亚非马蜂蜂毒溶血肽前体基因及其编码的多肽和制备方法

专利名称：亚非马蜂蜂毒溶血肽前体基因及其编码的多肽和制备方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，尤其涉及亚非马蜂蜂毒溶血肽前体(Prepromelittin)基因及其编码的多肽和制备方法。
背景技术：
意大利蜜蜂(Apis mellifera)蜂毒溶血肽(Melittin)是意大利蜜蜂蜂毒的基本组成成分，约占蜂毒的40％～50％(Vol.3.New YorkAcademic，1971，535)，按来源和生化性质，它是一种活性多肽，其中90％的溶血肽以游离状态存在，而另外的10％则以Melittin N1-甲酰化形式存在(Biochem.Biophys.Res.Commun.，1967，27275-280)。它具有非常重要的生物学活性，能引起红细胞溶解(Z.Physiol.Chem.，1970，351，884)、脂质体释放标记离子(marker ions)(J.Biol.Chem.，1969，244，3575)以及肥大细胞释放组胺(J.Pharmacol，1965，25，29)等等。Melittin合成时有两种前体存在。一种是Promelittin，在蜜蜂毒腺或注入蜂王毒腺提取物的蛙卵中发现。在蛙卵中合成时，Promelittin是稳定的终产物，而在毒腺中，它将缓慢地转变为Melittin；第二种称为Prepromelittin，分子量比Promelittin大，只能在无细胞体系中转录的Melittin mRNA上发现(Proc.Natl.Acad.Sct.USA，1978，75，701-704)。
1983年，Vlasak等利用意大利蜜蜂蜂王毒腺总RNA反转录成cDNA，然后将合成的双链cDNA克隆到pBR322载体中，构建cDNA文库，用探针筛选出带有大于200bp插入片段的阳性克隆，然后再将它们亚克隆到PUC8载体中，再经酶切鉴定从中筛选出2个阳性克隆，对其中含有最大插入片段的PUM13/4进行测序，结果显示该插入序列为Prepromelittin的核苷酸序列，该cDNA所编码的成熟肽--蜂毒溶血肽前体蛋白为49个氨基酸残基(Eur.J.Biochem.，1983，135123-126)。Prepromelittin蛋白实质上是蜂毒溶血肽的天然融合蛋白，它在蜜蜂毒腺细胞中合成后经二肽蛋白酶水解成蜂毒Melittin。

发明内容
本发明目的之一是提供一种亚非马蜂蜂毒Prepromelittin的多核苷酸，该多核苷酸编码意大利蜜蜂蜂毒Prepromelittin蛋白的一个同系物。本发明目的之二是提供一种由亚非马蜂蜂毒Prepromelittin多核苷酸编码的最终产物--亚非马蜂蜂毒Melittin蛋白。
本发明目的还提供了这种制备亚非马蜂蜂毒Prepromelittin核苷酸探针、含亚非马蜂蜂毒Prepromelittin核苷酸和Prepromelittin基因末端的130-213核苷酸序列(即Melittin这一部分的核苷酸序列)的重组载体、含重组载体的宿主细胞，以及多肽抗体的方法。
在本发明，提供了一种分离出的DNA分子，它包括编码具有亚非马蜂蜂毒Prepromelittin蛋白的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID No.5中从核苷酸1-213位的核苷酸序列有至少70％同源性，或者所述的核苷酸序列能在中度严格条件下与SEQ ID No.5中从核苷酸1-213位的核苷酸杂交，较佳地，该多肽具有SEQ ID No.6所示的序列。更佳地，该序列具有SEQ ID No.5中从核苷酸1-213位的核苷酸序列。
在本发明还提供了一种分离的亚非马蜂蜂毒Prepromelittin的最终表达产物--Melittin蛋白活性多肽，它包括具有SEQ ID No.6氨基酸序列的多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID No.6序列的多肽。本发明还提供了一种载体，它含有上述分离出的DNA；一种所述载体转化的宿主细胞。
本发明还提供了一种制备具有亚非马蜂蜂毒Prepromelittin的最终表达产物--Melittin蛋白的活性多肽的方法，该方法包括(a)将编码具有亚非马蜂蜂毒Prepromelittin蛋白的多肽的核苷酸序列和编码具有Prepromelittin基因末端的130～213核苷酸序列(即Melittin这一部分的核苷酸序列)可操作地连于表达调控序列，形成亚非马蜂蜂毒Prepromelittin和Melittin的表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID No.5核苷酸1-213位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)将步骤(a)中的表达载体转入宿主细胞，形成亚非马蜂蜂毒Prepromelittin和Melittin的重组细胞；(c)在适合表达亚非马蜂蜂毒Prepromelittin和Melittin的条件下，培养步骤(b)中的重组细胞；(d)分离出具有亚非马蜂蜂毒Melittin蛋白活性的多肽。
本发明发现了一种编码亚非马蜂蜂毒Prepromelittin的基因，该基因所编码的Prepromelittin是蜂毒Melittin的天然融合蛋白，而蜂毒Melittin则是一种生物活性肽，可应用于医学上心血官疾病、肿瘤等疾病的治疗，可作为抗原用于蜂毒免疫制剂、蜂毒过敏诊断试剂的制备，可作为一种天然抗微生物肽用于植物病、虫害的防治，也可作为一种模型肽用于膜作用机制、钙调蛋白作用机理等方面的研究。亚非马蜂蜂毒Prepromelittin基因可为研究亚非马蜂蜂毒中与Melittin相关的分子作用机理，为开发利用亚非马蜂蜂毒资源提供新的依据。
具体实施例方式
在本发明的一个具体实施方案中，本发明的分离的多核苷酸全长为213个核苷酸，其详细序列见SEQ ID No.5，开放读框位于1-213位核苷酸。在本发明中，“分离的”、“纯化的”或“基本纯的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来；还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组份分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。
在本发明中，术语“亚非马蜂蜂毒Prepromelittin蛋白(或多肽)编码序列”指编码具有亚非马蜂蜂毒Prepromelittin蛋白的多肽的核苷酸序列，如SEQ IDNo.5中1-213位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指位于SEQ ID No.5序列的编码框1-213位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID No.5中1-213位核苷酸序列同源性低至约70％。简并序列也能编码出SEQ ID No.6所述的序列。该术语还包括能在中度严格条件下，更佳地在高度严格条件下，与SEQ ID No.5中从核苷酸1-213位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。该术语还包括与SEQ ID No.5中从核苷酸1-213位的核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。
该术语还包括能编码具有与亚非马蜂蜂毒Prepromelittin相同功能的蛋白的SEQ ID No.6序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个核苷酸。
在本发明中，“基本纯的”蛋白质或多肽是指其占样品总物质的至少20％，较佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按干重或湿重计)。纯度可以用任何合适的方法进行测量，如用柱层折、PAGE或HPLC法测量多肽的纯度。基本纯的多肽基本上不含天然状态下的伴随其的组分。
在本发明中，术语“亚非马蜂蜂毒Prepromelittin蛋白多肽”指具有亚非马蜂蜂毒Prepromelittin蛋白的SEQ ID No.6序列的多肽。该术语还包括具有与亚非马蜂蜂毒Prepromelittin蛋白相同功能的SEQ ID No.6序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括亚非马蜂蜂毒Prepromelittin蛋白的片段和衍生物。
该多肽的变异形式包括同源序列、等位变异体、天然突变体，诱导突变体，在高或低的严谨度条件下能与亚非马蜂蜂毒Prepromelittin DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗亚非马蜂蜂毒Prepromelittin的最终表达产物--Melittin多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含亚非马蜂蜂毒Prepromelittin多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了亚非马蜂蜂毒Prepromelittin多肽的可溶性片段。通常，该片段具有亚非马蜂蜂毒Prepromelittin多肽编码序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，最佳地为70个连续氨基酸。
发明还提供亚非马蜂蜂毒Prepromelittin蛋白或多肽的类似物，这些类似物与天然亚非马蜂蜂毒Prepromelittin多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括；体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
本发明还包括亚非马蜂蜂毒Prepromelittin多肽编码序列及其片段的反义序列，这种反义序列可用于抑制细胞内亚非马蜂蜂毒Prepromelittin的表达。
本发明还包括一种探针分子，该分子通常具有亚非马蜂蜂毒Prepromelittin多肽编码序列的8-100个，较佳地1-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码亚非马蜂蜂毒Prepromelittin核苷酸分子。
本发明还包括检测亚非马蜂蜂毒Prepromelittin核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合，较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于亚非马蜂蜂毒Prepromelittin多肽的编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间，引物长度一般为15-50个核苷酸。
在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体。
在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌，枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、昆虫细胞、和哺乳动物细胞，较佳地，该宿主细胞是真核细胞，如Tn细胞、CHO细胞、COS细胞等。
另一方面，本发明还包括对亚非马蜂蜂毒Prepromelittin或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于亚非马蜂蜂毒Prepromelittin基因产物或片段。较佳地，指那些能与亚非马蜂蜂毒Prepromelittin基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制亚非马蜂蜂毒Prepromelittin基因的最终表达产物--Melittin蛋白的分子，也包括那些并不影响亚非马蜂蜂毒Prepromelittin基因的最终表达产物--Melittin蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的亚非马蜂蜂毒Prepromelittin基因的最终表达产物--Melittin结合的抗体。
本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab’或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利No.4,946,778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自亚非马蜂的抗体部分的抗体。
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备，例如，纯化的亚非马蜂蜂毒Prepromelittin基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达亚非马蜂蜂毒Prepromelittin或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来制备抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol，6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol，6292，1976；Hammerling等人，In MonoclonalAntibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本发明的抗体包括能阻断亚非马蜂蜂毒Prepromelittin基因的最终表达产物--Melittin功能的抗体以及不影响亚非马蜂蜂毒Melittin功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用亚非马蜂蜂毒Prepromelittin基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术而获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与亚非马蜂蜂毒Prepromelittin基因的最终产物未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.coli)中制备的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。
在本发明的一个实施例中，亚非马蜂蜂毒Prepromelittin的cDNA核苷酸序列是如此获得的，以亚非马蜂毒腺总RNA反转录的cDNA为模板，用一对寡核苷酸为引物-A5’-GCTCGAGATGAAATTCTTAGTCAACGTT-3’为正向向引物，寡核苷酸B5’-GAAGCTTCTAACCCTGTTGCCTCTT-3’为反向引物，进行PCR。对扩增产物进行测序后得到SEQ ID No.5的cDNA序列。亚非马蜂蜂毒Melittin为亚非马蜂毒腺中Prepromelittin基因表达的最终蛋白，本发明的亚非马蜂蜂毒Prepromelittin为研究亚非马蜂蜂毒中与Melittin相关的分子作用机理提供了基础。
下面结合具体实例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明范围。
实施例1，亚非马蜂蜂毒Prepromelittin的cDNA的克隆和测定1.引物扩增以亚非马蜂毒腺总RNA反转录的cDNA为模板，用一对寡核苷酸为引物-A5’-GCTCGAGATGAAATTCTTAGTCAACGTT-3’(SEQ ID No.1)为正向向引物，寡核苷酸B5’-GAAGCTTCTAACCCTGTTGCCTCTT-3’(SEQID No.2)为反向引物，进行PCR。A/B的PCR条件为94℃3分钟，随之以94℃40秒钟，54℃40秒钟和72℃1分钟进行35个循环，最后72℃延伸10分钟，电泳检测得到约220bp的目的片段。
2.PCR产物的测序将上述PCR扩增产物A/B与PGEM-T载体(Promega)连接，转化大肠杆菌JM109，用碱法提取质粒，用BigDye terminator v2.0(Applied BiosystemIncorporation)测序试剂盒对抽提的质粒进行测序，最后用电脑软件拼接顺序，获得cDNA序列，共213bp，详细序列见SEQ ID No.5，其中开放读框位于1-213位核苷酸。
根据得到的cDNA序列推导出亚非马蜂蜂毒Prepromelittin的氨基酸序列，共70个氨基酸残基，其氨基酸序列详见SEQ ID No.6。
实施例2，同源比较用本发明的亚非马蜂蜂毒Prepromelittin的cDNA序列及其编码蛋白，在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB数据库及Non-redundant GenBankCDS translations+PDB+SwissProt+Spupdate+PIR数据库中，用Blast程序进行核酸和蛋白同源检索。结果发现，它与意大利蜜蜂蜂毒Prepromelittin有显著的同源性。用GENTYX软件分析可以看出，它们的蛋白的同源性为95％(见附表1)。因此，可以推测本发明的亚非马蜂蜂毒Prepromelittin蛋白为意大利蜜蜂蜂毒Prepromelittin的同系物，并具有类似的功能。
1983年，Vlask等人应用生物技术方法，利用意大利蜜蜂蜂王毒腺总RNA反转录成cDNA，通过构建cDNA文库，然后用探针作文库筛选，获得了编码意大利蜜蜂蜂毒Prepromelittin的新基因，该cDNA所编码的Prepromelittin的信号肽和成熟肽为70个氨基酸残基，其中开始的21个氨基酸残基为信号肽，其余的49个为成熟肽，包括末端Melittin的氨基酸序列(44～70)。本发明中亚非马蜂蜂毒Prepromelittin基因所编码的氨基酸序列含有以上所述的相应的信号肽和成熟肽，包括末端的Melittin的氨基酸序列(44～70)。Prepromelittin在亚非马蜂中最后的表达产物为Melittin。而Melittin是目前医学、农业和生物学方面十分有用的活性多肽，它可以通过多途径影响细胞的信号传导系统，并可诱导神经酰胺合成及细胞调亡，具有抗炎、抗菌、抗病毒等多种生物学作用；同时，Melittin也已成为一种模型肽，广泛用于膜作用机制、钙调蛋白作用机理等方面的研究。本发明人的亚非马蜂Prepromelittin基因为研究亚非马蜂蜂毒中与Melittin相关的分子作用机理，为开发利用亚非马蜂蜂毒资源提供了新的依据。
实施例3，亚非马蜂蜂毒Prepromelittin基因末端的130～213核苷酸序列(即Melittin这一部分的核苷酸序列)在大肠杆菌中的融合表达在该实施例中，以实施例1中PCR扩增产物作为插入片段。
PCR反应中使用的5’寡核苷酸引物序列为5’-CGTGGATCCGGAATTGGAGCAGTTCTG-3’(SEQ ID No.3)，该引物含有BamH I限制性内切酶的酶切位点，在该酶切位点之后是亚非马蜂蜂毒编码Melittin序列的21个核苷酸；3’端引物序列为5’-CGGGAATTCCTAACCCTGTTGCCTCTT-3’(SEQ ID No.4)，该引物含有EcoR I限制性内切酶的酶切位点，翻译终止子和编码亚非马蜂蜂毒Melittin的部分核苷酸序列。
引物上的限制性内切酶的酶切位点对应于细菌表达载体pGEX-4T-3上的限制性内切酶的酶切位点，该质粒载体编码抗生素抗性(Ampr)、一个细菌复制起点(Ori)、一个IPTG可调启动子/操纵子(P/O)，一个核糖体结合位点(RBS)，一个谷胱甘肽标记物(GST)以及限制性内切酶克隆位点。
用BamH I和EcoR I消化pGEX-4T-3载体及插入片段，随后将插入片段连接到pGEX-4T-3载体并保持开放读框在细菌RBS起始。随后用连接混合物转化商品名为BL21的E.coli菌株，BL21含有多拷贝的重组质粒，其表达lac I阻遏物并携带氨苄抗性(Ampr)，在含有Ampr的LB培养皿上筛选转化子，抽提质粒，测序验证亚非马蜂蜂毒中编码Melittin的cDNA片段已正确插入了载体。在补加Ampr(100μg/ml)的LB液体培养基中过夜培养(O/N)含所需构建物的阳性转化子克隆。过夜(O/N)培养物以1∶10的稀释率稀释，然后接种到大体积LB液体培养基中，培养细胞生长至600光密度(OD600)为0.4-0.6时，加IPTG(“isopropyl-β-D-thiogalactoside”)至终浓度为1.0mM。通过使lacI阻遏物失活，IPTG诱导启动P/O导致基因表达水平提高。继续培养细胞3-5小时后，离心沉淀细胞，并用1/20体积的PBS将其悬浮；随后超声处理裂解细胞；再在室温(25℃)下加入Triton X-100到终浓度1％，轻轻混合30分钟；随后10,000g离心5分钟，收集上清，再用GST Purification Modules纯化已表达的融合蛋白。最后，将蛋白质保存在终浓度为10％(w/v)甘油的贮存液中。
用15％的SDS-PAGE胶进行电泳，鉴定表达蛋白的分子量大小为约29.0KDa。
此外，用常规方法对表达蛋白的N端和C端各10个氨基酸长度的氨基酸进行测序，发现与SEQ ID No.6的序列一致。
实施例4，亚非马蜂蜂毒Prepromelittin在真核细胞(Tn细胞株，即粉纹夜蛾细胞株)中的表达在该实施例中，以实施例1中PCR扩增产物作为插入片段。
PCR反应中使用的5’寡核苷酸引物序列为5’-GCTCGAGATGAAATTCTTAGTCAACGTT-3’(SEQ ID No.1)，该引物含有Xho I限制性内切酶的酶切位点，在该酶切位点之后是信号肽开始的亚非马蜂蜂毒Prepromelittin编码序列的21个核苷酸；3’端引物序列为5’-GAAGCTTCTAACCCTGTTGCCTCTT-3’(SEQ ID No.2)，该引物含有Hind III限制性内切酶的酶切位点，翻译终止子和亚非马蜂蜂毒Prepromelittin的部分编码序列。
引物上限制性内切酶酶切位点对应于Tn细胞表达载体pBacFastHTb上的限制性内切酶酶切位点，该质粒载体编码抗生素抗性(Ampr和Gmr)，一个噬菌体复制起点(Ori)、一个病毒复制起点(SV40)、一个T7启动子、一个病毒启动子(P-CMV)，一个SV40启动子、一个SV40加尾信号和相应的polyA顺序、一个BGH加尾信号和相应的polyA顺序。
用Xho I和Hind III消化pBacFastHTb载体及插入片段，随后用连结混合物转化E.coli TG I菌株，在含有Ampr和Gmr的LB培养皿上筛选转化子，补加Ampr和Gmr的LB液体培养基中培养(O/N)含所需构建物的克隆，抽提质粒，测序验证亚非马蜂蜂毒Prepromelittin的cDNA片段已正确插入了载体。随后用重组质粒转化E.coli DH10Bac菌株，在含有Kanr、Gmr、四环素的LB培养皿上筛选转化子，在补加Kanr、Gmr、四环素的LB液体培养基中培养(O/N)含所需构建物的克隆，抽提质粒，经Sepharose 2B柱纯化，回收质粒-70℃保存。
质粒转染Tn细胞是采用脂转染法，用Lipofectin(GiBco Life)进行的。转染48小时后，收集细胞及细胞上清，含重组病毒粒子的细胞上清用于下一轮感染。经2-3周的TC-100连续传代培养，收集细胞，用超声裂解法破碎细胞，以含NaCl0.5mM、imidazola 5mM、PMSF 1mM的20mM Tris-CI(PH8.0)溶液为平衡液及洗脱液，蛋白液用经预平衡的Ni2+Sepharose 6B柱过柱；再用含imdazola50mM、NaCl 0.5mM、PMSF 1mM的20mM Tris-CI(PH8.0)的溶液，洗去杂蛋白，专一性的吸附的6×His的融合蛋白，再用含imdazola 500mM、NaCl 0.5mM、PMSF 1mM的20mM Tris-CI(PH8.0)的溶液进行洗脱.然后以PBS(PH7.4)为透析液对表达蛋白溶液进行透析。最后冻干保存。
用含6mol/L脲素(或24％甘油)的16％T，6％C和8％T，3％C的2L-T-SDS-PAGE进行电泳，鉴定表达蛋白的分子量大小约为3.0KDa。
此外，用常规方法对表达蛋白的N端和C端各10个氨基酸长度的氨基酸进行测序，发现与SEQ白IDNo.6的蛋白，序列一致。
实施例5，制备抗体将实施例3和4中获得的重组蛋白用来免疫动物以产生抗体，具体方法如下。重组分子用亲和层析法进行分离后备用。也可用SDS-PAGE凝胶电泳法进行分离，将电泳条带从凝胶中切下.并用等体积的完全Freund′s佐剂乳化。用200-300μg/头乳化过的蛋白，对12周龄的家兔皮下注射。21天后，用非完全Freund′s佐剂乳化的同样抗原，以100-200μg/头的剂量进行皮下多点及腿部肌肉注射以加强免疫。21天后再进行一次臀部肌肉注射加强免疫。抗血清的特异反应活性用它在体内沉淀亚非马蜂蜂毒Prepromelittin基因翻译产物的能力来评估。SEQ ID No.1∽6的说明，SEQ ID NO.1的信息(i)序列特征CA)长度28碱基CB)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑；线性(ii)分子型寡核苷酸(vi)序列描述SEQ ID NO.1GCTCGAGATGAAATTCTTAGTCAACGTTSEQ ID NO.2的信息(i)序列特征(A)长度25碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑线性(ii)分子型寡核苷酸(vi)序列描述；SEQ ID NO.2GAAGCTTCTAACCCTGTTGCCTCTTSEQ ID NO.3的信息(i)序列特征(A)长度27碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑线性(ii)分子型寡核苷酸(vi)序列描述；SEQ ID NO.3CGTGGATCCGGAATTGGAGCAGTTCTGSEQ ID NO.4的信息(i)序列特征(A)长度27碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑线性(ii)分子型寡核苷酸(vi)序列描述；SEQ ID NO.4CGGGAATTCCTAACCCTGTTGCCTCTTSEQ ID NO.5的信息(i)序列特征(A)长度213bp(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑；线性(ii)分子型cDNA(vii)(vi)序列描述SEQ ID NO.51ATGAAATTCT TAGTCAACGT TGCCCTTGTT TTTATGGTTG TATACATTTC TTTCATCTAT60 GCGGCCCCTG AACCAGAACC GGCACCGGAG GCAGAGGCAG AGGCAGACGC GGAGGCAGAT121 CCGGAAGCAG GGATTGGAGC AGTTCTGAAG GTATTAGCCA CAGGATTGCC TGCCCTTATA181 AGTTGGATTA AACGTAAGAG GCAACAGGGT TAGSEQ ID NO.6的信息(i)序列特征(A)长度70个氨基酸(B)类型氨基酸(C)拓扑结构；线性(ii)分子型多肽(vi)序列描述SEQ ID NO.61Met Lys Phe Leu Val Asn Val Ala Leu Val Phe Met Val Val Tyr Ile Ser Phe Ile Tyr21 Ala Ala Pro Glu Pro Glu Pro Ala Pro Glu Ala Glu Ala Glu Ala Asp Ala Glu Ala Asp41 Pro Glu Ala Gly Ile Gly Ala Val Leu Lys Val Leu Ala Thr Gly Leu Pro Ala Leu Ile61 Ser Trp Ile Lys Arg Lys Arg Gln Gln Gly表I 亚非马蜂蜂毒Prepromelittin与意大利蜜蜂蜂毒Prepromelittin蛋白的比较进行同源比较的两个序列是亚非马蜂蜂毒PhPrepromelittin残基总数70意大利蜜蜂蜂毒AmPrepromelittin残基总数70表示一致残基的符号为“*”AmPrepromelittin 1MKFLVNVALVFMVVYISYIYAAPEPEPAPEPEAEADAEADPEAGIGAVLKVLTTGLPALIPhPrepromelittin 1MKFLVNVALVFMVVYISFIYAAPEPEPAPEAEAEADAEADPEAGIGAVLKVLATGLPALI***************** ************ ********************* *******AmPrepromelittin 61SWIKRKRQQGPhPrepromelittin 61SWIKRKRQQG**********同源性95％
权利要求
1.一种分离出的DNA分子，其特征在于，它包括编码具有亚非马蜂蜂毒溶血肽前体多肽的核苷酸序列；所述的核苷酸序列与SEQ ID No.5中从核苷酸1-213位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严格条件下与SEQ ID No.5中从核苷酸1-213的核苷酸序列杂交。
2.根据权利要求1 SEQ ID No.5的DNA分子，其特征在于，所述编码的多肽具有SEQ ID No.6所示的序列，具有SEQ ID No.5中从核苷酸1-213位的核苷酸序列。
3.一种分离的亚非马蜂蜂毒溶血肽前体基因的最终表达产物--溶血肽蛋白多肽，其特征在于，它具有SEQ ID No.6氨基酸序列的多肽、或其活性片段，或其活性衍生物，该多肽具有SEQ ID No.6序列。
4.一种载体，其特征在于，它含有权利要求1所述的DNA。
5.一种宿主细胞，其特征在于，它是用权利要求4所述载体转化的宿主细胞。
6.一种具有亚非马蜂蜂毒溶血肽前体基因的最终表达产物--溶血肽蛋白多肽的制备方法，其特征在于，该方法包括(a)将编码具有亚非马蜂蜂毒溶血肽前体多肽的核苷酸序列和溶血肽前体基因末端的130-213核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成亚非马蜂蜂毒溶血肽前体和溶血肽的表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID No.5中从核苷酸1-213位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)将步骤(a)中表达的载体转入宿主细胞，形成亚非马蜂蜂毒溶血肽前体和溶血肽的重组细胞；(c)在适合表达亚非马蜂蜂毒溶血肽前体和溶血肽的条件下，培养步骤(b)中的重组细胞；(d)分离出具有亚非马蜂蜂毒溶血肽蛋白活性的多肽。
7.一种抗体，其特征在于，它是能与权利要求3所述的亚非马蜂蜂毒溶血肽前体基因的最终表达产物--溶血肽蛋白活性多肽特异性结合的抗体。
8.一种探针分子，其特征在于，它含有权利要求1所述的DNA分子中8-100个连续核苷酸。
9.根据权利要求8所述的探针分子；其特征在于是指能与亚非马蜂蜂毒溶血肽前体基因产物或片断结合但不识别和结合与其它不相关抗原分子的抗体。
10.根据权利要求8所述的探针分子，其特征在于，它具有亚非马蜂蜂毒溶血肽前体多肽编码序列中15-20个连续的核苷酸。
全文摘要
本发明公开了一种亚非马蜂蜂毒溶血肽前体基因的编码序列及其编码的多肽和制备方法。该cDNA序列编码的蛋白是意大利蜜蜂蜂毒溶血肽前体的一个同系物,它与SEQID No.5中从核苷酸1－213位的核苷酸序列有至少70%的同源性。所述序列编码具有SEQ ID No.6所示的序列的多肽。此外,还提出了含亚非马蜂蜂毒溶血肽前体和溶血肽前体基因末端的130－213核苷酸序列的载体、宿主细胞,与亚非马蜂蜂毒溶血肽相关的抗体,具有蛋白活性亚非马蜂蜂毒溶血肽的多肽、相关抗体的制备方法。本发明为进一步研究亚非马蜂蜂毒溶血肽的分子作用机理,开发与溶血肽相关的生物医药、诊断试剂、生化试剂以及生物杀虫剂打下了基础。
文档编号C12N15/11GK1376794SQ0211074
公开日2002年10月30日 申请日期2002年2月1日 优先权日2002年2月1日
发明者施婉君, 张传溪, 张素方, 程家安 申请人:浙江大学