蛋白液。
[0030] 步骤（4)所述超滤、浓缩、透析包括以下步骤：收集纯化后的蛋白液，边搅拌边加 入0. 5mol/L盐酸液，调整pH至4. 0,用6倍体积的2-8°C注射用水透析，透析至乙醇含量低 于0· 025 % (每100mL含0· 025g酒精），蛋白液浓度3 %以上（每100mL含3g球蛋白），即 得。
[0031] 本发明所述犬细小病毒特异性免疫球蛋白制剂能够应用于制备预防或治疗犬细 小病毒病的药物或试剂。
[0032] 本发明犬细小病毒特异性免疫球蛋白制剂中还可以加入适宜的保护剂，例如麦芽 糖、葡萄糖等。本领域技术人员可以根据实际需要对保护剂的用量进行调整。
[0033] 临床应用结果表明，对临床上诊断为犬细小病毒感染的患病犬静脉输注本发明 优化后方法制备的犬细小病毒特异性免疫球蛋白制剂，并配合使用其他药物，治愈率高达 94%，而输注其他方法所制备的免疫球蛋白的治愈率最高仅为79%。
[0034] 本发明技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：
[0035] 本发明犬细小病毒特异性免疫球蛋白制剂中，犬细小病毒特异性免疫球蛋白含量 达到30mg/ml以上，蛋白质纯度达到97%以上，内毒素小于16IU，中和抗体效价不低于1 : 400 ;可应用于各品种犬感染细小病毒时的治疗与紧急预防，增加患病犬机体免疫力和抗病 力。优化后的犬细小病毒特异性免疫球蛋白制剂的制备方法，既保持了免疫球蛋白分子结 构的完整性和特有的生物活性，又提高了蛋白质纯度、免疫球蛋白含量和生物安全性。
[0036] 本发明所涉及到的术语宙义
[0037] 除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的 普通技术人员通常所了解相同的含义。
[0038] 术语"内毒素"是革兰氏阴性细菌细胞壁中的一种成分，叫做脂多糖。脂多糖对宿 主是有毒性的。内毒素只有当细菌死亡溶解或用人工方法破坏菌细胞后才释放出来，所以 叫做内毒素。其毒性成分主要为类脂质A。
[0039] 术语"中和抗体和中和抗体效价"，中和抗体是当病原微生物侵入动物机体时由体 内适应性免疫应答细胞分泌产生的一种能与抗原特异性结合且具有特殊抗病能力的蛋白 质，这种蛋白质实际就是免疫球蛋白。中和抗体是一种可溶性蛋白，存在于血液、淋巴和组 织液中，当病毒等病原微生物侵入体内后，免疫细胞把中和蛋白分泌到血液里，后者与血液 里的病毒等病原微生物颗粒结合，阻止病毒等病原微生物感染细胞，破坏病毒等病原微生 物颗粒，这样就把病毒等病原微生物"中和"掉了。中和抗体效价是用来评价中和抗体中 和病原微生物活性和能力的重要指标，一般采用细胞中和试验来测定中和抗体的效价，按 reed-muench法计算能够使50 %细胞孔获得保护的最高稀释度来确定中和抗体的效价。
【附图说明】
[0040] 图1为细胞病变结果；其中，A为不能完全中和病毒，产生CPE ;B为完全中和，无 CPE产生。
【具体实施方式】
[0041] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领 域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节 和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
[0042] 实施例1犬细小病毒特异性免疫球蛋白制剂的制备
[0043] 1、实验方法
[0044] I. 1高免健康犬血浆或血清的制备
[0045] (1)选取一定数量的健康肉用犬，接种符合《中国兽药典》质量标准要求的犬细小 病毒疫苗，按照使用说明进行操作，2周后同样方法加强免疫；
[0046] (2)免疫接种完成后10-14天，选取符合下列要求的犬血浆或血清为制造免疫球 蛋白用原料血浆或血清：利用血凝抑制试验（HI)测定抗体效价，抗体效价不低于I :1280 ;
[0047] (3)颈静脉采血，混合，低温保存。
[0048] 1. 2低温乙醇法提取犬细小病毒特异性免疫球蛋白
[0049] (1)将上述制备的血浆或血清融化，逐渐降温至0°C，用pH为4. 0的醋酸缓冲液 调整pH至7. 5,加入预冷乙醇（即预冷为-15°C - -20°C的53. 3%乙醇）至终浓度10% (g/100ml)，转数14000r/min离心去除杂蛋白，得上清液；
[0050] (2)对上清液进行处理，调整pH至4. 0,逐渐加入乙醇至终浓度20% (g/100ml)， 静置过夜后，离心保留沉淀；
[0051] (3)上述沉淀加入10倍体积的(TC注射用水，用0· 5mol/L Na2HPOjP 0· 5mol/L醋 酸调整pH至5. 5,搅拌4小时，静置过夜，得溶解液；
[0052] (4)上述溶解液用连续离心机离心，用0· 45um滤板过滤上清，用0· 5mol/L Na2HPO4 和0. 5mol/L醋酸调整pH至5. 0,加入乙醇至终浓度20% (g/100ml)，搅拌4小时，静置过 夜；
[0053] (5)离心分离杂蛋白后的上清液调pH至6· 0,加入乙醇至终浓度25% (g/100ml)， 静置过夜得到免疫球蛋白悬浮液，离心，沉淀即为免疫球蛋白。
[0054] I. 3DEAE-Sepharose_FF凝胶柱层析纯化免疫球蛋白
[0055] (1)用0· 5mol/L NaOH溶液调上述蛋白液pH至6. 6 ;
[0056] (2)用磷酸盐缓冲液平衡凝胶柱；
[0057] (3)上样蛋白液，待IgG蛋白峰刚出现收集穿透蛋白液；
[0058] (4)上样完成后用磷酸盐缓冲液冲洗，待IgG峰下降至最高峰的约2/3处，用醋酸 盐缓冲液冲洗层析柱，收集蛋白液。
[0059] 1. 4超滤浓缩透析免疫球蛋白
[0060] 超滤浓缩透析包括以下步骤：将收集的层析后蛋白液，边搅拌边缓慢加入 0. 5mol/L盐酸液，调节pH至4. 0,用6倍体积的2-8°C注射用水透析，透析至乙醇含量低于 0.025% (每100mL含0.025g酒精），蛋白液浓度3% (每100mL含3g球蛋白）以上，分装 或冻干保存。
[0061] 1. 5犬细小病毒特异性免疫球蛋白的蛋白质浓度、纯度、内毒素含量测定
[0062] 按照《中国兽药典》、《中国药典》规定的方法测定所制备的犬细小病毒特异性免疫 球蛋白的蛋白质浓度、纯度、内毒素含量。
[0063] 2、实验结果
[0064] 所制备的犬细小病毒特异性免疫球蛋白的蛋白质浓度为32mg/ml，蛋白质纯度为 97%，内毒素含量小于16IU，pH为4.0。
[0065] 实施例2犬细小病毒特异性免疫球蛋白制剂的制备
[0066] 1、实验方法
[0067] 犬细小病毒特异性免疫球蛋白制剂的制备方法同实施例1，区别在于，低温乙醇法 提取犬细小病毒特异性免疫球蛋白的具体操作如下：
[0068] (1)将制备的血浆或血清融化，逐渐降温至(TC，调整pH至7. 8,加入预冷乙醇（即 预冷为-15°C - -20°C的53. 3%乙醇）至终浓度12% (g/100ml)，转数14000r/min离心去 除杂蛋白，得上清液；
[0069] (2)对上清液进行处理，调整pH至4. 4,逐渐加入乙醇至终浓度25% (g/100ml)， 静置过夜后，离心保留沉淀；
[0070] (3)上述沉淀加入10倍体积的0°C注射用水，用0· 5mol/L Na2HPO4和0· 5mol/L醋 酸调整pH至5. 5,搅拌6小时，静置过夜，得溶解液；
[0071] (4)上述溶解液用连续离心机离心，用0· 45um滤板过滤上清，用0· 5mol/L Na2HPO4 和0. 5mol/L醋酸调整pH至5. 5,加入乙醇至终浓度25% (g/100ml)，搅拌5小时，静置过 夜；
[0072] (5)离心分离杂蛋白后的上清液调pH至6. 4,加入乙醇至终浓度25% (g/100ml)， 静置过夜得到免疫球蛋白悬浮液，离心，沉淀即为免疫球蛋白。
[0073] 2、实验结果
[0074] 所制备的犬细小病毒特异性免疫球蛋白的蛋白质浓度为19mg/ml，蛋白质纯度为 92%，内毒素含量为64IU，pH为4. 5。
[0075] 实施例3犬细小病毒特异性免疫球蛋白制剂的制备
[0076] 1、实验方法
[0077] 犬细小病毒特异性免疫球蛋白制剂的制备方法同实施例1，区别在于，低温乙醇法 提取犬细小病毒特异性免疫球蛋白的具体操作如下：
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