Tgev、pedv二联活疫苗及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于兽用生物制品领域，具体涉及猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病 毒二联活疫苗及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 猪传染性胃肠炎（porcine transmissible gastroenteritis, TGE)是引起猪腹 泻的一种重要接触性病毒性肠道传染病，发病快，对2周龄以内仔猪有高度致死率，几乎能 达到100%。5周龄以上的猪病死率较低，但是由于腹泻的影响，生长慢，饲料报酬低，造成严 重的经济损失。该病1946年由Doyle等人确定了病原。从60年代末起，我国许多省市有 该病流行。
[0003] 猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhoea, PED)是引起猪腹泻的一种高度急 性、接触性病毒性肠道传染病，以水样腹泻、呕吐、脱水和食欲下降为特征。该病最早于上世 纪70年代发生在英国和比利时，1973年先后在我国上海、辽宁、吉林等地分离到PEDV。PEDV 可在猪群中持续存在，各种年龄猪均易感。哺乳仔猪、架子猪和育肥猪的发病率可达100%， 尤以哺乳仔猪严重，病死率达100%。目前，还没有特效药物抵抗猪流行性腹泻病毒，由于该 病发病急，流行快，猪群一旦感染，就会给养殖户带来巨大的经济损失。
[0004] 猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒均属冠状病毒科成员，二者引起的临床 症状疾病的流行特点均及其相似，但是却没有免疫学和血清学相互交叉反应。猪群可单一 或混合感染这两种病毒。为防控猪传染性胃肠炎和猪流行性腹泻，国内外专家做了很多研 究，但目前仍无特效药物。
[0005] 免疫接种是防制该病的重要手段，国内外有使用疫苗的报道，但是效果不尽人意。 尤其近几年，原来的疫苗对猪腹泻病的保护越来越差，临床上不断出现腹泻病例，这除了加 强饲养管理外，尽快研制出一种能够有效防制猪传染性胃肠炎和猪流行性腹泻的疫苗已成 当务之急。
【发明内容】
[0006] 为了解决上述问题，本发明提供由本发明人自行分离、致弱、保存的一株猪传染性 胃肠炎病毒弱毒HB08株和一株猪流行性腹泻病毒弱毒ZJ08株，利用两毒株制备一种猪传 染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联活疫苗，用于防制目前流行的猪传染性胃肠炎和猪流行性 腹泻两种疾病。
[0007] 本发明所要解决的技术问题是通过以下技术途径来实现的： 猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒二联活疫苗，其含有猪传染性胃肠炎病毒弱 毒株HB08株和猪流行性腹泻病毒弱毒株ZJ08株，所述的猪传染性胃肠炎病毒HB08株的保 藏号为CGMCC No. 7807,病毒含量为IO6 5~108_°TCID5(l/ml，所述的猪流行性腹泻病毒ZJ08株 的保藏号为CGMCC No. 7806,病毒含量为Kf5~10L5TCID5Q/ml。
[0008] 在本发明的实施方案中，所述二联活疫苗还含有冻干保护剂。
[0009] 其中，所述的冻干保护剂优选为蔗糖明胶保护剂，其中明胶浓度2%~6%，蔗糖浓度 10%~35%。
[0010] 从河北省某猪场送检猪传染性胃肠炎抗原阳性的病料中分离到TGEV。将分离到的 猪传染性胃肠炎病毒在ST细胞上连续传代，从第125代开始0RF3基因连同前面的间隔区 序列出现81个核苷酸的缺失，至165代稳定缺失81个核苷酸。从第125代开始，TGEV对 仔猪失去致病性；将TGEV 145代种毒在猪体连传5代，毒力依然很稳定，没有任何返强现象 将125~165代致弱毒株种毒命名为猪传染性胃肠炎病毒HB08株，并于2013年06月28 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路 1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为：CGMCC No. 7807。
[0011] 从浙江某猪场送检猪流行性腹泻抗原阳性的病料中分离到PEDV。将分离到的猪流 行性腹泻病毒在Vero E6细胞上连续传代，从第105代开始0RF3基因突然出现49个核苷 酸的缺失，至第145代均保持稳定缺失49个核苷酸序列。从第105代开始，PEDV对仔猪失 去致病性；将PEDV 125代种毒在猪体连传5代，毒力依然很稳定，没有任何返强现象 将105~145代致弱毒株种毒命名为猪流行性腹泻病毒ZJ08株，并于2013年06月28 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路 1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为：CGMCC No. 7806。
[0012] 本发明还提供所述二联活疫苗的制备方法，包括如下步骤： 1) 、分别制备猪传染性胃肠炎病毒TGEV HB08株和猪流行性腹泻病毒PEDV ZJ08株病 毒液； 2) 、将制备的TGEV和PEDV病毒液按照1:1~1:2的比例混匀后按7:1的比例加入冻干 保护剂，进行冷冻真空干燥，即得。
[0013] 其中，将猪传染性胃肠炎病毒TGEV HB08株和猪流行性腹泻病毒PEDV ZJ08株分 别以0. 5%~5%的接毒量接毒到生长良好的单层培养细胞ST和Vero E6细胞上，35°C~37°C 吸附0. 5~1. 5小时后，补足细胞生长维持液，继续培养，当CPE达到80%~90%时收毒，获得猪 传染性胃肠炎病毒TGEV HB08株和猪流行性腹泻病毒PEDV ZJ08株的病毒液。
[0014] 本发明还提供所述的二联活疫苗在制备治疗猪传染性胃肠炎病毒和/或猪流行 性腹泻病毒感染引起的疾病的药物中的应用。
[0015] 将本发明制备的二联活疫苗经肌肉注射3~5日龄TGEV、PEDV中和抗体均小于 1:8的母猪所产仔猪5头，每头10头份，连续观察14日，仔猪均无不良反应。
[0016] 将本发明制备的二联活疫苗免疫TGEV、PEDV中和抗体均小于1:8的母猪所产的 3~5日龄仔猪10头，各肌肉注射疫苗1头份(病毒含量10 5_°TCID5(l/ml)，接种14日后，将 10头仔猪分成2组，每组5头，其中一组免疫仔猪，连同条件相同的对照仔猪5头，分别口服 lOOOXMID/ml的猪传染性胃肠炎病毒pi株Iml ;另一组免疫仔猪，连同条件相同的对照仔 猪5头，分别口服1000 X MID/ml的猪流行性腹泻病毒p55株lml，均观察7日。结果二联苗 接种猪均100%获得保护，而对照组则100%发病死亡。
[0017] 将本发明制备的二联活疫苗与市售商品苗进行对比试验，结果经本发明免疫的仔 猪对强毒攻击的保护率比市售商品苗的保护率高20个百分点。
【附图说明】
[0018] 图 I TGEV CPE 图片（400X )。
[0019] 图2 TGEV分离毒S基因PCR检测结果。图中，M :DNA Marker DL2000 ;1 :样品； 2 :阴性对照。
[0020] 图 3 TGEV 分离毒 0RF3 基因 PCR 扩结果。图中，M :DNA Marker DL2000 ;1 :样品； 2 :阴性对照。
[0021] 图4不同代次TGEV 0RF3序列比对。
[0022] 图 5 PEDV CPE 图片（400X )。
[0023] 图6 PEDV分离毒S基因 PCR检测结果。图中，1:样品；2:阴性对照；M: DNA Marker DL2000。
[0024] 图7 PEDV分离毒0RF3基因 PCR扩结果。图中，1:样品；2:阴性对照；M: DNA Marker DL2000。
[0025] 图8不同代次PEDV (ZJ08株）0RF3序列比对。
【具体实施方式】
[0026] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0027] 实施例1弱毒株来源 一、猪传染性胃肠炎病毒弱毒HB08株 取河北某猪场猪传染性胃肠炎抗原阳性病料，按照1:5的比例(重量：体积)加入PBS， 反复冻融3次，离心取上清，0. 22 μ m滤膜过滤，滤液中加入终浓度为20 μ g/ml的胰酶，37°C 处理1. 5小时。
[0028] 按常规方法接种长满单层的ST细胞，同时设置空白细胞作为对照。传至第17代时 出现明显、稳定的CPE变化（图1)。根据S基因设计检测引物对：S-F: 5 ' -TATTTGTGGTYTTGG TYGTAATGC-3' ；S-R: 5' -GGCTGTTTGGTAACTAATTTRCCA-3'，以 95°C 45S、50°C 45S、72°C Imin 进行32个循环后，72°C延伸5min。扩增S基因片段为886bp，结果见图2。
[0029] 扩增0RF3序列的引物为： 0RF3-F:AATTGAAAAAGTGCACGTCC-3 ' 0RF3-R:CAACAGGAACCAGAAAAATGA-3， 扩增的片段的大小为1202bp (图3) 将分离到的猪传染性胃肠炎病毒在ST细胞上连续传代120代，并在此过程进行了克隆 纯化，然后继续在ST细胞上传代至165代。将第165代病毒进行RT-PCR检测，扩增S基因 片段为886bp。
[0030] TGEV 0RF3基因序列在第20代、40代、70代、100代处于比较稳定的的状态，有个 别碱基的变化，但没有改变氨基酸；而第125代开始0RF3基因连同前面的间隔区序列出现 81个核苷酸的缺失(起始密码子前30个核苷酸、后51个核苷酸连续81个核苷酸缺失)，第 125代、145代、165代稳定缺失81个核苷酸(序列如SEQ ID No. 5所示)。结果如图4。
[0031] 按现行《中国兽药典》附录对第125~165代病毒进行无菌、支原体及外源病毒检 验，结果无细菌，霉菌，支原体及外源病毒污染。
[0032] 将分离到的TGEV 125-165代TGEV致弱株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员 会普通微生物中心；保藏地址是：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，保藏编 号是CGMCC No. 7807,保藏时间是2013年6月28日。
[0033] 二、猪流行性腹泻病毒弱毒ZJ08株 取浙江某猪场猪流行性腹泻抗原阳性病料，按照1:5的比例（重量：体积)加入PBS，反 复冻融3次，离心取上清，0. 22 μ m滤膜过滤，滤液中加入终浓度为20 μ g/ml的胰酶，37°C处 理1. 5小时。
[0034] 按常规方法接种长满单层的Vero E6细胞，同时设置空白细胞作为对照。传至 第24代时出现明显、稳定的CPE变化（图5)。根据S基因设计检测引物对：正向引物为 5' -GGATACTTTGGCCTCTTGTG-3' ；反向引物为 5' -CGCACTCGGATTACTCACAGC -3'，95°C预变 性 5min，95°C 45s、50°C lmin、72°C 2min 进行 32 个循环后，72°C5min 延伸。PEDV 扩增片 段为484bp。结果见图6。
[0035] 扩增0RF3序列的引物为： 0RF3-F: TCCTAGACTTCAACCTTACG 0RF3-R: GGTGACAAGTGAAGCACAGA 扩增的0RF3的片段的大小为：833 bp (图7)。
[0036] 将分离到的猪流行性腹泻病毒在Vero E6细胞上连续传代100代，并在此过程进 行了克隆纯化，然后继续在ST细胞上传代至145代。将第145代病毒进行RT-PCR检测，扩 增S基因片段为484bp。
[0037] PEDV ZJ08株0RF3基因序列在第105代开始0RF3基因突然出现49个核苷酸的缺 失，至第145代均保持稳定缺失49个核苷酸序列，如SEQ ID No. 10所示。结果如图8。
[0038] 按现行《中国兽药典》附录对第105~145代病毒进行无菌、支原体及外源病毒检 验，结果无细菌，霉菌，支原体及外源病毒污染。
[0039] 将分离致弱的105~145代致弱株种毒命名为PEDV ZJ08株