犬细小病毒特异性免疫球蛋白制剂及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及免疫球蛋白制剂，尤其涉及犬细小病毒特异性免疫球蛋白制剂，本发 明还涉及所述犬细小病毒特异性免疫球蛋白制剂的制备方法及其在制备预防或治疗犬细 小病毒病的药物或试剂中的用途，属于免疫球蛋白制剂的制备领域。
【背景技术】
[0002] 犬细小病毒病是由犬细小病毒（canine parvovirus，CPV)感染犬引起的一种急性 传染病，以剧烈的呕吐、出血性肠炎和白细胞显著减少以及心肌炎为主要特征，发病率高， 传染性强，死亡率高，是危害犬最为严重的传染病之一。目前，犬细小病毒疾病临床治疗药 物主要是抗病毒药物和注射干扰素，但是这些药物效果并不显著。
[0003] 免疫球蛋白是一类具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白，它普遍存在于 动物的血液、组织液及外分泌液中，其中血清和初乳中的含量最高。免疫球蛋白是机体免疫 系统的重要组成成分，在抗感染和免疫调节中发挥着重要的作物。经静脉注射吸收后，可迅 速提高受者血液中免疫球蛋白的含量，通过其特异性中和作用及免疫调理等功能，起到预 防和治疗各种病毒性、细菌性、真菌性、寄生虫性等疾病的作用。
[0004] 因此，开发一种针对犬细小病毒的高纯度、高浓度、高活性和高效价的特异性免疫 球蛋白制剂，是临床治疗和紧急预防犬细小病毒病的有效手段。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是提供一种犬细小病毒特异性免疫球蛋白制剂；
[0006] 本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种所述犬细小病毒特异性免疫球蛋 白制剂的制备方法，该方法所制备的犬细小病毒特异性免疫球蛋白制剂具有高纯度、高浓 度和高效价的特点；
[0007] 本发明所要解决的第三个技术问题是提供所述犬细小病毒特异性免疫球蛋白制 剂在制备预防或治疗犬细小病毒病的药物或试剂中的用途。
[0008] 为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：
[0009] 本发明首先公开了一种犬细小病毒特异性免疫球蛋白制剂，包括：犬细小病毒 特异性免疫球蛋白；其中，所述犬细小病毒特异性免疫球蛋白的含量> 30mg/ml，纯度 彡97%，内毒素含量< 16IU，针对犬细小病毒的中和抗体效价（TCID5Q/200 μ 1)达到I :400 以上。
[0010] 本发明所述犬细小病毒特异性免疫球蛋白制剂为pH 4.0左右的液态或冻干剂 型；其中，犬细小病毒特异性免疫球蛋白主要以IgG单体存在。本发明犬细小病毒特异性免 疫球蛋白制剂保存期长，2-8°C可保存2年以上。
[0011] 本发明所述犬细小病毒特异性免疫球蛋白制剂的使用方法，一般采用直接静脉推 注或静脉滴注；使用量较少时，可以直接静脉推注；使用量较大时，可采用5%葡萄糖注射 液或氯化钠注射液适当稀释后进行静脉滴注；主要用于各品种犬的细小病毒感染疾病的治 疗与紧急预防，有效增加患病犬机体免疫力和抗病力。
[0012] 当犬受到细小病毒感染时，尽快静脉输注本发明犬细小病毒特异性免疫球蛋白制 剂，可迅速使病犬血液中的犬细小病毒抗体从无或低浓度上升到有保护水平的浓度，迅速 中和和杀灭病犬体内的细小病毒，有效阻止细小病毒对机体的继续感染和侵害，起到迅速 治疗犬细小病毒病的作用。同时，免疫球蛋白自身又具有机体免疫调理作用，激活病犬体内 的免疫细胞吞噬和清除侵入的病原，迅速增强病犬免疫力和抵抗力。
[0013] 本发明进一步公开了一种所述犬细小病毒特异性免疫球蛋白制剂的制备方法，包 括以下步骤：（1)制备高免健康犬血浆或血清；（2)低温乙醇法提取步骤（1)制备的血浆或 血清中的犬细小病毒特异性免疫球蛋白；(3)纯化步骤（2)所提取的犬细小病毒特异性免 疫球蛋白；(4)将步骤（3)纯化后的犬细小病毒特异性免疫球蛋白进行超滤、浓缩、透析、过 滤除菌，分装，即得。
[0014] 其中，步骤（1)所述制备高免健康犬血浆或血清，包括以下步骤：选取健康犬，接 种犬细小病毒疫苗，2周后按照同样方法加强免疫；免疫后10-14天，采集抗体效价不低于 I :1280的犬血浆或血清。
[0015] 经中国农业部合法批准的多种犬细小病毒疫苗均适用于本发明，按照使用说明使 用即可。
[0016] 步骤（2)所述低温乙醇法包括：（a)将血浆或血清融化，降温至0°C，调整pH至 7. 5-7. 8 ;优选为使用pH为4. 0的醋酸缓冲液调整pH ;按照g/100ml计，加入预冷乙醇，优 选为预冷-15°C - -20°C的53. 3%乙醇至终浓度9-12%，离心，收集上清液；
[0017] (b)调整上清液的pH至3. 5-4. 4 ;按照g/100ml计，加入乙醇至终浓度15-25%， 静置过夜，离心，收集沉淀；
[0018] (c)向步骤（b)所得沉淀中加入10倍体积的0°C注射用水，用0· 5mol/L Na2HPO4 和0. 5mol/L醋酸调整pH至5. 1-5. 5,搅拌4-6小时，静置过夜，获得溶解液（I );
[0019] (d)将步骤（C)所获得的溶解液（I )用连续离心机离心，收集上清液，过滤，得滤 液；用〇· 5mol/L Na2HPO4和0· 5mol/L醋酸调整滤液的pH至4. 0-5. 5 ;然后，按照g/100ml 计，加入乙醇至终浓度20-25%，搅拌3-5小时，静置过夜，获得溶解液（II );
[0020] (e)将步骤（d)获得的溶解液（II )离心，得到上清液；将上清液调pH至5. 5-6. 4， 然后按照g/l〇〇ml计，加入乙醇至终浓度23-25%，静置过夜，离心，收集沉淀，即得。
[0021] 优选的，步骤（2)所述低温乙醇法包括：（a)将血浆或血清融化，降温至0°C，调整 pH至7. 5 ;按照g/100ml计，加入预冷乙醇（_15°C - -20°C的53. 3%乙醇）至终浓度10%， 离心，收集上清液；
[0022] (b)调整上清液的pH至4. 0 ;按照g/100ml计，加入乙醇至终浓度20%，静置过夜， 离心，收集沉淀；
[0023] (c)向步骤（b)所得沉淀中加入10倍体积的0°C注射用水，用0· 5mol/L Na2HPO4 和0. 5mol/L醋酸调整pH至5. 5,搅拌4小时，静置过夜，获得溶解液（I );
[0024] (d)将步骤（c)所获得的溶解液（I )用连续离心机离心，收集上清液，用0· 45um 滤板过滤，得滤液；用0. 5mol/L Na2HPOjP 0. 5mol/L醋酸调整滤液的pH至5. 0 ;然后，按照 g/100ml计，加入乙醇至终浓度20%，搅拌4小时，静置过夜，获得溶解液（II );
[0025] (e)将步骤（d)获得的溶解液（II )离心，得到上清液；将上清液调pH至6. 0,然 后按照g/lOOml计，加入乙醇至终浓度25%，静置过夜，离心，收集沉淀，即得。
[0026] 本发明对上述低温乙醇法中调整pH值所用的试剂没有特殊限定。
[0027] 为了能够获得纯度更高、蛋白含量更高、内毒素含量更低以及抗体活性更好的免 疫球蛋白，本发明对传统的低温乙醇法分离和提取血浆或血清中的免疫球蛋白的方法进 行了优化。结果表明，采用优化后的低温乙醇法所制备的犬细小病毒特异性免疫球蛋白制 剂的犬细小病毒特异性免疫球蛋白浓度为32mg/ml，蛋白质纯度为97%，内毒素含量小于 16IU;中和抗体效价的测定结果表明，采用优化后的低温乙醇法所制备的犬细小病毒特异 性免疫球蛋白TCID 5Q/200 μ 1 = 1/431，即I :431的犬细小病毒特异性免疫球蛋白可保护 50%细胞不产生病变。而调整低温乙醇法中的pH或乙醇终浓度，所制备的犬细小病毒特 异性免疫球蛋白的蛋白质浓度均低于20mg/ml，蛋白质纯度为90%左右，内毒素含量高于 32IU ;所制备的犬细小病毒特异性免疫球蛋白TCID5(l/200 μ I = 1 :286-325,抗犬细小病毒 的中和抗体效价明显降低。
[0028] 综上，采用优化后的低温乙醇法所制备的犬细小病毒特异性免疫球蛋白的浓度、 蛋白质纯度更高，内毒素含量明显降低；抗犬细小病毒的中和抗体效价显著提高。
[0029] 本发明所述犬细小病毒特异性免疫球蛋白制剂的制备方法，步骤（3)所述纯化 采用离子交换层析法；优选为，采用DEAE-Sepharose-FF凝胶柱。具体步骤包括：（1)用 0. 5mol/L NaOH溶液调蛋白液pH至6. 6 ; (2)用磷酸盐缓冲液平衡凝胶柱；（3)上样蛋白液， 待IgG蛋白峰刚出现收集穿透蛋白液；(4)上样完成后用磷酸盐缓冲液冲洗，待IgG峰下降 至最高峰的约2/3处，用醋酸盐缓冲液冲洗层析柱，收集