专利名称：一种鸡防御素9基因表达载体及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种鸡防御素9基因表达载体及其制备方法和在防治种鸡输卵管疾病中的应用。
背景技术：
蛋传病是病原通过染病或带菌母鸡传给子代所引起的疾病。由于种鸡蛋传性疾病的蔓延，结果导致商品代雏鸡在孵化过程中被污染，出壳的雏鸡往往死亡，残存的也变为隐性带菌鸡。由于种鸡养殖企业普遍采用定期投喂有效抗菌药物的方法控制疾病的发生，但滥用药物，致使耐药菌株迅速增加。人们把目光投放到抗菌多肽方面。抗菌多肽在自然环境中的表达量很少，化学合成方法成本太高，一般是通过基因工程的手段获得转抗菌多肽基因动物既解决了体外表达水平限制的问题，又免除了体外表达后，后续纯化的难题。目前已开始从事动物和植物基因工程的研究，出现了转抗菌多肽基因动物和植物，报道已成功地将抗菌多肽基因导入小鼠、蚊子唾液腺和肠道、烟草、马铃薯、水稻和小麦中(黄莹等，2007)。Lazarev等Q002，2004, 200 研究表明，通过在离体细胞或者是动物体内直接表达抗菌多肽(蜂毒肽)，能有效抑制病菌(支原体和衣原体)的感染，降低动物死亡率。转基因研究中，组织特异性启动子的使用能使目的外源基因在特定组织内高效表达。蚊子最好的表达器官是唾液腺、肠道，因为这些地方是寄生虫各个发育阶段的栖息地， 从而抑制疟疾的传播。通过对转抗菌多肽基因鼠的研究发现，哺乳动物免疫系统合成的抗菌多肽可以增强动物自身对疾病的抵抗力，这些抗菌多肽对细菌、真菌、原虫和不正常的细胞有杀伤作用(Bulet P et al, 2004)。
发明内容
本发明的目的在于根据现有技术中治疗种鸡输卵管疾病的化学合成抗菌肽成本高、生物方法制备的药物缺乏等缺陷，提供一种鸡防御素9基因表达载体。本发明的另一目的是提供由上述表达载体的制备方法。本发明的又一目的是提供上述鸡防御素9基因表达载体的应用。本发明通过以下技术方案实现上述目的
一种鸡防御素9基因表达载体，是以真核表达载体pVAXl为基础，插入鸡防御素9 (简称AvBD9)基因，构建成重组真核表达载体。具体地说是以真核表达载体pVAXl为出发载体，用鸡卵清蛋白编码序列(GenBank 登录号为J00895)取代载体pVAXl上的CMV启动子，在其下游插入鸡防御素9基因(GenBank 登录号为NM001001611)的cDNA序列，构建成重组真核表达载体，命名为pOVl. l_AvBD9。所述表达载体的制备方法，步骤如下
(1)扩增鸡防御素9基因；
(2)将步骤(1)中鸡防御素9基因连接到载体pVAXl上；(3)扩增鸡卵清蛋白基因；
(4)将步骤(3)所得鸡卵清蛋白基因连接到载体pMDIS-T上；
(5)将步骤(2)所得产物与步骤(4)所得产物经酶切后重组，构建含有鸡防御素9基因、 鸡卵清蛋白基因的PVAXl重组载体，即为治疗种鸡输卵管疾病的DNA药物。步骤(1)所述扩增鸡防御素9基因所用引物序列如SEQ ID NO:广5所示。其中扩增鸡防御素9基因具体步骤为
用引物序列如SEQ ID NO:广4进行第一轮PCR，PCR反应体系为20 μ mol/L的引物各 1 μ L，10mmol/L 的 dNTPs 1 μ L, IOXbuffer 5 μ L, 2. 5U/ μ L ^ rTaq DNA 聚合酶 lyL，加 ddH20至50 μ L ；(这一步是引物退火后形成双链用作下一步PCR的模版)
以上述PCR产物为模板，SEQ ID NO: 1和SEQ ID N0:5为引物，进行第二轮PCR，PCR反应体系为模板 IPL，20口11101/1的引物各2口1^10讓01/1的(1^138 2 μ L，IOXbuffer 5 μ L, 2. 5U/yL 的 rTaq DNA 聚合酶 0. 5 μ L，加 ddH20 至 50 μ L，PCR 反应程序94°C 预变性 aiiin， 1个循环；94°C 30s, 520C 30s, 72°C 40s，30个循环；72°C后延伸5min，得到鸡防御素9基因。步骤(3)所述扩增鸡卵清蛋白基因所用引物序列如SEQ ID N0:6 7所示。上述鸡防御素9基因表达载体在制备治疗种鸡输卵管疾病药物中的应用。所述种鸡输卵管疾病为大肠杆菌感染疾病、鸡白痢沙门氏菌感染疾病或金黄色葡萄球菌感染疾病。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果
本发明提供的鸡输卵管定位表达抗菌多肽系统具有鸡卵清蛋白ov序列，是鸡输卵管特异表达产物，由输卵管上皮分泌细胞以顶浆分泌的方式分泌入输卵管腔内属于磷酸糖蛋白，共386个氨基酸残基，相对分子质量为43kD，基因长度为9206bp，成熟mRNA长度为1872 个核苷酸。先前的研究资料显示，从-90(Γ+91Λ这一段靠近TATA框的ον序列足以驱动目的基因在输卵管管状线细胞中特异表达。本发明克隆了 TATA框附近1. IkbC - 1047 +41) 的ον序列包含了 COUP、NRE和SDRE基本元件的序列。本发明提供的鸡输卵管定位表达抗菌多肽系统具有对抑制细菌有显著效果的抗菌多肽基因鸡防御素AvBD9基因。β-防御素由大约1纩45个氨基酸残基组成，前体分子由64飞8个氨基酸残基组成。鸡防御素具有很强的抗细菌活性，可以抑制大肠杆菌{Escherichia coli)、产单核细胞李氏杆菌(Listeria monocytogenes)、白色念球菌 {Candida 等，同时可与来自中性粒细胞的其它抗微生物肽协同杀死细菌。并且 β -防御素除了具有广谱抗菌性外，近来的多项研究表明，防御素在机体内还具有其他多种功能。本发明提供的鸡输卵管定位表达抗菌多肽系统具有重要的应用价值。为抑制蛋传性疾病，提高雏鸡的出生率及降低病菌感染率提供一种DNA药物。由于种鸡蛋传性疾病的蔓延，结果导致商品代雏鸡在孵化过程中被污染，出壳的雏鸡往往死亡，残存的也变为隐性带菌鸡。如感染沙门氏菌的雏鸡生长缓慢、长期下痢、死淘率升高，需长期投药维持鸡群健康，开产后产蛋率低，且达不到产蛋高峰。同时种鸡养殖企业普遍采用定期投喂有效抗菌药物的方法控制疾病的发生，但滥用药物，致使耐药菌株迅速增加。商品代养殖企业普遍存在 “鸡难养，有效的鸡药难寻，鸡病难治”令养殖企业头痛的问题，且愈演愈烈，形成恶性循环， 导致商品代鸡养殖企业经济效益差，甚至亏损。而抗菌多肽有着与青霉素等传统抗生素完全不同的作用机制，病原菌不易产生对这一大类抗微生物多肽的耐药性。但是抗菌多肽在自然环境中的表达量很少，化学合成方法成本太高，本发明不仅解决了体外表达水平限制的问题，而且免除了体外表达后，后续纯化的难题。利用输卵管特异表达启动子驱动抗菌多肽基因在输卵管上皮细胞的表达，使得外源抗菌多肽基因能在输卵管内与其他蛋白一起分泌到蛋清中。使抗菌多肽基因在鸡蛋形成过程中表达，并一起组装入鸡蛋。达到抑制蛋传性疾病的目的。
图1.重组质粒pVAXl_AvBD9的物理模型图； 图2.重组质粒pOVl. l-AvBD9的物理模型图3.是表达质粒pVAXl的示意图4. AvBD9基因的PCR产物电泳图，M为Marker，1、2为AvBD9基因； 图5.鸡卵清蛋白上游调控序列ov PCR电泳检测图，其中M为Marker，1、2为卵清蛋白上游调控序列的PCR产物；
图6. pVAXl-AvBD9转化子的菌落PCR鉴定图，M为Marker，1、2为pVAXl_AvBD9转化子的菌落PCR产物；
图7. pVAXl-AvBD9转化子的双酶切鉴定图，M为Marker，1、2为pVAXl_AvBD9转化子的双酶切；
图8. pMD18-T-0V菌落PCR鉴定电泳图，M为Marker，广11. pMD18-T_0V转化子的菌落 PCR产物；
图 9. pVAXl. l-AvBD9 菌落 PCR 鉴定电泳图，M 为 Marker, Γ4 为 pVAXl. l_AvBD9 菌落 PCR鉴定结果；
图10.重组子pVAXl. l-AvBD9双酶切鉴定图，M为Marker，1为重组子pOVl. I-MLT的酶切产物；
图11.表达载体对病原菌的抑菌结果图，其中组1为大肠杆菌K12D31，组2为鸡白痢沙门氏菌，组3为金黄色葡萄球菌；a.为转染空质粒pVAXl，b.转染pVAXl-AvBD9，c.转染 pOVL rAvBD9 ；
图12.转染细胞培养液的Tricine-SDS PAGE电泳图，1为转染空质粒，2为转染 pVAXl-AvBD9 ；
图13. CHO细胞RT-PCR产物电泳图，1为pVAXl- AvBD9质粒PCR产物，2^3为空质粒转染细胞RT-PCR产物，4飞为pVAXl- AvBD9转染细胞RT-PCR产物，6 7为pOVl. 1- AvBD9 转染细胞RT-PCR产物；
图 14. CHO 细胞免疫荧光结果(200X)，A 为 pVAXl-AvBD9，B 为 POV11-AvBD^
具体实施例方式实施例1鸡防御素9基因的克隆
用引物序列SEQ ID NO:广4分别按以下程序进行PCR:引物(20μπκ)1/ L)各1 μ L dNTPs(10mmol/L) 1 μ L, 10Xbuffer(Mg2 + )5y L, rTaq DNA 聚合酶1 μ L,
ddH20加至50 μ L。用得出的PCR产物作为模板，用SEQ ID NO: 1和SEQ ID N0:5为引物进行第二轮PCR扩增。PCR反应体系的组成如下10Xbuffer 5 μ , dNTPs 2 μ ，引物(20 μ mol/ L)各 2 μ L，rTaq DNA 聚合酶(2. 5U/ μ L) 0. 5 μ ,模板 μ ，ddH20 补至 50μ 。PCR 反应程序94°C预变性 anin，l 个循环；94°C 30s, 52°C 30s,72°C 40s, 30 个循环；72°C后延伸 5min。PCR产物在1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测时可观察到在IOObp 250bp的特异性条带， 见图4。实施例2 OV序列的扩增
以鸡输卵管总DNA为模板，用特异性引物SEQ ID NO:6 7扩增ov序列片段。PCR反应体系的组成如下10Xbuffer 2.5 μ , dNTPs 2 μ ，引物(20 μ mol/L)各 1 μ L，rTaq DNA 聚合酶(2. 5U/ μ L) 0. 5 μ ,模板 0. 5μ , ddH20 补至 25ML。PCR 反应程序94°C预变 5min, 1 个循环；94°C 40s, 55°C 40s, 72°C 80s，30个循环；72°C后延伸lOmin。以上述产物为模板，再进行一次PCR，体系中各项加入量加倍，总体积为50 μ L0PCR产物在1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测时可观察到IOOObp左右的特异性条带，见图5。实施例3重组真核表达载体pVAXl_AvBD9的构建
对AvBD9基因用限制性内切酶Me I和I进行进行酶切消化，37°C作用3h， 反应体系如下10 X buffer M 5μI 1 μ L,EcoR I 1 μ L, PCR 产物 25 μ L，ddH20 补
至50 μ L，同时将pVAXl质粒(invitrogen公司)同样用内切酶Me I和进行酶切消化。37°C作用 3h，反应体系如下10Xbuffer M 5μI 1 μ L,EcoR I 1 μ L，PCR 产物
20 μ L，ddH20补至50 μ L，同时用CIAP (碱性磷酸酯酶)去磷酸化。酶切后的反应液全部用 1. 5%琼脂糖电泳，在紫外灯下切下目的片段的条带，并用胶回收试剂盒回收酶切后的目的 DNA片段。在T4连接酶的作用下连接消化的AvBD9基因的PCR产物和酶切处理的pVAXl质粒，4°C连接过夜，反应体系如下=IOX连接buffer 1 μ L，PCR酶切回收产物7 μ L，pVAXl质粒回收产物lyL，T4 DNA连接酶1 yL。将连接产物转化DH5 α感受态细胞，挑取阳性克隆，将阳性克隆用3ml左右的kana培养基在37°C继续培养，然后抽取质粒。用酶切的方法进行酶切鉴定，转化子菌落PCR鉴定结果见图6，双酶切鉴定结果如图7。送鉴定为阳性的重组质粒到奥科生物技术公司进行序列测定。测序正确的重组质粒即为新构建的pVAXl-AvBD9 质粒。实施例4 OV克隆片段连接T载体
将纯化的PCR产物和pMD18-T VectoKTAKARA公司)进行连接。反应体系为Solution I 5 μ L，纯化的PCR产物4yL，pMD18-T Vector 1 μ L。混勻离心后，于4°C连接过夜。连接产物直接用于转化DH5 α感受态细胞，挑取阳性克隆，将阳性克隆用3ml左右的LA培养基在37°C继续培养，然后抽取质粒。用酶切的方法进行酶切鉴定。PMD18-T-0V菌落PCR鉴定结果见图8。送鉴定为阳性的重组质粒到奥科生物技术公司进行序列测定。测序正确的重组质粒即为pMD18-T-0V。实施例5构建抗菌多肽基因鸡输卵管特异表达载体
将连接到PMD18-T载体上，经测序正确的ov片段和pVAXl-AvBD9载体分别用i/Ζ I和 Nhe I进行双酶切。37°C作用3h，反应体系如下10Xbuffer M 5 μ L, Nhe I 1 μ L, Mlu I 1 μ L，载体20 μ L，ddH20补至50 μ L，同时用CIAP (碱性磷酸酯酶)去磷酸化。酶切后的反应液全部用1. 5%琼脂糖电泳，在紫外灯下切下目的片段的条带，并用胶回收试剂盒回收酶切后的目的DNA片段。在T4连接酶的作用下连接已消化纯化的OV片段和pVAXl-AvBD9载体质粒，4°C接过夜，反应体系如下:10X连接buffer 1 μ L, ov序列7 μ L，pVAXl_AvBD9质粒回收产物1 μ L，T4 DNA连接酶1 μ L。将连接产物转化DH5 α感受态细胞，最后取菌液涂布含有100 μ g/mL kana的LB琼脂培养基上，37°C培养12 1他。平板上挑取单菌落接种3 mL含SOyg/mL kana的LB培养液中，37°C振摇培养1 后，取菌液用引物SEQ ID N0:6 7 进行PCR检测，同时设立空白对照和阳性对照，反应体系如下10XPCR buffer 1.5yL，菌液 1 μ L，dNTPs 0. 5 μ L (2. 5mM)，引物(20 μ mol/ L)各 0· 5 μ L，Taq DNA 聚合酶 0· 25 μ L (2. 5U/uL)，ddH20补至15 μ L。按常规方法扩增ov序列，反应条件为94°C预变性5min ； 94°C变性40s，55°C退火40s，72°C延伸80s，循环30次，最后72°C延伸lOmin。PCR产物用 1. 5%琼脂糖凝胶(含0. 5 μ g/mL溴化乙锭，EB)电泳检测PCR产物，在100V的电压下进行电泳，20min后在紫外灯下观察结果挑取阳性克隆，将阳性克隆用3ml左右的Kana培养基在37°C 220rpm过夜振荡培养，次日用Ε. Ζ. N. A. Plasmid Minipreps Kit提取质粒，按试剂盒说明书进行操作抽取质粒。pVAXl. l-AvBD9菌落PCR鉴定电泳结果见图9。用酶切的方法进行酶切鉴定，结果如图10。送鉴定为阳性的重组质粒到奥科生物技术公司进行序列测定。测序正确的重组质粒即为新构建的pOVl. l-AvBD9质粒。实施例6 重组载体转染Vero和CHO细胞
将前述实施例制备的重组质粒pVAXl-AvBD9、pOVl. l-AvBD9以及pVAXl载体的菌液在 kana培养板上划线培养，在37°C培养箱中过夜，次日挑取单菌落，用3ml左右的kana培养基在37°C 220rpm过夜振荡培养。之后用装有400mL kana培养基的三角瓶在37°C培养箱中过夜扩大培养。次日用天根生物有限公司的大提质粒试剂盒大量提取质粒。检测质粒的浓度，放_20°C保存。待Vero、CHO细胞达到最佳生长状态时，分别接种(0. 5 2) X IO5/ 孔数量的细胞到6孔板中，待细胞达到90、5%汇合度时，将重组质粒pVAXl-AvBD9和 pOVl. I-AvBDQ用脂质体介导分别转染Vero细胞和CHO细胞。用空质粒pVAXl —起分别转染两种细胞作为对照。37°C孵育他，更换为完全培养基继续培养，同时加入雌二醇10_7mol/ L、皮质酮10_6mOl/L和胰岛素40 μ g/L。在培养对、4他后，置于倒置显微镜下观察，并收集细胞上清，_80°C保存，用于检测细胞培养上清液的抑菌作用，用Tricine-SDS PAGE CHO来检测细胞表达产物。之后用RT-PCR以及细胞免疫荧光检测重组载体转染的细胞。1.细胞培养上清液的抑菌作用的检测
将收集到的细胞培养上清液用0. 22 μ m滤膜过滤，每个样品取4mL，冻干成粉末，用剩余未冻干的培养液IOOyL重溶，备用。以革兰氏阴性菌大肠杆菌K12D31 {Escherichia coin,鸡白痢沙门氏菌iSalmonella pullorum)和革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌 {Staphylococcus aureus)为病原指示菌，采用微量稀释方法分析表达产物体外活性 IOOyL的菌液(IX 105CFU/well) +IOOyL蛋白溶液。将上述混合液37 °C培养2h后，取 1 μ L加入到融化了的半固体LB培养基中(5(T60°C)，混勻后倒入已有一层薄LB平板中， 37°C培养过夜。剩余混合液继续培养12h，测定0D600nm。平板培养结果如图11，在大肠杆菌K12D31、鸡白痢沙门氏菌中，pVAXl-AvBD9、pOVl. l-AvBD9的抑菌效果相当，对于金黄色葡萄球菌，pVAXl-AvBD9抑菌效果优于pOVl. l_AvBD9。2. Tricine-SDS PAGE 检测 CHO/Vero 细胞表达产物。吸去细胞培养液，剩余500 μ L，将转染48h的细胞从6孔板中用细胞刮轻轻刮下，4 °C 4000r/min离心15min，吸取上清至剩余50 μ L，重悬细胞，再分别加入5 X SDS loading buffer，煮沸5min，12000rpn离心15min，取上清液，获得总蛋白样品。配制16. 5% Tricine-SDS-PAGE各层凝胶分别加入正极缓冲液(0. 2mol/L Tris-HCl pH8. 9)及负极缓冲液(100mmol/L Tris-HCl, 100mmol/L Tricine，0. 1 % SDS)，取上述样品点样 15 μ L。稳压 40mV电泳。待蛋白进入间隔胶后，可调至100mV，至指示剂离胶底部Icm处停止电泳。小心取出凝胶，先放置在固定液中固定45min，然后用含有考马斯亮蓝R250的染色液染色30min。 换脱色液轻微振荡脱色漂洗，至凝胶背景透明为止，照相分析，实验结果如图12，在Marker 5kD附近有一条较淡的泳带，与预期目的蛋白分子量相符(AvBD9: 5. 24kD)。pVAXl_AvBD9 转染的样品条带较为明显。3. RT-PCR检测重组载体转染的细胞
按Trizol Reagent RNA提取试剂盒的使用说明书，提取转染细胞中的总RNA。提取的细胞总RNA用RNase-Free DNase 37°C孵育30min后，直接用于反转录-聚合酶链反应 (RT-PCR)或按一定比例加入RNase Inhibitor后_80°C保存备用。按RQl RNase-Free DNase 说明处理RNA，反应采用RT-PCR方法扩增目的基因，反应体系为2X0ne Step RNA PCR buffer 25 μ ，引物 SEQ ID NO: IfPSEQ ID N0:5 各 1 PL，RNA 5 μ , 1 step Enzymes Mix 2 μ , RNase Free dH20补至50μ 。将上述反应体系混勻、离心，在PCR Express Gradient PCR仪上执行如下反应程序50°C 30min，94°C预变性anin，一个循环；94°C 30s，55°C退火 30s, 72°C延伸30s，30个循环。扩增产物用1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测，对于CHO细胞RT-PCR 产物实验结果如图13。pVAXl的启动子在CHO和Vero细胞中都有启动表达，但是已经替换成鸡输卵管特异表达的启动子只在CHO中有启动表达。4.细胞免疫荧光检测重组载体转染的细胞。先制备细胞爬片，在转染4 后，取出细胞爬片，用PBS轻微漂洗后，置于37°C PBS 中l(T30min，透析残留培养液，再用PBS洗3次，每次5min。用4%多聚甲醛固定30min，再用 PBS洗3次，每次lOmin。用组织细胞打孔液透化2 5min，PBS洗3次，每次lOmin。加封闭液(5%BSA)，室温封闭60min。吸尽封闭液，立即加入稀释好的一抗Histidine Tag(l:50), 4°C孵育过夜。回收一抗，PBS洗3次，每次5min。荧光标记二抗(1 100)，室温湿盒避光孵育lh;PBS洗3次，每次5min。封裱剂封片，镜检，拍照。CHO细胞免疫荧光检测结果如图 14，染色结果显示，pVAXl-AvBD9、p0Vl. l_AvBD9均能在CHO细胞中表达，表达产物主要是在胞浆。
权利要求
1.一种鸡防御素9基因表达载体，其特征在于是以真核表达载体PVAXl为出发载体， 用鸡卵清蛋白编码序列取代载体PVAXl上的CMV启动子，在其下游插入鸡防御素9基因的 cDNA序列，构建成重组真核表达载体。
2.权利要求1所述鸡防御素9基因表达载体的制备方法，其特征在于步骤如下(1)扩增鸡防御素9基因；(2)将步骤(1)中鸡防御素9基因连接到载体pVAXl上；(3)扩增鸡卵清蛋白基因；(4)将步骤(3)所得鸡卵清蛋白基因连接到载体pMDIS-T上；(5)将步骤(2)所得产物与步骤(4)所得产物经酶切后重组，构建含有鸡防御素9基因、 鸡卵清蛋白基因的PVAXl重组载体，即为鸡防御素9基因表达载体。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤(1)所述扩增鸡防御素9基因所用引物序列如SEQ ID NO:广5所示。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于扩增鸡防御素9基因具体步骤为 用引物序列如SEQ ID NO:广4进行第一轮PCR，PCR反应体系为20 μ mol/L的引物各1 μ L，10mmol/L 的 dNTPs 1 μ L, IOXbuffer 5 μ L, 2. 5U/ μ L ^ rTaq DNA 聚合酶 lyL，加 ddH20 至 50 μ L ；以第一轮PCR产物为模板，序列SEQ ID Ν0:1和SEQ ID Ν0:5为引物，进行第二轮 PCR，PCR 反应体系为模板 IPL，20 μ mol/L 的引物各 2 μ L，l(toimol/L 的 dNTPs 2 μ L， 10 X buffer 5 μ L，2. 5U/ μ L 的 rTaq DNA 聚合酶 0. 5 μ L,加 ddH20 至 50 μ L，PCR 反应程序 94°C预变性 anin，l 个循环；94°C 30s, 52°C 30s, 72°C 40s, 30 个循环；72°C后延伸 5min，得到鸡防御素9基因。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤(3)所述扩增鸡卵清蛋白基因所用引物序列如SEQ ID N0:6 7所示。
6.权利要求1所述鸡防御素9基因表达载体在制备治疗种鸡输卵管疾病药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述种鸡输卵管疾病为大肠杆菌感染疾病、鸡白痢沙门氏菌感染疾病或金黄色葡萄球菌感染疾病。
全文摘要
本发明公开了一种鸡防御素9基因表达载体及其制备方法和在防治种鸡输卵管疾病中的应用，属于基因工程技术领域。所述表达载体是以真核载体pVAX1为出发载体，用鸡卵清蛋白编码序列取代pVAX1上的CMV启动子，在其下游插入鸡防御素9基因构建而成。该表达载体的制备方法是将鸡防御素9基因连接到载体pVAX1上，鸡卵清蛋白基因连接到载体pMD18-T上，连接后的载体同时进行双酶切后重组，构建含有鸡卵清蛋白基因和鸡防御素9基因的pVAX1重组载体，即为鸡防御素9基因表达载体。本发明的表达载体可用于制备治疗种鸡输卵管疾病药物，治疗效果显著，安全无毒，具有广泛的应用前景。
文档编号C12N15/66GK102260701SQ20111014842
公开日2011年11月30日 申请日期2011年6月3日 优先权日2011年6月3日
发明者林崇韫, 毕英佐, 谢青梅, 赵亚华, 陈 峰, 马静云, 高向阳 申请人:华南农业大学