蜂毒肽在制备抑制乳腺癌细胞侵润转移药物中的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种蜂毒肽在制备抑制乳腺癌细胞侵润转移药物中的应用。
【背景技术】
[0002]乳腺癌是全世界范围内最常见的女性致死性肿瘤疾病，美国2012年乳腺癌新发病例约为22.7万，有3.95万人死亡，占女性癌症死亡人数的17.4%。近年来，我国乳腺癌发病率的增长速度高于其他国家，中国人口协会发布的《中国乳腺疾病调查报告》显示，乳腺癌发病率位居大城市女性肿瘤的第一位，占5.387/万人。己经成为威胁我国女性健康的重大疾病。
[0003]癌细胞转移是导致乳腺癌病人死亡主要原因，一旦发生转移治愈率就会大幅下降。乳腺癌转移病人的五年生存率持低于25%，晚期乳腺癌患者的平均生存时间只有18?30个月。临床上没有针对乳腺癌转移的有效药物，已有的手术和化疗及放疗手段影响患者生活质量并只能起到有限的作用。
[0004]目前,乳腺癌治疗方法。1.手术切除是乳腺癌治疗最主要的手段。1894年Halsted创建了乳腺癌根治术，使乳腺癌的5年存活率由过去的10?20%提高到40?50%，被誉为乳腺癌外科治疗的里程碑。但是，这种手术方式切除范围大，术后患者的肢体功能受到了极大的损伤。同时，虽然提高了患者的生存率，但是使患者的生活质量严重下降，并在患者心理上产生负面影响。2.1990年，国际癌症协会虽然对早期发现和诊断的乳腺癌建议保留乳房治疗。但是，保乳手术条件相对苛刻:①肿瘤直径小于3cm;②肿瘤位于乳房外周；③腋窝淋巴结无转移乳房有足够大体积等。对达不到预期美容效果的患者则相对禁忌。
3.乳腺癌放射治疗一般分为保留乳房术后的放射治疗、前哨淋巴结活检后的区域淋巴结照射、乳腺切除术后的放射治疗等。4.对于雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)和人表皮生长因子受体-2(HER_2)阳性开展内分泌治疗，也可以不同程度抑制乳腺癌细胞的生长，抑制浸润和转移有效率达到50%左右，而ER阴性则预后不佳。乳腺癌内分泌治疗的有效率仅为5%。很少能达到完美的治疗效果。对受体状况不明的乳腺癌患者，不可采用内分泌治疗。
[0005]文献报道，⑶147分子与乳腺癌细胞MCF-7的侵袭和转移相关，抑制⑶147分子可以减低MCF-7细胞的侵袭和转移能力。CD147是一个跨膜糖蛋白家族，高表达于上皮来源的肿瘤细胞表面，如肺癌，肝癌，乳腺癌等。CD147通过诱导MMP9的分泌促进了肿瘤的浸润和转移。MMP9能降解多种细胞外基质成分，包括层粘蛋白、纤粘蛋白、胶原和基底膜糖蛋白，是使癌细胞破坏间质机械屏障，得以向癌周组织浸润和转移最为重要的一类蛋白水解酶。
[0006]我们寻找一种抑制⑶147表达，阻碍或者降低MMP9的分泌，从而抑制癌细胞向癌周组织浸润和转移的物质。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是提供一种蜂毒肽应用于制备抑制乳腺癌细胞侵润和转移的药物。
[0008]实验结果显示⑶147和MMP9对于乳腺癌细胞MCF-7侵润和转移具有十分重要的作用。蜂毒肽能阻碍或者抑制其表达和分泌，从而抑制癌细胞向癌周组织浸润和转移。首先在实验室培养乳腺癌细胞MCF-7 ;试用三种不同浓度的蜂毒肽(购于美国Sigma公司)均可抑制⑶147表达和MMP9分泌，应用流式细胞术、ELISA和RT-PCR实验，证实蜂毒肽处理后MCF-7细胞抑制⑶147蛋白表达和MMP9分泌；应用Transwell侵袭小室实验，检测蜂毒肽抑制MCF-7细胞的迁移率。
[0009]有益效果:在癌症的治疗中，癌细胞的侵润和转移是影响治疗效果的一个难点，蜂毒肽能够抑制⑶147表达和MMP9分泌，阻碍MCF-7细胞的转移，可以开发为一种新的抑制癌细胞侵润转移的药物。
【附图说明】
[0010]图1为经蜂毒肽处理后，流式细胞术检测MCF-7细胞中⑶147蛋白水平。
[0011]图2为经蜂毒肽处理后，RT-PCR检测MCF-7细胞中⑶147mRNA表达水平。
[0012]图3为蜂毒肽处理的MCF-7细胞MMP_9mRNA表达水平。
[0013]图4为蜂毒肽处理的MCF-7细胞MMP-9蛋白水平。
[0014]图5为未经蜂毒肽处理细胞MCF-7细胞，Transwell侵袭小室实验检测MCF-7细胞的迁移率。
[0015]图6为0.5ug/ml蜂毒肽处理细胞MCF-7细胞，Transwell侵袭小室实验检测MCF-7细胞的迁移率。
[0016]图7为1.5ug/ml蜂毒肽处理细胞MCF-7细胞，Transwell侵袭小室实验检测MCF-7细胞的迁移率。
[0017]图8为2.5ug/ml蜂毒肽处理细胞MCF-7细胞，Transwell侵袭小室实验检测MCF-7细胞的迁移率。
【具体实施方式】
[0018]LMCF-7细胞培养
[0019]从一 80°C冰箱中取出冻存的MCF-7细胞，迅速转移到37°C水浴锅中使细胞速溶，800r离心5分钟，弃上清。用Iml完全培养基将冻存管中的细胞悬起，800r离心5分钟，弃上清。再用Iml完全培养基将细胞悬起，用枪吸至10厘米细胞培养板，加入7ml完全培养基，混匀细胞，放在37°C、5% CO2恒温培养箱中，培养至细胞长满细胞培养板。
[0020]2.流式细胞术检测⑶147蛋白
[0021]胰酶消化细胞后加入Staining medium终止消化，4°C 300g离心5分钟，使用IE标记的抗人0)147抗体进行标记,冰浴30分钟。加入Iml冰冷的Staining medium吹洗，4°C 300g离心5分钟,重复3次。弃去上清液,加入Staining medium重悬,保持细胞终浓度为I X 106个/ml。使用流式细胞仪检测分析荧光强度。
[0022]3.RT-PCR 检测 CD147 和 MMP_9mRNA
[0023]使用Trizol提取细胞中总RNA，通过测量260nm和280nm处OD值检测所提取RNA量以及纯度。根据Takara公司提供的RT-PCR试剂盒说明进行反转录和扩增实验，引物序列如下:CD147上游引物为5’ -TCGCGCTGCTGGGCACC-3，，CD 147下游引物为 5’ -TGGCGCTGTCATTCAAGGA-3’ ；MMP-9 上游引物为:5’ -CACTGTCCACCCCTCAGAGC-3’，MMP-9 下游引物为 5’ -GCCACTTGTCGGCGATAAGG-3’ ；GADPH 上游引物为5，-TCGGAGTCAACGGATTTGGTCGTA-3，，GADPH 下游引物为 5 ’ -TGGCATGGACTGTGGTCATGAGTC-3，。选用退火温度为60°C。使用1.5%琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物量。
[0024]4.ELISA 检测 MMP-9 蛋白
[0025]使用人MMP-9ELISA试剂盒，检测乳腺癌细胞MCF-7中MMP-9表达。收集细胞培养上清液，向包被待测抗体的微孔中一次性加入样本、标准品、辣根过氧化物酶标记的检测抗体，37°C温浴I小时，彻底洗涤之后用TMB显色，颜色深浅和样品中蛋白量呈正相关。最后在酶标仪上450nm处检测OD值。根据标准品浓度梯度曲线计算样品浓度。
[0026]5.Transwell侵袭实验检测细胞转移率
[0027]使用铺有基质胶带有8.0 μ m直径小孔的Transwell小室，检测乳腺癌细胞MCF-7侵袭。将MCF-7细胞用含不同浓度蜂毒肽的无血清培养基重悬，以2X 15个/ml接种于底部铺有基质胶的Transwell上室，24孔板下室中加入600 μ I含10%胎牛血清的培养基，置于37°C、5% CO2培养箱中培养24小时。用棉球擦除上室未发生侵袭的细胞，10%甲醇溶液固定聚碳酸酯膜下部细胞30秒，再用0.1%结晶紫室温染色20分钟。倒置显微镜下拍照。
[0028]6.结果分析
[0029](I)蜂毒肽抑制CD147
[0030]CypA是⑶147内源性诱导物，流式细胞术实验方法检测蜂毒肽对CypA诱导⑶147表达的影响。a为阴性对照组；b为CypA刺激组；c至e CypA刺激加不同浓度蜂毒肽处理组。其中，2.5 μ g/ml蜂毒肽对⑶147的抑制作用最显著，(图1)。流式细胞术检测到蜂毒肽对乳腺癌细胞MCF-7CD147表达有抑制作用。并具有浓度依赖性。RT-PCR检测结果与流式细胞术的检测结果相同(图2)，蜂毒肽抑制⑶147表达作用显著。
[0031](2)蜂毒肽抑制MMP-9
[0032]RT-PCR和ELISA实验检测蜂毒肽对CypA诱导MCF-7细胞中MMP-9表达的影响。RT-PCR结果显示，蜂毒肽对MCF-7细胞MMP-9表达有明显抑制作用，并具有浓度依赖性，
2.5 μ g/ml蜂毒肽对MMP-9表达的抑制作用最显著(图3)。ELISA结果显示，蜂毒肽对MCF-7细胞MMP-9蛋白分泌液有明显抑制作用，同样2.5 μ g/ml蜂毒肽对MMP-9蛋白分泌的抑制作用效果最显著(图4)。蜂毒肽对MMP-9表达和分泌有抑制作用。
[0033](3)蜂毒肽抑制MCF-7细胞侵润转移
[0034]在Transwell实验中，分别用0.5、1.5和2.5 μ g/ml蜂毒肽处理MCF-7细胞24小时，结果表明，对照组的细胞着色最深(图5)。蜂毒肽处理组，随蜂毒肽浓度升高着色程度逐渐下降(如图6、7、8)。表示不同浓度蜂毒肽使侵入基质胶进入膜下层的细胞数量明显减少，2.5 μ g/ml浓度蜂毒肽抑制作用最强。可见蜂毒肽能够阻碍乳腺癌细胞MCF-7侵袭，并且具有浓度依赖性。
[0035]综上，可以看出蜂毒肽抑制MCF-7细胞迁移是通过抑制⑶147和MMP-9转录和蛋白产生多个环节实现的，蜂毒肽对乳腺癌细胞MCF-7侵润和转移的抑制作用显著。
【主权项】
1.蜂毒肽在制备抑制乳腺癌细胞侵润转移药物中的应用，其特征是蜂毒肽可阻断⑶147和MMP9表达，从而抑制MCF-7细胞的浸润和转移。
【专利摘要】本发明属于生物工程技术领域，具体涉及蜂毒肽在制备抑制乳腺癌细胞侵润转移药物中的应用。CD147和MMP9蛋白对于乳腺癌MCF-7细胞侵袭和转移具有十分重要的作用。寻找一种CD147表达抑制物，能阻碍或者降低MMP9的分泌，抑制癌细胞向癌周组织浸润转移。首先培养MCF-7细胞，然后试用不同剂量蜂毒肽，利用流式细胞术、ELISA和RT-PCR实验，证实蜂毒肽处理后MCF-7细胞抑制CD147和MMP9表达；再应用Transwell侵袭小室实验检测蜂毒肽处理后MCF-7细胞的迁移率。蜂毒肽可抑制MCF-7细胞的浸润转移。因此，利用蜂毒肽开发为一种抗乳腺癌新药。
【IPC分类】A61P35-04, A61K38-17
【公开号】CN104784677
【申请号】CN201410201286
【发明人】霍洪亮, 王建军, 彭雪微, 李凤玉
【申请人】东北师范大学
【公开日】2015年7月22日
【申请日】2014年5月13日