一种重组蜂毒肽及其应用的制作方法

专利名称：一种重组蜂毒肽及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种重组蜂毒肽及其在防治种鸡输卵管疾病中的应用。
背景技术：
DNA重组(Recombinant DNA)技术即用人工手段对DNA进行改造和重新组合的技术。包括对DNA分子的精细切割、部分序列的去除、新序列的加入和连接、DNA分子扩增、转入细胞的复制繁殖、筛选、克隆、鉴定和序列测定等等，是基因工程技术的核心。为获得蛋白质/多肽(以下所称“蛋白质”和“多肽”通用)提供了技术支持。已有不少蛋白质类药物、 疫苗、诊断试剂采用基因工程方法生产。DNA药物，它是将具有治疗意义的基因重组进真核表达载体，再直接转移到动物或人的细胞内，表达出具有治疗作用的多肽或蛋白质，从而达到预防疾病、治疗疾病等目的。它与传统方法提取、合成的蛋白质工程药物不同，不需要在体外合成和表达蛋白质，也不需要在体外分离和纯化，而是把基因质粒植入活体内，让细胞自己去合成、分离和纯化蛋白质，并且自行释放进入血液循环，在局部或远端部位发挥其功能，进而达到防治疾病等目的。而将DNA药物靶向表达到特定的组织中进行定向治疗则可以考虑在表达系统中启用特定表达的启动子。蛋传病是病原通过染病或带菌母鸡传给子代所引起的疾病。由于种鸡蛋传性疾病的蔓延，结果导致商品代雏鸡在孵化过程中被污染，出壳的雏鸡往往死亡，残存的也变为隐性带菌鸡。由于种鸡养殖企业普遍采用定期投喂有效抗菌药物的方法控制疾病的发生，但滥用药物，致使耐药菌株迅速增加。人们把目光投放到抗菌多肽方面。抗菌多肽在自然环境中的表达量很少，化学合成方法成本太高，一般是通过基因工程的手段获得转抗菌多肽基因动物既解决了体外表达水平限制的问题，又免除了体外表达后，后续纯化的难题。目前已开始从事动物和植物基因工程的研究，出现了转抗菌多肽基因动物和植物，报道已成功地将抗菌多肽基因导入小鼠、蚊子唾液腺和肠道、烟草、马铃薯、水稻和小麦中(黄莹等，2007)。Lazarev等0002，2004, 200 研究表明，通过在离体细胞或者是动物体内直接表达抗菌多肽(蜂毒肽)，能有效抑制病菌(支原体和衣原体)的感染，降低动物死亡率。转基因研究中，组织特异性启动子的使用能使目的外源基因在特定组织内高效表达。蚊子最好的表达器官是唾液腺、肠道，因为这些地方是寄生虫各个发育阶段的栖息地， 从而抑制疟疾的传播。通过对转抗菌多肽基因鼠的研究发现，哺乳动物免疫系统合成的抗菌多肽可以增强动物自身对疾病的抵抗力，这些抗菌多肽对细菌、真菌、原虫和不正常的细胞有杀伤作用(Bulet P et al, 2004)。目前，国内学者的研究主要是将鸡输卵管作为生物反应器，表达外源基因，如高波等将卵清蛋白基因克隆入PGEM-T载体中，插入黏粒载体构建成鸡输卵管特异表达载体 pOV,再加入报告基因获得重组载体pOVlacZ，注射产蛋鸡后发现hcZ基因仅在注射鸡输卵管的膨大部表达。克隆的鸡ov基因调控区能有效驱动报告基因在输卵管的特异表达。(鸡输卵管特异表达载体的构建及其体内表达，中国生物工程杂质，2003年8月第23卷第8期， 83-86)。蜂毒肽是一类来源于昆虫的小分子多肽，由沈个氨基酸残基组成，分子量2840， 具有广泛的生物学活性，可以抑制20多种革兰氏阳性和阴性细菌的生长繁殖。但是蜂毒肽的溶血作用强，限制了其临床应用。有学者对蜂毒肽的分子结构进行了改造，将第5位Val 变为Arg，第15位Ala变为Arg，删除了第16位的Leu (赵亚华，懂竟南，蜂毒素分子的改造及其基因在毕赤酵母中的表达，中国生物工程杂质，2005,25 (2):45-48).经过改造后的蜂毒肽可以保留抗菌活性，同时溶血活性降低。也有研究表明，用甲胎蛋白(AFP)启动子构建的重组蜂毒肽腺病毒载体，可以抑制AFP阳性肝癌细胞的增殖，且对AFP阴性肝癌细胞及正常肝细胞没有明显影响(李柏等，蜂毒素基因重组腺病毒诱导肝癌细胞凋亡的作用，中华肝脏病杂质，2004，12 (8):453-455).以上研究都只针对人类疾病，关于用于治疗种鸡输卵管疾病的基因药物还未见报道。

发明内容
本发明的目的在于根据现有技术中治疗种鸡输卵管疾病的化学合成抗菌肽成本高、生物方法制备的药物缺乏等缺陷，提供一种治疗种鸡输卵管疾病的重组蜂毒肽蛋白。本发明的另一目的是提供由上述蜂毒肽制备的基因药物。本发明的又一目的是提供上述基因药物的制备方法。本发明通过以下技术手段实现上述目的
一种重组蜂毒肽蛋白(命名为MLT)，其特征在于氨基酸序列如SEQ ID N0:1所示。本发明对蜂毒肽蛋白进行了改造，将其Lys-7改为Arg-7，Val-8改为Gly-8以及删除了 Leu_13 位点，以达到增大蜂毒肽抑菌活性同时降低其溶血活性的目的。首先，将Lys-7改为Arg， 以加强正电荷，且Arg为螺旋的不敏感者；其次，将Val-8均改为Gly，打破螺旋，加大疏水力矩；删除Leu-13 从热力学的角度分析，肽链越长，折叠所需时间越长，也不利于与膜的结合，Leu-13与螺旋的折叠无关，删除13位可显著降低溶血。上述重组蜂毒肽蛋白的编码基因，核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示。上述重组蜂毒肽蛋白在制备治疗种鸡输卵管疾病的药物中的应用。所述种鸡输卵管疾病为大肠杆菌感染疾病、鸡白痢沙门氏菌感染疾病或金黄色葡萄球菌感染疾病。一种重组蜂毒肽表达载体，是由上述重组蜂毒肽蛋白的编码基因与载体pVAXl连接构成。载体pVAXl购于invitrogen公司。有一个强启动子pcmv，下游有多克隆位点以及长度较小的特点有利于载体改造。重组蜂毒肽表达载体pVAXl-MLT在pVAXl质粒的基础上保留其强启动子pcmv在多克隆位点区插入抗菌肽基因，使得抗菌肽基因在强启动自pcmv 的调控下。在上述表达载体的基础上，我们做了进一步改进，即由鸡输卵管特异表达启动子鸡卵清蛋白(Ovalbumin, ov)5'端调控序列1. Ikb (GenBank登录号为J00895)，简称ov序列取代载体PVAXl上的CMV启动子，与上述重组蜂毒肽蛋白的编码基因连接构建而成。上述基因药物即重组蜂毒肽表达载体的物理模式图如图1。做这样的改进后，可以使抗菌多肽基因置于鸡输卵管特异表达调控元件的控制之下，实现蜂毒肽在组织器官的特异表达，表达产物为5. 36kD。利用输卵管特异表达启动子驱动抗菌多肽基因在输卵管上皮细胞的表达，使得外源抗菌多肽基因能在输卵管内与其他蛋白一起分泌到蛋清中。使抗菌多肽基因在鸡蛋形成过程中表达，并一起组装入鸡蛋。为抑制蛋传性疾病，提高雏鸡的出生率及降低病菌感染率提供一种基因药物。改进的重组蜂毒肽表达载体的制备方法，其特征在于包括以下步骤
(1)扩增重组蜂毒肽基因；
(2)将步骤(1)中重组蜂毒肽基因连接到载体pVAXl上；
(3)扩增鸡卵清蛋白基因；
(4)将步骤(3)所得鸡卵清蛋白基因连接到载体pMDlS-T上；先对鸡卵清蛋白基因进行测序，测序正确后才用于下一步试验；
(5)将步骤(2)所得产物与步骤(4)所得产物经酶切后重组，构建含有重组蜂毒肽基因、鸡卵清蛋白基因的PVAXl重组载体，即为治疗种鸡输卵管疾病的基因药物。步骤(1)所述扩增重组蜂毒肽基因的方法为在权利要求2所述重组蜂毒肽蛋白的编码基因5’端添加翻译起始序列CGCCACC和起始密码子ATG，3’端添加6个His，并在
5’端加上限制性酶切位点Nhe I ,Bgl Π Γ端加上I及保护碱基ATT，作为模板，设计
引物序列如SEQ ID NO:3 4，进行PCR，以PCR产物为模板，设计引物序列如SEQ ID N0:5 6， 进行第二轮PCR，PCR产物即为重组蜂毒肽基因。步骤(2)所述扩增鸡卵清蛋白基因的方法为以鸡输卵管总DNA为模板，以SEQ ID NO:7、为引物，进行PCR，PCR产物即为鸡卵清蛋白基因。一种防治鸡输卵管疾病的基因药物，包括上述任意一种重组蜂毒肽表达载体。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果
本发明的重组蜂毒肽蛋白，具有较强的抑菌作用，构建的重组表达载体基因药物，可以在鸡输卵管上皮特异表达，发挥其药效，且药物本身没有毒性，用药安全能够得到保障。


图1.重组质粒pOVl. I-MLT物理模型图2. MLT基因的PCR电泳检测图，其中M为Marker，1、2为PCR扩增产物； 图3. pVAXl-MLT的双酶切电泳图。其中M为Marker，l、2为pVAXl-MLT重组质粒酶切
结果；
图4.表达质粒pVAXl的物理模型图； 图5.重组蜂毒肽表达载体pVAXl-MLT物理模型图6.鸡卵清蛋白上游调控序列ov PCR电泳检测图，其中M为Marker，1、2为卵清蛋白上游调控序列的PCR产物；
图7. pMD18-T-0V菌落PCR鉴定电泳图，M为Marker，Γ 为pMD18_T_0V转化子的菌落PCR产物；
图8. pOVl. I-MLT菌落PCR鉴定电泳图，M为Marker，Γ4为pOVl. I-MLT转化子菌落PCR产物；
图9.重组子pOVl. I-MLT双酶切鉴定电泳图，M为Marker，1为重组子pOVl. I-MLT的酶切产物；
图10.三种质粒对病原菌的抑菌结果，其中a为转染空质粒，b为转染pVAXl-MLT，c为转染pOVu-MLT，横排1为对大肠杆菌K12D31，2为鸡白痢沙门氏菌、3为金黄色葡萄球菌；
图11. Tricine-SDS PAGE检测CHO/Vero细胞表达产物结果图，M为Marker，1为转染空质粒样品，2为转染pOVl. I-MLT样品，3为转染pVAXl_MLT样品；
图12.检测CHO细胞表达产物图，1为pVAXl-MLT质粒PCR产物，2^3为空质粒转染细胞RT-PCR产物，4 5为pVAXl-MLT质粒转染细胞RT-PCR产物，6 7为pOV^-MLT转染细胞 RT-PCR 产物；
图13.检测Vero细胞表达产物图，1为pVAXl-MLT质粒PCR产物，2^3为POV1. rMLT转染细胞RT-PCR产物，5 6为pVAXl-MLT转染细胞RT-PCR产物；
图 14. CHO 细胞免疫荧光结果(200X)，a 为 pVAXl-MLT，b 为 pOV^-MLT; 图 15. Vero 细胞免疫荧光结果(200 X )，a 为 pVAXl-MLT，b 为 POV1. fMLT ； 图16.鸡组织器官冰冻切片免疫荧光观察，a为注射空质粒的阴性对照； 图17.鸡组织器官冰冻切片免疫荧光观察，b为注射重组质粒pVAXl-MLT ； 图18.鸡组织器官冰冻切片免疫荧光观察，c为注射重组质粒pOVu-MLT ； 图19.鸡组织冰冻切片HE染色观察(400 X )，左边阴性对照pVAXl处理的组织，右边重组质粒pVAXl-MLT处理的组织，(从上往下顺序为心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肌肉、卵巢和输卵管)。
具体实施例方式实施例1.制备重组蜂毒肽及其编码基因 1.改造蜂毒肽氨基酸序列
在已有的研究基础上，对原蜂毒肽氨基酸序列进行改造以达到增大蜂毒肽抑菌活性同时降低其溶血活性的目的。原始蜂毒肽氨基酸序列如SEQ ID N0:9所示；
改造后的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示，命名为MLT。即将Lys-7改为Arg_7(加强正电荷，且Arg为螺旋的不敏感者)，Val_8改为Gly_8 (打破螺旋，加大疏水力矩)以及删除了 Leu-13位点(从热力学的角度分析，肽链越长，折叠所需时间越长，也不利于与膜的结合，Leu-13与螺旋的折叠无关，删除13位可显著降低溶血)。2.获得重组MLT的编码基因
根据改造后的氨基酸序列和鸡偏爱密码子推断出蜂毒肽的编码基因，其核苷酸序列如 SEQ ID N0:2，在其5，端加入Kozak翻译起始序列(CGCCACC)和起始密码子ATG，3 ‘端加上
6个组氨酸用于检测，并在两端加上限制性酶切位点5'端Mel、i^_/n，3'端&⑷I及
保护碱基ATT，设计4条引物序列SEQ ID N0:3飞，按以下程序进行PCR 以上述经过修饰的蜂毒肽编码基因序列为模板，引物SEQ ID N0:3^4 (20ymol/ L)各IyL , dNTPs (lOmmol/L) 1 μ L，10 X buffer (Mg2 +) 5 μ L，rTaq DNA 聚合酶(2. 5U/ μ L) 1 μ L，力口 ddH20 M 50 μ L0 用得出的PCR产物作为模板，用SEQ ID Ν0:5飞为引物进行第二次PCR扩增。PCR反应体系的组成如下10Xbuffer 5 μ , dNTPs 2 μ ，引物(20 μ mol/L)各 2 μ 1，rTaq DNA 聚合酶(2. 5U/ μ L) 0. 5 μ , Template μ , ddH20 补至 50μ 。PCR 反应程序94°C预变性 2min， 1 个循环；94°C 30s, 52°C 30s, 72°C 40s, 30 个循环；72°C后延伸 5min。扩增结果如图2，PCR产物在1. 5 %琼脂糖凝胶电泳检测时可观察到在 100bp 250bp的特异性条带，即为MLT基因。实施例2.构建重组蜂毒肽表达载体pVAXl-MLT
实施例1所得的MLT基因用Me I和I进行双酶切消化，37°C作用池。反应体系如下10Xbuffer M 5μ L，船e I 1 μ L，^boRI 1 μ L，MLT 基因 25 μ L，ddH20 补至 50 μ L， 同时将pVAXl质粒同样用内切酶Me I和feoRI进行酶切消化，37°C作用池。反应体系如 T 10 X buffer M 5 μ Ι,Ν θ I 1 μ L,BcoR I 1 μ L，pVAXl 质粒 20 μ L，ddH20 补至 50 μ L，同时用CIAP去磷酸化。酶切后的反应液全部用1. 5%琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下切下目的片段的条带，并用胶回收试剂盒回收酶切后的目的DNA片段。在T4连接酶的作用下，将消化的pVAXl载体和已消化的MLT基因4°C连接过夜。反应体系如下10 X连接buffer 1 μ L， MLT基因酶切回收产物7 μ L，ρVAXl质粒回收产物1 μ L，Τ4 DNA连接酶1 μ L。反应结束后获得连接产物重组表达载体pVAXl-MLT。将连接产物转化DH5ci感受态细胞，挑取阳性克隆，将阳性克隆用3ml左右的kana 培养基在37°C继续培养，然后抽取质粒。用限制性内切酶Me 1和&01 I进行酶切鉴定， 电泳结果如图3。送鉴定为阳性的重组质粒到奥科生物技术公司进行序列测定。测序正确的重组质粒即为新构建的质粒pVAXl-MLT。质粒pVAXl及重组质粒pVAXl-MLT的模型图见图 4、5。实施例3.构建重组蜂毒肽表达载体pOVl. I-MLT 1.鸡卵清蛋白ov序列的扩增
根据NCBI数据库上公布的鸡卵清蛋白基因(Chicken Ovalbumine, ov)全核苷酸序列长度为9206bp，编码长度为1872bp的成熟mRNA。(GenBank登录号J008%)设计上下游引物，并在片段两端加上了限制酶切位点，如SEQ ID N0:7和SEQ ID N0:8，以鸡输卵管总 DNA为模板，用以上的特异性引物扩增ov序列。PCR反应体系的组成如下10Xbuffer 2.5 μ , dNTPs 2 μ , Primers (20 μ mol/L)各 Ιμ , rTaq DNA Polymerase(2. 5U/μ L) 0. 5 μ , Template 0. 5μ ，ddH20 补至 25μ 。PCR 反应程序94°C 预变 5min，1 个循环；94°C 40s， 55°C 40s, 72°C 80s, 30个循环；72°C后延伸lOmin。以上述产物为模板，再进行一次PCR，体系中各项加入量加倍，总体积为50 μ L0扩增结果如图6。PCR产物在1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测时可观察到IOOObp左右的特异性条带。ov序列长度为1. lkb, PCR产物在琼脂糖凝胶电泳检测时可观察到特异性条带大小稍高于IOOObp条带，即为ov序列。2. ov克隆片段连接T载体
将纯化的OV序列PCR产物和PMD18-T Vector (TAKARA公司)进行连接。反应体系为 Solution I 5 μ L，纯化的 ov 序列 PCR 产物 4 μ L，pMD18_T Vector 1 μ L。混勻离心后，于 4°C连接过夜。连接产物直接用于转化DH5ci感受态细胞，挑取阳性克隆，将阳性克隆用:3ml左右的LA培养基在37°C继续培养，然后抽取质粒。用酶切的方法进行酶切鉴定，鉴定结果如图7。送鉴定为阳性的重组质粒到奥科生物技术公司进行序列测定。测序正确的重组质粒即为 pMD18-T-0V。3.构建重组蜂毒肽表达载体pOVl. I-MLT
为了使抗菌多肽基因置于鸡输卵管特异表达调控元件的控制之下，将PVAX1-MLT质粒的启动子替换为ov调控序列。将重组质粒pMD18-T-0V和pVAXl-MLT分别用Mlu I和Nhe I进行双酶切，37°C作用3h。反应体系如下10 X buffer M ^ Nhe I 1 μ L,#7w I，重组质粒20 μ L，ddH20补至50 μ L，同时用CIAP去磷酸化。酶切后的反应液全部用1. 5%琼脂糖电泳，在紫外灯下切下目的片段的条带，并用胶回收试剂盒回收酶切后的目的DNA片段。 在jM连接酶的作用下，将已消化纯化的ov序列片段和已消化的pVAXl-MLT载体质粒4°C连接过夜。反应体系如下10 X连接buffer 1 μ L，ov序列片段7 μ L，pVAXl-MLT 1 μ L，T4 DNA连接酶1 yL。将连接产物转化DH5 α感受态细胞，最后取菌液涂布含有100 μ g/mL kana的LB 琼脂培养基上，37°C培养12 1他。平板上挑取单菌落接种3 mL含50 μ g/mL kana的LB培养液中，37°C振摇培养1 后，取菌液用引物SEQ ID N0:7 8进行PCR检测，同时设立空白对照和阳性对照，反应体系如下10XPCR buffer 1. 5 μ L，菌液1 μ L，dNTPs 0. 5μ L(2. 5mM), Primers (20ymol/ L)各 0.5yL，rTaq DNA Polymerase 0. 25 μ L (2. 5U/uL)，ddH20 补至 15 μ L。按常规方法扩增ov序列，反应条件为94°C预变性5min ；94°C变性40 s，55°C退火 40 s，72°C延伸80s，循环30次，最后72°C延伸IOmin0 PCR产物用1. 5%琼脂糖凝胶(含0. 5 μ g/mL溴化乙锭，EB)电泳检测PCR产物，在100V的电压下进行电泳，20min后在紫外灯下观察结果，如图8。挑取阳性克隆，将阳性克隆用3ml左右的Kana培养基在37°C 220rpm过夜振荡培养，次日用Ε. Ζ. N. A. Plasmid Minipreps Kit提取质粒，按试剂盒说明书进行操作抽取质粒，用酶切的方法进行酶切鉴定，电泳结果如图9。送鉴定为阳性的重组质粒到奥科生物技术公司进行序列测定，获得鸡输卵管特异表达载体。测序正确的重组质粒即为新构建的抗菌多肽基因鸡输卵管特异表达载体，命名为POVl. I-MLT0实施例4重组载体转染Vero和CHO细胞
将实施例2和3中获得的重组质粒pVAXl-MLT、pOVl. I-MLT以及pVAXl载体的菌液在 kana培养板上划线培养，在37°C培养箱中过夜。次日挑取单菌落，用3ml的kana培养基在 370C 220rpm过夜振荡培养。之后用装有400ml kana培养基的三角瓶在37°C培养箱中过夜扩大培养。次日用天根生物有限公司的大提质粒试剂盒大量提取质粒。检测质粒的浓度， 放_20°C保存。待Vero、CHO细胞达到最佳生长状态时，分别接种0. 5^2 X IO5/孔数量的细胞到6孔板中，待细胞达到9(Γ95%汇合度时，将重组质粒pVAXl-ML和pOVl. I-MLT用脂质体介导分别转染Vero细胞和CHO细胞。用空质粒pVAXl —起分别转染两种细胞作为对照。 37°C孵育6h，更换为完全培养基继续培养，同时加入雌二醇10_7mol/L、皮质酮10_6mol/L和胰岛素40 μ g/L。在培养24h、4 !后，置于倒置显微镜下观察，并收集细胞上清，_80°C保存， 用于检测细胞培养上清液的抑菌作用，用Tricine-SDS PAGECH0来检测细胞表达产物。之后用RT-PCR以及细胞免疫荧光检测重组载体转染的细胞。1.细胞培养上清液的抑菌作用的检测
将收集到的细胞培养上清液用0. 22 μ m滤膜过滤，每个样品取4mL，冻干成粉末，用剩余未冻干的培养液IOOyL重溶，备用。以革兰氏阴性菌大肠杆菌K12D31 {Escherichia coin,鸡白痢沙门氏菌iSalmonella pullorum)和革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌 {Staphylococcus aureus)为病原指示菌，采用微量稀释方法分析表达产物体外活性 IOOyL的菌液(IX 105CFU/well) +IOOyL蛋白溶液。将上述混合液37 °C培养2h后，取
1μ L加入到融化了的半固体LB培养基中(5(T60°C)，混勻后倒入已有一层薄LB平板中， 37°C培养过夜。剩余混合液继续培养12h，测定0D600nm。平板培养结果如图10，在大肠杆菌K12D31、鸡白痢沙门氏菌和金黄葡萄球菌中，重组蜂毒肽对金黄色葡萄球菌的抑制最强烈。2. Tricine-SDS PAGE 检测 CHO/Vero 细胞表达产物。吸去细胞培养液，剩余500 μ L，将转染48h的细胞从6孔板中用细胞刮轻轻刮下，4 °C 4000r/min离心15min，吸取上清至剩余50 μ L，重悬细胞，再分别加入5 X SDS loading buffer，煮沸5min，12000rpn离心15min，取上清液，获得总蛋白样品。配制16. 5% Tricine-SDS-PAGE各层凝胶分别加入正极缓冲液(0. 2mol/L Tris-HCl pH8. 9)及负极缓冲液(100mmol/L Tris-HCl, 100mmol/L Tricine，0. 1 % SDS)，取上述样品点样 15 μ L。稳压 40mV电泳。待蛋白进入间隔胶后，可调至100mV，至指示剂离胶底部Icm处停止电泳。小心取出凝胶，先放置在固定液中固定45min，然后用含有考马斯亮蓝R250的染色液染色30min。 换脱色液轻微振荡脱色漂洗，至凝胶背景透明为止，照相分析，实验结果如图11，在Marker 5kD附近有一条较淡的泳带，与预期目的蛋白分子量相符(MLT 5. 36kD)。pVAXl_MLT转染的样品条带较为明显，POVI. I-MLT转染的较淡。3. RT-PCR检测重组载体转染的细胞
按Trizol Reagent RNA提取试剂盒的使用说明书，提取转染细胞中的总RNA。提取的细胞总RNA用RNase-Free DNase 37°C孵育30min后，直接用于反转录-聚合酶链反应 (RT-PCR)或按一定比例加入RNase Inhibitor后_80°C保存备用。按RQl RNase-Free DNase 说明处理RNA，反应采用RT-PCR方法扩增目的基因，反应体系为2X0ne Step RNA PCR buffer 25 μ ，引物 SEQ ID N0:5 禾口 SEQ ID N0:6 各 1 PL，RNA 5 μ , 1 step Enzymes Mix
2μ , RNase Free dH20补至50μ 。将上述反应体系混勻、离心，在PCR Express Gradient PCR仪上执行如下反应程序50°C 30min，94°C预变性anin，一个循环；94°C 30s，55°C退火 30s, 72°C延伸30s，30个循环。扩增产物用1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测，对于CHO细胞RT-PCR 产物实验结果如图12 ；对于Vero细胞RT-PCR产物实验结果如图13。对照比较可看出 PVAXl的启动子在CHO和Vero细胞中都有启动表达，但是已经替换成鸡输卵管特异表达的启动子只在CHO中有启动表达。4.细胞免疫荧光检测重组载体转染的细胞。先制备细胞爬片，在转染4 后，取出细胞爬片，用PBS轻微漂洗后，置于37°C PBS 中l(T30min，透析残留培养液，再用PBS洗3次，每次5min。用4%多聚甲醛固定30min，再用 PBS洗3次，每次lOmin。用组织细胞打孔液透化2 5min，PBS洗3次，每次lOmin。加封闭液(5%BSA)，室温封闭60min。吸尽封闭液，立即加入稀释好的一抗Histidine Tag(l:50), 4°C孵育过夜。回收一抗，PBS洗3次，每次5min。荧光标记二抗(1 100)，室温湿盒避光孵育Ih ；PBS洗3次，每次5min。封裱剂封片，镜检，拍照。CHO细胞免疫荧光检测结果和Vero 细胞免疫荧光检测结果如图14和图15，染色结果显示，pVAXl-MLT、pOVl. I-MLT均能在CHO细胞中表达，表达产物主要是在胞浆；在Vero细胞中只有pVAXl-MLT样品能观察到少量的细胞显色。实施例6将正常驱动表达的OV启动子的重组载体导入鸡体内表达
重组质粒pVAXl-MLT、pOVl. I-MLT和空质粒pVAXl经脂质体LipoFu2008 (以1:1的比例混合，室温静止20min)包裹以后，通过翅静脉注射入鸡体内。每种质粒注射3只150天龄处于产蛋高峰期的母麻鸡(挑选体重相当的)，500 μ g/次/只，连续注射两天。在注射质粒前一天和当日共3次胸肌注射0. 3mg雌激素。从第一次注射的前日起收集鸡蛋，待第二次注射后的第四天，每样品选一只鸡进行宰杀，取各内脏器官(心、肝、脾、肾、卵巢、输卵管和肌肉)。将取得的鸡各内脏器官组织，分别提取总RNA，产物进行反转录PCR，检测目的条带MLT序列，并同时采用冰冻切片免疫荧光技术快速检测及进行病理学检测，方法如下
免疫荧光检测宰杀获得的各内脏器官，投入液氮急冻数秒，取出置于-80°C过夜，第二天进行冰冻切片，同时荧光染色。染色步骤如下将冰冻切片用丙酮固定IOmin ；PBS洗2 次，每次5min ；10%正常山羊血清封闭30min ；加入一抗Histidine Tag (1 200)4°C孵育过夜；PBS洗3次，每次5min ；荧光标记二抗(1 200)室温湿盒避光孵育Ih ；PBS洗3次，每次 5min ；DAPI室温湿盒避光孵育5min ；PBS洗一次，5min ；80%甘油封片，镜检，拍照。病理学检测将注射了空质粒的样品和pVAXl-MLT的样品冰冻切片后，进行苏木素-伊红(HE)染色，观察是否发生病理变化，染色步骤如下①冰冻切片苏木素染色aiiin ； ②水洗残液后，分化数秒；③水洗、返蓝；④1%伊红染色5min ；⑤水洗残液；⑥常规乙醇脱水，二甲苯透明；⑦封片，镜检，观察。检测结果组织免疫荧光检测结果如图16、17、18，从图片可直观地看到在图c_输卵管中有一长条的显红光的带，该处便是输卵管上皮细胞，表明MLT在输卵管上皮细胞表达。病理学检测结果如图19，可以看出注射了重组质粒的内部器官表面与阴性对照 (空质粒)的器官无区别，证明其无毒性作用。
权利要求
1.一种重组蜂毒肽蛋白，其特征在于氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
2.权利要求1所述重组蜂毒肽蛋白的编码基因，核苷酸序列如SEQID N0:2所示。
3.权利要求1所述重组蜂毒肽蛋白在制备治疗种鸡输卵管疾病的药物中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述种鸡输卵管疾病为大肠杆菌感染疾病、鸡白痢沙门氏菌感染疾病或金黄色葡萄球菌感染疾病。
5.一种重组蜂毒肽表达载体，其特征在于是以载体pVAXl为出发载体，含有权利要求2 所述重组蜂毒肽蛋白的编码基因。
6.一种重组蜂毒肽表达载体，其特征在于是由鸡输卵管特异表达启动子ov序列取代载体pVAXl上的CMV启动子，下游连接权利要求2所述重组蜂毒肽蛋白的编码基因构建而成。
7.权利要求6所述重组蜂毒肽表达载体的制备方法，其特征在于步骤如下(1)扩增重组蜂毒肽基因；(2)将步骤(1)中重组蜂毒肽基因连接到载体pVAXl上；(3)扩增鸡卵清蛋白基因；(4)将步骤(3)所得鸡卵清蛋白基因连接到载体pMDIS-T上；(5)将步骤(2)所得产物与步骤(4)所得产物经酶切后重组，构建含有重组蜂毒肽基因、鸡卵清蛋白基因的PVAXl重组载体，即为治疗种鸡输卵管疾病的基因药物。
8.根据权利要求7所述基因药物的制备方法，其特征在于步骤(1)所述扩增重组蜂毒肽基因的方法为在权利要求2所述重组蜂毒肽蛋白的编码基因5’端添加翻译起始序列 CGCCACC和起始密码子ATG，3’端添加6个His，并在5’端加上限制性酶切位点Nhe\、Bgl II ，3，端加上feoR I及保护碱基ATT，作为模板，设计引物序列如SEQ ID NO: 3 4，进行PCR， 以PCR产物为模板，设计引物序列如SEQ ID N0:5飞，进行第二轮PCR，第二轮PCR产物即为重组蜂毒肽基因。
9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于步骤(3)所述扩增鸡卵清蛋白基因的方法为以鸡输卵管总DNA为模板，以SEQ ID NO: 7、为引物，进行PCR，PCR产物即为鸡卵清蛋白基因。
10.一种防治鸡输卵管疾病的基因药物，其特征在于包括权利要求5或6中任一重组蜂毒肽表达载体。
全文摘要
本发明公开了一种重组蜂毒肽及其应用，属于基因工程技术领域。所述重组蜂毒肽蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。该重组蜂毒肽蛋白序列可以用于制备防治种鸡输卵管疾病的基因药物，即将重组蜂毒肽的编码序列与载体pVAX1连接构成重组蜂毒肽表达载体。此外，用鸡卵清蛋白基因5’端调控序列即ov序列替换载体pVAX1上的CMV启动子，可以使重组蜂毒肽在鸡输卵管组织内特异表达。本发明的重组蜂毒肽及上述的基因药物对于种鸡输卵管疾病具有很好的治疗效果，且安全无毒性，具有广泛的应用前景。
文档编号C12N15/66GK102229664SQ20111014842
公开日2011年11月2日 申请日期2011年6月3日 优先权日2011年6月3日
发明者林崇韫, 毕英佐, 谢青梅, 赵亚华, 陈 峰, 马静云, 高向阳 申请人:华南农业大学