-2肽的活性显著降低;但季铵化壳聚糖的分子量也不宜过低，需保证一定量的自由氨基数量。本发明综合考虑所修饰的ES-2肽的活性以及与季铵化壳聚糖结合率，优选O-HTCC的分子量为100Da?lOOOODa，在较好保持ES-2肽活性的同时，还提高了与季铵化壳聚糖的结合率。
[0014]除非另外指出，术语一自由氨基”:伯胺基团(即一順2)，亦称一级胺基。
[0015]术语“季铵化壳寡糖”:壳寡糖的C6-OH上接枝一个含有季铵盐的基团而得到的衍生物。
[0016]上述ES-2肽的季铵化壳寡糖修饰物的制备方法，步骤为:
[0017](I)向ES-2肽溶液中加入碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)进行羧基活化，ES-2肽与EDC的摩尔比为1:(1-100)，EDC与NHS的摩尔比为3: (0.1-5)，反应温度为20°C?30°C，缓慢搅拌且避光反应15?45min;
[0018](2)将步骤(I)反应后的溶液加入到季铵化壳聚糖溶液中，使ES-2肽与季铵化壳寡糖的质量比为1:(0.1?30)，反应4?8h，得粗品，经分离纯化，即得ES-2肽的季铵化壳寡糖修饰物。
[0019]步骤(I)中，所述ES-2肽溶液为将ES-2肽溶于I3BS缓冲液而得到的溶液;ES-2肽溶液的pH为4.0-6.0，其中ES-2肽的浓度为0.5?5mg/ml。
[0020]步骤(2)中，所述季铵化壳聚糖溶液为将季铵化壳聚糖溶于PBS缓冲液而得到的溶液;季铵化壳聚糖溶液的PH优选为7.0-9.0，其中季铵化壳聚糖的浓度为I?5mg/ml。由于中性偏碱性环境有利于ES-2肽分子的羧基与季铵化壳寡糖分子的氨基的酰胺键的形成，故本发明将季铵化壳聚糖溶液的pH选择为7.0-9.0。
[0021 ] 步骤(2)中，所述分离纯化的具体方法为:采用SephadexG-25或Sephadex30凝胶层析柱进行分离纯化；用pH为6.0，浓度25mmol/L磷酸盐缓冲液进行线性洗脱，流速1.0ml/min，检测波长254nm，收集洗脱峰组分;采用截留分子量为500?1000D透析袋中透析48h，去除盐分，冷冻干燥。由于SephadexG-25和Sephadex30凝胶层析柱的分离纯化范围是O?10000，ES-2和季氨化壳寡糖以及修饰物的分子量正好处于这两种凝胶层析柱的分子范围之中，所以本发明选择SephadexG-25或Sephadex30作为凝胶层析柱进行分离纯化，其分离纯化效果较好。
[0022]优选的，步骤(I)中，ES-2肽与EDC的摩尔比为1: (10?50)，EDC与NHS的摩尔比为3:(0.2 ?2)0
[0023]优选的，步骤(2)中，ES_2肽与季铵化壳寡糖的质量比为I: (0.5?5)。
[0024]优选的，步骤(2)中，所述季铵化壳聚糖的制备方法为:将壳聚糖溶于醋酸水溶液中，加入乙醇，室温搅拌，充分溶胀后加入苯甲醛，制得乳白色胶状反应液;将上述乳白色胶状反应液干燥后研磨，加入异丙醇、2，3-环氧丙基三甲基氯化铵进行反应，反应液经过滤、洗涤、干燥后，再加入盐酸乙醇溶液进行反应，经沉淀、干燥后得季铵化壳聚糖粗品；上述季铵化壳聚糖粗品溶于水中，采用截留分子量为100?500D透析袋中透析48h，去除小分子杂质，透析液冷冻干燥，制得季铵化壳聚糖(O-HTCC)。
[0025]本发明制备的季铵化壳聚糖，将2，3_环氧丙基三甲基氯化铵(GTMAC)接枝到壳寡糖C6-0H上得到O-(羟基)丙基-3-三甲基氯化铵壳寡糖(O-HTCC)衍生物，水溶性更好，自由氨基率在90%以上。
[0026]采用EDC-NHS对羧基进行活化，是有机合成反应中的常用方法，但也是难点所在，EDC和NHS的加入量、反应体系的pH、反应温度和反应时间等因素都会影响活化的效率;而且不同条件活化后的羧基与氨基的结合率也存在较大差异。本发明针对ES-2肽为碱性蛋白，采用同带正电荷的季铵化壳聚糖对其进行修饰的难度较对其他非碱性蛋白进行修饰难度要大的多的问题，优化了 H)C和NHS的加入量、反应温度和纯化手段，通过上述条件的协同作用，成功制备出稳定性更高、半衰期更长、细胞亲和性更高、生物活性更强的季铵化壳聚糖-ES-2肽修饰物。
[0027]上述ES-2肽的季铵化壳寡糖修饰物在制备伴随新生血管生成疾病的治疗药物和/或抗肿瘤药物中的应用也是本发明的保护范围。具体的，所述伴随新生血管生成疾病包括糖尿病视网膜病变、老年性黄斑病变和关节炎等。
[0028]本发明的有益效果:
[0029](I)本发明通过调整EDC和NHS加入的摩尔比、反应温度和反应时间等条件，可以制备得到ES-2与季铵化壳寡糖不同结合率的修饰物。
[0030](2)本发明制备的ES-2肽的季铵化壳寡糖修饰物与ES-2肽相比，其稳定性更高、半衰期更长、细胞亲和性更高、生物活性更强。
【附图说明】
[0031]图1:本发明实施例2制备的ES-2肽的季铵化壳寡糖修饰物的MALD1-T0F-MS质谱鉴定结果。
[0032]图2:抗细胞增殖试验的结果。
[0033]图3:抑制内皮细胞迀移试验结果，图中，a为空白，13为混合物，c为ES_2，d为0_HTCC-ES-2o
[0034]图4:热稳定性试验结果。
[0035]图5:细胞亲和性试验结果。