专利名称：犬静脉注射免疫球蛋白、其制备方法以及犬静脉注射免疫球蛋白制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种犬静脉注射免疫球蛋白、其制备方法以及犬静脉注射免疫球蛋白制剂。
背景技术：
宠物在人们日常生活中的地位越来越重要，宠物保健已经成为一个工要的课题。犬用血液制品是从犬血浆中分离提取得生物制品，又称血浆衍生物。这类制品用于犬病的治疗或被动免疫。
上述生物制品之一即为免疫球蛋白(Ig)，它是机体免疫系统的重要组成部分，在防御感染和免疫调节中发挥着极为重要的作用。
从使用途径上讲，免疫球蛋白和免疫球蛋白制剂一般分为肌肉注射免疫球蛋白(IMIG)和静脉注射免疫球蛋白(IVIG)两类，现已有发明人对犬用免疫球蛋白进行研究与制备，如专利申请00123292.4，但是，由于技术上的原因，其只能研制出口服或肌肉注射的免疫球蛋白(IMIG)，在使用上具有很大的局限性，主要表现在(1)用量过小，即使多部位注射，总用量也只有20毫升；(2)注射部位会有严重的疼痛反应；(3)进入循环前会有部分Ig被酶降解，并且起效较慢。静脉注射免疫球蛋白(IVIG)的作用机理是被动免疫，主要用来预防和治疗病毒性、细菌性感染，以及各种免疫缺乏症和免疫低下症等，主要体现在抗体补充和免疫调节，包括靶细胞阻断作用、免疫调理作用、结合活化的补体成分、改变免疫复合物的结构和可溶性、改善IgG的新陈代谢率、增加末梢血中自然杀伤细胞的数量并增强其功能、中和自身免疫性抗体以及调节多种细胞因子的表达等。
目前，尚没有对犬用静脉注射用免疫球蛋白的研究和应用的文献报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种犬静脉注射免疫球蛋白。
本发明的另一目的在于提供犬静脉注射免疫球蛋白的制备方法。
本发明还以目的在于提供一种犬静脉注射免疫球蛋白制剂。
首先，本发明提供的一种犬静脉注射免疫球蛋白，是由来自健康犬的血浆或血清，经低温乙醇法或利凡诺结合低温乙醇法分离、制备得到的pH值上述犬静脉注射免疫球蛋白中，所述血浆或血清来自多种犬病，包括细小病毒病、犬瘟热、犬传染性肝炎、狂犬病、和犬副流感的疫苗免疫大量健康犬后采集的混合血浆或血清。
上述犬静脉注射免疫球蛋白中，所述低温乙醇法包含以下步骤1).将血浆或血清融化，逐渐降温至0℃，控制pH7.0～7.4，加入预冷乙醇至终浓度8％(g/100ml)，离心去除杂蛋白；2).多次对上清液进行处理，调整pH4.5～6.0，逐渐加入乙醇至终浓度15％～20％，静置过夜后，离心保留沉淀；3)、上述沉淀加入0℃无热源水10倍量，0.5mol/L Na2HPO4和0.5mol/L醋酸调整pH4.5～5.0，搅拌3小时，静置过夜。
4)、上述溶解液用连续离心机离心，乙-3板过滤上清，0.5mol/L Na2HPO4和0.5mol/L醋酸调pH4.8～5.3，加入乙醇至15％～20％，搅拌1小时，静置过夜。
5)、离心分离杂蛋白后的上清液调至pH6.5～7.0，加入乙醇至22～26％，静置过夜得到免疫球蛋白悬浮液，离心沉淀得到免疫球蛋白；6).将步骤5)得到的免疫球蛋白在pH3.5～5.0进行后处理，并超滤、除菌、分装得到可静脉注射的蛋白含量为1～15％的免疫球蛋白。
上述犬静脉注射免疫球蛋白中，所述利凡诺结合低温乙醇法包含以下步骤1).将融化后血浆和血清调至pH8.0～9.0，加入2％(g/100ml)利凡诺，去除白蛋白沉淀，取上清液；2).将上清液用活性炭吸附后过滤，在0℃、pH6.5～7.0条件下，加入乙醇至22～26％，静置过夜得到免疫球蛋白悬浮液，离心沉淀得到免疫球蛋白；3).将步骤2)得到的免疫球蛋白在pH3.0～5.4进行后处理，并超滤、除菌、分装得到可静脉注射的蛋白含量为1～15％(g/100ml)的免疫球蛋白注射液。
上述犬静脉注射免疫球蛋白中，所述后处理为在pH3.0～5.4的免疫球蛋白溶液中加入保护剂，所述保护剂为5～15％(g/100ml)的麦芽糖、5～10％葡萄糖或3～10％葡萄糖的盐水中的一种或两种的组合。
本发明同时提供一种犬静脉注射免疫球蛋白的制备方法，包括如下步骤1).去除白蛋白将健康犬的血浆或血清在pH4.8～5.1时，加入乙醇至15～20％，去除杂蛋白；或用利凡诺法，将融化后血浆和血清调至pH8.0～9.0，加入2％利凡诺，去除白蛋白；2).提取免疫球蛋白将去除杂蛋白或白蛋白后的溶液在0℃、pH6.5～7.0条件下，加入乙醇至22～26％，静置过夜得到免疫球蛋白悬浮液，离心沉淀得到免疫球蛋白；3).制备免疫球蛋白注射液将步骤2)得到的免疫球蛋白在pH3.0～5.4进行后处理，并超滤、除菌、分装得到可静脉注射的蛋白含量为1～15％的免疫球蛋白注射液。
上述犬静脉注射免疫球蛋白的制备方法中，步骤3)的后处理为在pH3.0～5.4的免疫球蛋白溶液中加入保护剂，所述保护剂为5～15％的麦芽糖、5～10％葡萄糖或5～10％葡萄糖的盐水中的一种或两种的组合。
上述犬静脉注射免疫球蛋白的制备方法中，步骤1)中健康犬的血浆或血清取自多种犬病，包括细小病毒病、犬瘟热、犬传染性肝炎、狂犬病、和犬副流感的疫苗免疫大量健康犬后采集的混合血浆或血清。
本发明还提供犬静脉注射免疫球蛋白制剂，由来自健康犬的血浆或血清，经低温乙醇法或利凡诺结合低温乙醇法分离、制备得到的pH值在3.0～5.4，纯度不低于95％的可用于犬静脉注射的免疫球蛋白制备成蛋白含量为1～10％的免疫球蛋白注射液。
上述犬静脉注射免疫球蛋白制剂，还包括生物体可接受的保护剂，所述保护剂为5～15％的麦芽糖、5～10％葡萄糖或3～10％葡萄糖的盐水中的一种或两种的组合。
本发明提供的犬静脉注射免疫球蛋白，其保持有完整的天然生物分子结构，具有体内免疫球蛋白G(IgG)的全部生理活性，免疫球蛋白IgG，IgG亚类构成比与正常犬血浆相似。
本发明提供的犬静脉注射免疫球蛋白的制备方法，工艺简单，成本低，回收率高，制备的成品纯度好，纯度超过96％，且性能稳定。
本发明提供的犬静脉注射免疫球蛋白制剂，不含任何防腐剂，生物适应性好。
图1是本发明方法得到的免疫球蛋白分子量鉴定图。
具体实施例方式
为更清楚地公开，以下从几方面叙述本发明。
本发明提供的犬静脉注射免疫球蛋白(IVIG)，是将犬的血浆或血清，用现代生物技术分离提取，经病毒灭活并加入适量稳定剂制成的犬用静脉注射生物制剂。其中，血浆和血清可为多种犬病(如细小病毒病、犬瘟热、犬传染性肝炎、狂犬病、犬副流感等)的疫苗免疫大量健康犬后获得的混合血浆，此时，对犬的免疫、取血浆过程，与其它常规做法相同；病毒灭活的方法和步骤可以采用常规的方法；现代生物分离技术，在本发明中是指从血浆中分离提取免疫球蛋白的方法，可以为低温乙醇法或利凡诺结合低温乙醇法，提取时的总体要求为1、原料新鲜分离的液体血浆、血清、轻度溶血或脂肪血浆、去除其他血浆蛋白的组分等均可用于制备。
2、原料要求所用之血浆或血清，应尽可能保持无菌，否则应及时投料制造或低温冰冻保存。低温冰冻保存血浆最长保存期不应超过2年。
3、操作场所工作室应符合GMP工艺流程要求。冷库及各种生产用具必须专用，严禁与其他异种蛋白质混用。工作室的建筑应便于清洁、消毒、防霉。在制造过程中为防止制品污染热原质，应采取各种有效措施，如降低操作室温度，注意无菌操作等。各种直接接触制品的用具，用后应立即洗净，用前须经除热原质或灭菌处理。
4、制备用水及化学药品生产用水应符合饮用水标准，直接用于制品的水应符合注射用水标准。所用各种化学药品应符合《中国兽药典》、《中华人民共和国兽用生物制品质量标准》、《中国生物制品主要原材料试行标准》等规定，未纳入标准者应不低于化学纯。
在本发明技术方案和以下实施例中，如无特殊说明，所提及物质浓度如免疫球蛋白浓度、乙醇浓度和葡萄糖、麦芽糖、葡萄糖盐水浓度等均以％表示，意为g/100ml，即每100毫升溶液中所含溶质的重量克。
实施例一采用低温乙醇法提取犬静脉注射免疫球蛋白所述低温乙醇法包含以下步骤1).融浆及添加乙醇将符合原料要求的血浆20万毫升在37℃条件下快速融化，并在无菌环境下置入反应罐；在搅拌状态下逐渐降温至0℃，用pH为4.0的醋酸缓冲液调pH至7.2；边搅拌边加入预冷为-15℃--20℃的53.3％乙醇至乙醇体积终浓度为8％(加乙醇要缓慢，以10万毫升血浆计，每分钟加400-500ml，2-3小时加完)，温度维持在-2℃--3℃，加完后继续搅拌1小时，静置2小时。
2).去除杂蛋白使用连续离心机离心，离心机出液口温度-2℃～-3℃，上清液用pH为4.0的醋酸缓冲液调pH为5.8，用95％的低温乙醇缓慢加至终体积浓度为19％，温度保持在-5℃～-6℃，加完后搅拌2小时，-5℃静置过夜；第二次离心，保留沉淀。
上述沉淀加入0℃无热源水10倍量，0.5mol/L Na2HPO4和0.5mol/L醋酸调整pH4.8，搅拌3小时，静置过夜；溶解液用连续离心机离心，乙-3板过滤上清，0.5mol/L Na2HPO4和0.5mol/L醋酸调pH5.1，加入乙醇至17％，搅拌1小时，静置过夜。
3)、分离免疫球蛋白离心去除杂蛋白后的上清液，调整pH6.9，加入乙醇至25％，静置过夜得到免疫球蛋白悬浮液，离心沉淀得到免疫球蛋白。
4).超滤浓缩将步骤3)得到的免疫球蛋白在pH4.0进行后处理，并超滤浓缩得到可静脉注射的蛋白含量为1～15％的免疫球蛋白。
实施例二采用利凡诺结合低温乙醇法提取犬静脉注射免疫球蛋白1)融浆及调pH将符合原料要求的血浆20万毫升在37℃条件下快速融化，并在无菌环境下置入反应罐；在搅拌状态下缓慢加入浓度为1％的Na2CO3，调pH至8.5±0.1。
2).去除白蛋白取犬血浆加入反应罐，在搅拌状态下，向反应罐中加入与血浆等体积的2％利凡诺，加完后停止搅拌，静置2小时，取上清加入2％活性炭，搅拌30分钟，静置1小时，过乙-3板，收集滤液过夜。
3).沉淀免疫球蛋白将步骤2)的滤液降温至0℃，加入25％的NaCl溶液至终浓度1％、0.5mol/L乙酸缓冲液调pH至6.9，加入95％乙醇至终浓度25％，搅拌1小时，静置过夜后，溶液连续离心，沉淀即为犬免疫球蛋白。
4).超滤浓缩将步骤3)得到的免疫球蛋白在pH4.0进行后处理，并超滤浓缩得到可静脉注射的蛋白含量为1～15％的免疫球蛋白。
实施例三制备犬静脉注射免疫球蛋白制剂-麦芽糖注射液在实施例一或实施例二的基础上，继续下面步骤在实施例三步骤4)中，将溶液浓缩，加入麦芽糖至10％，然后除菌分装，得到蛋白含量为5％的添加麦芽糖保护剂的犬静脉注射免疫球蛋白注射液。
用同样的方法，改变麦芽糖的添加量，使得麦芽糖的含量在5％至10％之间的任意期望浓度变化，得到免疫球蛋白含量在1％至15％之间，麦芽糖浓度在5％至10％的犬静脉注射免疫球蛋白注射液。
实施例四制备犬静脉注射免疫球蛋白制剂-葡萄糖注射液和实施例三同样的方法，用葡萄糖代替麦芽糖作保护剂，得到免疫球蛋白含量在1％至15％之间，葡萄糖浓度在5％至10％的犬静脉注射免疫球蛋白注射液。
实施例五制备犬静脉注射免疫球蛋白制剂-葡萄糖盐水注射液和实施例三同样的方法，用葡萄糖盐水代替麦芽糖作保护剂，得到免疫球蛋白含量在1％至15％之间，葡萄糖盐水浓度在5％至10％的犬静脉注射免疫球蛋白注射液。
实施例六制备犬静脉注射免疫球蛋白制剂-麦芽糖葡萄糖注射液和实施例三同样的方法，合用麦芽糖和葡萄糖作保护剂，得到免疫球蛋白含量在1％至15％之间，麦芽糖浓度在5％至10％、葡萄糖浓度在5％至10％的犬静脉注射免疫球蛋白注射液。
实施例七制备犬静脉注射免疫球蛋白制剂-麦芽糖葡萄糖盐水注射液和实施例三同样的方法，合用麦芽糖和葡萄糖盐水作保护剂，得到免疫球蛋白含量在1％至15％之间，麦芽糖浓度在5％至10％、葡萄糖浓度在5％至10％盐水的犬静脉注射免疫球蛋白注射液。
对上述得到的IVIG进行性能测试1、放置试验液体制剂分装后，在20～35℃的条件下放置至少30天，逐瓶检查，外观为略有粘稠、黄色或绿色至棕色澄明液体，不含有任何异物，也无混浊和沉淀现象。
2、热稳定性试验取液体制剂检品，放入57±0.5℃水浴保温4小时后，无凝胶形成或絮状物出现。
3、化学检定按《中华人民共和国兽用生物制品质量标准》、《生物制品化学检定规程》等进行3.1pH值1％的免疫球蛋白注射液在20±2℃测定，其pH值为6.4～7.4；5％和10％的制品用生理盐水稀释成1％蛋白质浓度，在20±2℃测定，pH值为6.4～7.4。
3.2蛋白质含量及总量用钨酸沉淀法测定，蛋白质含量不低于标示量的95％，每瓶蛋白质总量不低于出品规格的标示量。
3.3纯度不同规格的制品，免疫球蛋白含量不低于蛋白质总量的95％。
3.4糖含量若制品中加糖(葡萄糖、麦芽糖等)，其含量应不高于50g/L。
3.5分子大小分布IgG单体及二聚体含量之和不低于90.0％。
4、鉴别试验采用免疫双扩散法。仅与抗犬的血清产生沉淀线，与抗人、抗马、抗牛的血清不产生沉淀线。
5、无菌试验按《中华人民共和国兽用生物制品质量标准》进行。
结果符合标准。
6、安全试验6.1豚鼠试验用体重300～400g健康豚鼠2只，每只腹腔注射检品5ml，注射后半小时内动物没有明显的异常反应，观察7天，动物均健存，每只体重增加者判为合格。如不符合上述要求，用4只豚鼠复试一次，判定标准同前。
结果符合标准。
6.2小白鼠试验用体重18～20g小白鼠5只，每只腹腔注射检品0.5ml，半小时内动物没有明显的异常反应，继续观察7天，动物均健存，每只体重增加者判为合格。如不符合上述要求，用10只小白鼠复试一次，判定标准同前。
结果符合标准。
7、热原质试验按《中华人民共和国兽用生物制品质量标准》、《生物制品化学检定规程》等进行。注射剂量按家兔体重注射0.6g/kg。
结果符合标准。
上述得到的犬静脉注射免疫球蛋白和犬静脉注射免疫球蛋白制剂，可应用在预防和治疗病毒性、细菌性感染，以及各种免疫缺乏症和免疫低下症等。
本发明提供的犬静脉注射免疫球蛋白和犬静脉注射免疫球蛋白制剂为无色澄明液体，其使用方法静脉输注。若需要大剂量输注时，可将数瓶制品连续输注(必须在4小时内使用)。必要时可用5％的葡萄糖注射液稀释本品后再进行静脉滴注。
输注剂量5公斤以下犬，5毫升/日，连用2~3日；5~10公斤犬，10毫升/日，连用2~3日；10公斤以上犬，10~20毫升/日，连用2~3日。病情严重时，可酌情加倍。
输注速度首次使用，开始30分钟内输注速度为0.02~0.03毫升/公斤体重/分钟，若未见不良反应，可增加到0.04~0.08毫升/公斤体重/分钟。
举例13公斤的犬，首注30分钟的速度为3～5滴/分钟；30分钟后速度为8～15滴/分钟。
举例210公斤的犬，首注速度为8～15滴；30分钟后速度为16～25滴/分钟。
保存及有效期保存于2～8℃暗处，谨防冻结；有效期3年。
权利要求
1.一种犬静脉注射免疫球蛋白，是由来自健康犬的血浆或血清，经低温乙醇法或利凡诺结合低温乙醇法分离、制备得到的pH值在3.0～5.4，纯度不低于95％的可用于犬静脉注射的免疫球蛋白。
2.如权利要求1所述的犬静脉注射免疫球蛋白，其特征在于所述血浆或血清来自多种犬病，包括细小病毒病、犬瘟热、犬传染性肝炎、狂犬病、和犬副流感的疫苗免疫大量健康犬后采集的混合血浆或血清。
3.如权利要求1或2所述的犬静脉注射免疫球蛋白，其特征在于所述低温乙醇法包含以下步骤1).将血浆或血清融化，逐渐降温至0℃，控制pH7.0～7.4，加入预冷乙醇至终浓度8％(g/100ml)，离心去除杂蛋白；2).多次对上清液进行处理，调整pH4.5～6.0，逐渐加入乙醇至终浓度15％～20％，静置过夜后，离心保留沉淀；3)、上述沉淀加入0℃无热源水10倍量，0.5mol/LNa2HPO4和0.5mol/L醋酸调整pH4.5～5.0，搅拌3小时，静置过夜。4)、上述溶解液用连续离心机离心，乙-3板过滤上清，0.5mol/L Na2HPO4和0.5mol/L醋酸调pH4.8～5.3，加入乙醇至15％～20％，搅拌1小时，静置过夜。5)、离心分离杂蛋白后的上清液调至pH6.5～7.0，加入乙醇至22～26％，静置过夜得到免疫球蛋白悬浮液，离心沉淀得到免疫球蛋白；6).将步骤5)得到的免疫球蛋白在pH3.5～5.0进行后处理，并超滤、除菌、分装得到可静脉注射的蛋白含量为1～15％的免疫球蛋白。
4.如权利要求1或2所述的犬静脉注射免疫球蛋白，其特征在于所述利凡诺结合低温乙醇法包含以下步骤1).将融化后血浆和血清调至pH8.0～9.0，加入2％(g/100ml)利凡诺，去除白蛋白沉淀，取上清液；2).将上清液用活性炭吸附后过滤，在0℃、pH6.5～7.0条件下，加入乙醇至22～26％，静置过夜得到免疫球蛋白悬浮液，离心沉淀得到免疫球蛋白；3).将步骤2)得到的免疫球蛋白在pH3.0～5.4进行后处理，并超滤、除菌、分装得到可静脉注射的蛋白含量为1～15％(g/100ml)的免疫球蛋白注射液。
5.如权利要求3或4所述的犬静脉注射免疫球蛋白，其特征在于所述15％(g/100ml)的麦芽糖、5～10％葡萄糖和3～10％葡萄糖盐水中的一种或两种的组合。
6.一种犬静脉注射免疫球蛋白的制备方法，包括如下步骤1).去除白蛋白将健康犬的血浆或血清在pH4.8～5.1时，加入乙醇至15～20％，去除杂蛋白；或用利凡诺法，将融化后血浆和血清调至pH 8.0～9.0，加入2％利凡诺，去除白蛋白；2).提取免疫球蛋白将去除杂蛋白或白蛋白后的溶液在0℃、pH6.5～7.0条件下，加入乙醇至22～26％，静置过夜得到免疫球蛋白悬浮液，离心沉淀得到免疫球蛋白；3).制备免疫球蛋白注射液将步骤2)得到的免疫球蛋白在pH3.0～5.4进行后处理，并超滤、除菌、分装得到可静脉注射的蛋白含量为1～15％的免疫球蛋白注射液。
7.如权利要求6所述的犬静脉注射免疫球蛋白的制备方法，其特征在于步骤3)的后处理为在pH3.0～5.4的免疫球蛋白溶液中加入保护剂，所述保护剂为5～15％的麦芽糖、5～10％葡萄糖和5～10％葡萄糖盐水中的一种或两种的组合。
8.如权利要求6或7所述的犬静脉注射免疫球蛋白的制备方法，其特征在于步骤1)中健康犬的血浆或血清取自多种犬病，包括细小病毒病、犬瘟热、犬传染性肝炎、狂犬病、和犬副流感的疫苗免疫大量健康犬后采集的混合血浆或血清。
9.犬静脉注射免疫球蛋白制剂，由来自健康犬的血浆或血清，经低温乙醇法或利凡诺结合低温乙醇法分离、制备得到的pH值在3.0～5.4，纯度不低于95％的可用于犬静脉注射的免疫球蛋白制备成免疫球蛋白含量为1～15％的免疫球蛋白注射液。
10.根据权利要求9所述的犬静脉注射免疫球蛋白制剂，其特征在于，还包括生物体可接受的保护剂，所述保护剂为5～15％的麦芽糖、5～10％葡萄糖或3～10％葡萄糖的盐水中的一种或两种的组合。
全文摘要
本发明涉及犬静脉注射免疫球蛋白、其制备方法及其制剂，是由来自健康犬的血浆或血清，经低温乙醇法或利凡诺结合低温乙醇法分离、制备得到的pH值在3.0～5.4，纯度不低于95％的可用于犬静脉注射的免疫球蛋白，以及用该免疫球蛋白配制成含5～15％麦芽糖、5～10％葡萄糖或3～10％葡萄糖盐水中的一种或两种保护剂，同时蛋白含量为1～15％的免疫球蛋白注射液。
文档编号A61P31/00GK1654072SQ20041003957
公开日2005年8月17日 申请日期2004年2月10日 优先权日2004年2月10日
发明者章金刚, 孙文种, 赵宝全, 王建国, 吕茂民, 熊景峰, 杨姝, 王晓菲 申请人:中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所