一种抗手足口病人免疫球蛋白及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物制药领域的治疗用血液制品，特别是设及一种抗手足口病人免疫 球蛋白及其制备方法。
【背景技术】
[0002] EV71病毒属于微小病毒科肠道病毒属，为单股正链RNA病毒，主要由柯萨奇病毒 (Cox)、埃可病毒化cho)、肠道型病毒71型化V71)中的一种或几种引起。该病早期病原体主 要为C0XA16型。1969年，研究者首次从患有中枢神经系统疾病的婴儿粪便标本中分离得到 肠道病毒71型化nterovirus 71店￥71)。1974年^来，6￥71病毒曾在世界范围内多次暴发， 主要引起婴幼儿(0~6岁)手足口病化FMD)和无菌性脑膜炎、脑干脑炎和脊髓灰质炎样的麻 搏等多种与神经系统相关的疾病，而中枢神经系统感染导致的肺水肿、肺出血和屯、肌炎，使 其致残和病死率较高。每次疫情暴发，均会夺走许多婴幼儿的生命。1997年W来，EV71病毒 的流行在亚太地区呈上升趋势。1981年，我国在上海发现手足口病，随后北京、河北、天津、 福建、吉林、山东、湖北、广东和安徽等十几个省(市)相继出现疫情。2008年EV71导致的手足 口病疫情在多个省市暴发，2009年1~4月，全国累计报告手足口病例115618例，重症773例， 死亡50例，由于死亡的都是婴幼儿，引起很大的社会恐慌。到目前为止，临床上尚无预防 EV71病毒感染的疫苗或特异、高效的抗病毒治疗药物，静脉注射人免疫球蛋白（IVIG)能有 效地抵抗炎症的发生发展，对感染手足口病的患者有一定的治疗作用，但特异性不强。因此 开发具有特异性的针对手足口病毒的人免疫球蛋白具有重要的意义，对于治疗因巨细胞病 毒引起的重症感染具有不可替代的临床应用价值。
【发明内容】
[0003] 本发明要解决的技术问题是提供一种有效治疗手足口病毒重症感染的人免疫球 蛋白及其制备方法，使其应用于工业化生产，且产品高效、安全、可靠。
[0004] 本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
[0005] -种抗手足口病人免疫球蛋白，其手足口病人免疫球蛋白中和抗体效价大于等于 1:800。
[0006] 所述免疫球蛋白与正常免疫球蛋白人血清相比，主要沉淀线为IgG。所述免疫球蛋 白的纯度为98.5 %~100 %。所述免疫球蛋白的单体和二聚体之和达到99 %~99.5 %，PKA <30IU/mL，ACA<45%。
[0007] 其中，PKA指激肤释放酶原激活剂，ACA指抗补体活性。
[000引本发明所述的抗手足口病人免疫球蛋白具有高效、安全、可靠、特异性强等优点， 可W用于大规模的工业化生产。
[0009] 制备所述免疫球蛋白的原料血浆为肠道病毒抗体效价不低于1:80的血浆。
[0010] 本发明所述的抗手足口病人免疫球蛋白可从根据实际需要选择合适的剂型，例如 液体制剂或冻干制剂;具体使用时，可W采用静注或其他的方式。
[0011] 本发明还提供一种抗手足口病人免疫球蛋白的制备方法，包括W下步骤：
[0012] (1)用中和试验的方法筛选出手足口病毒不低于1:80中和抗体效价滴度的原料血 浆；
[0013] (2) W筛选后的所述原料血浆制备混合血浆供试品，所述混合血浆中手足口病毒 中和抗体效价滴度不低于1:160;
[0014] (3)将所述混合血浆供试品采用低溫乙醇压滤法分离结合层析法纯化生产人免疫 球蛋白，生产操作压力为0.05~0.3MPa，主要包括从血浆中分离组分II+III沉淀、从组分II +ΙΠ 中分离组分II、层析、超滤、病毒灭活、配置、分装得到产品。
[0015] 进一步，步骤(1)所述中和试验法具体步骤包括如下：
[0016] (A)样品稀释：
[0017] 血浆样本用细胞维持液预先进行1:4预稀释后，56°C灭活30分钟，后继续10倍稀 释，即最终1:40倍稀释的样品液；
[0018] 打开足够量的96孔细胞板，标明病毒回滴用板和样品试验板，并在各样品试验板 盖上标示该板试验样本号、病毒性型号和代次；
[0019] 在样品试验板的各样品孔中加入SSliL细胞维持液，病毒回滴孔与阴性对照孔加入 5化L细胞维持液；
[0020] 将预先灭活的样品液分别加入到96孔细胞板的相应位置，每孔加样品25化，每样 品作竖向两孔平行;所述细胞维持液为体积比为3%的胎牛血清的DMEM液；
[0021] (B)攻击病毒：
[0022] 攻击病毒液制备:根据试验的标本数用维持液制备足量的攻击病毒液，将病毒稀 释到100仇1〇5〇/0.05111^除病毒回滴孔与阴性对照孔外，其余各孔中均加入50化含 100CCI化0的攻击病毒液；
[0023] 回滴100CCI化0攻击病毒液：用细胞维持液将攻击病毒液作1〇Λ?〇Λ?0-3稀释，将 攻击病毒液10°与其1〇Λ?〇Λ?0-3稀释度的病毒液分别加入到相应的病毒回滴用96孔细胞 板孔中，每个稀释度加10孔，5化L/孔；
[0024] 阴性对照：向阴性对照各孔中再加入SOiiL细胞维持液；
[0025] 将所有96孔细胞板放入37°C、含有C〇2体积百分数为5%的培养箱中和培养2小时；
[00%] (C)细胞悬液的配制与添加：
[0027]细胞悬液的配制：取足够量的RD细胞，消化后计数，稀释至试验所需的细胞液量， 试验用细胞悬液浓应为1 X 1〇5个/mL，配好的细胞液立即使用；
[002引细胞悬加：中和培养后每孔加细胞悬液10化L，约1 X 104个/孔；
[0029] (D)培养及观察统计：
[0030] 将完成W上操作的96孔细胞板放置37Γ、含有C〇2体积百分数为5%的培养箱中培 养7天，病毒接种后的第5天显微镜下观察细胞生长情况，第7天最终判定结果，并记录统计。
[0031] 进一步，步骤(3)所述免疫球蛋白制备具体步骤包括如下：
[0032] (A)从血浆中分离组分II+III:
[0033] 将冷冻血浆在溫度在1~4°C之间融化，离屯、去冷沉淀，用抑值为4.0的醋酸缓冲液 调节血浆pH值到6.9~7.3，加入浓度为54 %的乙醇，使血浆中乙醇的最终浓度为8 %~ 10%，使反应液的最终溫度为-1~-4°C，离屯、分离组分I;
[0034] 用抑值为4.0的醋酸缓冲液调节组分I上清液的抑到5.85~6.05，加入浓度为95 % 的乙醇，使血浆中乙醇的浓度从8%达到20%，使反应液的最终溫度控制在-3.0°C~-5.0 °C，用压滤机进行加压过滤，过滤后的清液入另一个反应罐，过滤完成时用压缩空气将压滤 机吹干，打开压滤机，收取组分Π +ΠI沉淀；
[0035] (B)将上步加压过滤后的组分II+III沉淀用加入4~6倍量预冷的注射用水溶解， 使反应溫度控制在0~2.0°C。用pH值为4.0的醋酸缓冲液调节制品的pH值为5.05~5.25，加 入浓度为95 %的乙醇，使血浆中乙醇的浓度达到18 %，反应液溫度最终控制在-4.5 °C~- 5.5 °C，用压滤机进行加压过滤分离组分ΠI上清液；
[0036] 向组分ΙΠ 上清液中加入1M碳酸氨钢溶液调节pH值为7.2~7.6,每升溶液加入 2.8g氯化钢W提高反应液离子强度;加入95%的乙醇，使反应液乙醇的最终浓度为25%，在 加入乙醇过程中，冷却反应液，使其最终溫度为-10.0°C~-12.0°C，继续揽拌0.5小时，静止 1小时后用压滤机进行加压过滤，过滤后的清液做回收乙醇处理，过滤完成时用压缩空气将 压滤机吹干，打开压滤机，收取组分II沉淀，组分II沉淀即为手足口病人免疫球蛋白的粗制 品；
[0037] (C)将上步加压过滤后的组分II沉淀用0~：TC注射用水溶解5~7小时，溶解溫度 控制在0°C~3.0°C;
[003引将充分溶解的组分II过滤澄清，加入3 %盐酸调节溶液的pH值至6.50~6.70之间， 用5 %氯化钢溶液调节溶液的电导为1.30~1.50ms/m;
[0039] 采用阴离子交换层析介质二乙氨乙基交联葡聚糖凝胶装填层析柱；
[0040] 用AKTA-process层析系统控制进液流速，将层析柱用pH值为6.5~6.7的0.03M憐 酸盐缓冲液平衡至出液的抑值为6.5~6.7后上样，上样压力不超过1.5Kg/cm，收集流出的 蛋白峰，上样结束后，用pH值为6.5~6.7的憐酸盐缓冲液冲洗凝胶上的残余蛋白，合并滤过 液和后顶液称重，用3 %盐酸调节溶液抑至3.50~4.00，将调整好的蛋白液通过转接管道抽 至清洁的反应罐中；
[0041] (D)启动超滤器，开始初浓缩，控制溫度在2°C~10.(TC之间，蛋白浓度达到6%~ 8% (g/mL)时，加入2.0°C~10.0°C注射用水，使液蛋白浓度在2%~5%并进行恒体积超滤 透析脱盐，超滤透析过程中蛋白液体积保持恒